王蘇音，金 清

(延邊大學(xué),吉林 延吉 133002)

覆盆子是薔薇科懸鉤子屬木本植物,主要含有菇類、黃酮、氨基酸、維生素E等成分。近年來研究表明覆盆子具有抗腫瘤、抗衰老、抗癌、抗淋巴細(xì)胞增殖等多種生理功能[1]。覆盆子中黃酮類化合物具有清除自由基、抗血小板凝集的作用，并能顯著提高紅細(xì)胞超氧化物歧化酶活性[2]；覆盆子中水楊酸具有促進尿酸排泄，緩解痛風(fēng)的療效[1]；覆盆子中鞣化酸抑制癌細(xì)胞的生長[3]。

多酚類化合物是是高等植物代謝過程中的次級代謝產(chǎn)物，具有抗腫瘤、抗氧化、抑菌、抗動脈硬化、抗痛風(fēng)及心腦血管疾病等生理作用[4]。目前國內(nèi)外研究主要集中在覆盆子黃酮類成分鑒定以及提高免疫力、改善心絞痛等方面，對覆盆子多酚類物質(zhì)的提取工藝及體外抗氧化活性研究鮮見報道。因此，本研究以乙醇熱回流法對覆盆子多酚類化合物進行提取，采用正交實驗優(yōu)化覆盆子多酚的提取工藝，并考察其體外抗氧化能力，評價覆盆子多酚在抗氧化方面的作用，為覆盆子多酚在功能食品、藥品中的應(yīng)用及產(chǎn)品開發(fā)提供參考。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

覆盆子采購于吉林大藥房，鑒定為薔薇科懸鉤子屬木本植物的干燥果實，挑選飽滿干凈無蟲蛀的干燥果實備用。

沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品(貨號CAS：149-91-7) 上海哈靈生物科技有限公司；其余試劑均為分析純。

Sorvall Evolotion RC型高速冷凍離心機 美國Thermo公司；Cary 300紫外可見分光光度計 美國Varian公司；HZQ-Q型電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海一恒實驗設(shè)備有限公司；722分光光度計 上海光譜儀器有限公司；XW-80A渦旋混合器 上海精科實業(yè)有限公司。

1.2 覆盆子多酚的提取

1.2.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

分別精確吸取沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品儲備液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL定容至10 mL，稀釋成不同質(zhì)量濃度的沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)用液。按照福林-酚法[5]，取1 mL標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)用液，依次加入5 mL蒸餾水和1 mL Folin-Denis試劑，充分混勻，靜置5～8 min后，再加入7.5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的碳酸鈉溶液3 mL，震蕩搖勻后靜置2 h。在765 nm波長處測定各濃度標(biāo)準(zhǔn)品光密度值。以沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度(mg/mL)為橫坐標(biāo)(X)、光密度值為縱坐標(biāo)(Y)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性回歸方程為Y=0.083+4.231X，R2=0.999 7。

1.2.2覆盆子多酚含量的測定

精確稱取向覆盆子多酚提取物10.00 mg，定容至25 mL。準(zhǔn)確量取10 mL，分別定容25 mL，依次加入5 mL蒸餾水和1 mL Folin-Denis試劑，充分混勻，靜置5～8 min后，再加入7.5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的碳酸鈉溶液3 mL，震蕩搖勻后靜置2 h。在765 nm波長處測定各濃度標(biāo)準(zhǔn)品光密度值。根據(jù)回歸方程計算覆盆子多酚提取物中覆盆子多酚質(zhì)量濃度(以沒食子酸計)。

1.2.3單因素實驗設(shè)計

分別采用40%、50%、60%、70%(體積分?jǐn)?shù))的乙醇溶液，提取溫度85 ℃，料液比1∶20，提取2次，每次提取1 h，研究乙醇體積分?jǐn)?shù)對覆盆子多酚提取得率的影響。采用最佳體積分?jǐn)?shù)乙醇，提取溫度分別為50、60、70、80 ℃，料液比1∶20，提取2次，每次提取1 h，研究提取溫度對覆盆子多酚提取得率的影響。采用最佳體積分?jǐn)?shù)乙醇，最佳提取溫度，料液比分別為1∶10、1∶20、1∶30、1∶40，提取2次，每次提取1 h，研究液料比對覆盆子多酚提取得率的影響。采用最佳體積分?jǐn)?shù)乙醇，最佳提取溫度，最佳料液比，提取時間分別為1、2、3、4 h，提取2次，研究提取時間對覆盆子多酚提取得率的影響。采用最佳體積分?jǐn)?shù)乙醇，最佳提取溫度，最佳料液比，提取次數(shù)分別為1、2、3、4，每次提取2 h，研究提取次數(shù)對覆盆子多酚提取得率的影響。

1.2.4正交實驗設(shè)計

根據(jù)單因素實驗結(jié)果，以覆盆子多酚提取得率為評價指標(biāo)，選取對覆盆子多酚影響效果最明顯的因素：乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取溫度、料液比、提取時間，采用四水平三因素，以覆盆子干果粉末為原料進行正交實驗，每個實驗重復(fù)3次，確定覆盆子多酚提取的最佳工藝條件。因素水平表見表1。

表 1 正交實驗因素水平

1.3 覆盆子多酚的體外抗氧化作用

1.3.1對DPPH自由基清除能力的測定

取樣品溶液2.0 mL加入濃度為0.1 mmol/L DPPH無水乙醇溶液2.0 mL，充分混勻，于室溫避光靜置反應(yīng)30 min，4000 r/min離心(4 ℃)10 min，取上清液檢測517 nm處吸光度值。選用維生素C溶液為陽性對照，含DPPH的無水乙醇溶液為空白對照。覆計算盆子多酚對DPPH自由基的清除率[6]。

1.3.2對ABTS自由基清除能力測定

濃度為7 mmol/L的ABTS溶液和濃度為2.45 mmol/L的過硫酸鉀溶液按體積比1∶1充分混勻后，室溫避光條件下反應(yīng)16 h得到ABTS自由基母液。使用時ABTS+·溶液用80%乙醇稀釋，并調(diào)整其在734 nm處的吸光度值為0.700±0.030。取樣品溶液1 mL與5 mL ABTS+·溶液充分混勻，室溫下靜置反應(yīng)6 min，4000 r/min離心(4 ℃)10 min，取上清液在734 nm處測定吸光度值。選用維生素C溶液為陽性對照，去離子水代替樣品作為對照，80%乙醇溶液作為空白對照。計算覆盆子多酚對ABTS的清除率[7]。

1.3.3對超氧化物陰離子清除能力測定

取0.05 mol/L Tirs-HCl緩沖液(pH=8.2)5 mL，置于25 ℃水浴預(yù)熱20 min，加入樣品溶液2 mL，并添加25 mmol/L鄰苯三酚溶液0.4 mL，置于25 ℃水浴反應(yīng)5 min后，加入0.5 mL HCl終止反應(yīng)，6000 r/min離心(4 ℃)10 min，取上清液在320 nm處測定吸光度。維生素C溶液為陽性對照，以0.1 mol/L HCl代替鄰苯三酚溶液作對照，以0.05 mol/L Tirs-HCl緩沖液作為空白對照。計算覆盆子多酚對超氧化物陰離子的清除率。

1.3.4鐵離子螯合能力測定

取樣品溶液2 mL與濃度為2 mmol/L的FeCl2溶液0.10 mL充分混勻，室溫靜置反應(yīng)5 min后，分別加入5 mmol/L的菲咯嗪0.4 mL及蒸餾水5.50 mL，充分振蕩混勻，室溫下靜置反應(yīng)10 min，6000 r/min離心(4 ℃)10min。取上清液于562 nm處測定吸光度值。EDTA作為陽性對照。計算覆盆子多酚對鐵離子的螯合能力。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

正交實驗所得結(jié)果由SPSS 22.0軟件分析，根據(jù)覆盆子多酚提取率確定因素水平的優(yōu)劣，選出最佳提取工藝。體外抗氧化實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0軟件進行處理，實驗結(jié)果均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用單因素方差分析，不同組間的比較采用方差分析比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實驗

2.1.1乙醇體積分?jǐn)?shù)對多酚提取得率的影響

多酚類成分極性較大，溶劑提取法常采用乙醇回流提取法，易于多酚類成分的溶出。結(jié)果隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，覆盆子多酚提取得率呈現(xiàn)增加后減少的趨勢。當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)由40%增加到60%，覆盆子多酚提取得率明顯增加，乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%時多酚提取得率基本趨于穩(wěn)定，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%，覆盆子多酚提取得率達(dá)到最大值26.73 mg/g，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，多酚提取得率降低至27.21 mg/g。在實際操作中考慮總多酚的充分溶出和試劑成本，選擇體積分?jǐn)?shù)為50%的乙醇進行提取。

2.1.2提取溫度對多酚提取得率的影響

多酚類成分結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定受熱，選擇50、60、70、80 ℃進行提取。結(jié)果隨著溫度的升高，覆盆子多酚提取得率幾乎呈線性增加。當(dāng)溫度升高到70 ℃，覆盆子多酚提取得率達(dá)到最大值32.53 mg/g，當(dāng)溫度升高到80 ℃，多酚得率顯著下降，但仍然高于50 ℃時的多酚得率。提取溫度升高可以促進分子熱運動，提高覆盆子多酚的溶出率，但溫度過高會導(dǎo)致多酚類成分的氧化和分解，因此提取溫度選定為70 ℃。

2.1.3料液比對多酚提取得率的影響

結(jié)果表明隨50%(體積分?jǐn)?shù))乙醇溶劑量的增加，覆盆子多酚提取得率明顯增大，在料液比1∶20時覆盆子多酚提取得率基本趨于穩(wěn)定，隨著料液比的增加，多酚提取得率增加較為緩慢，增加的乙醇溶液并沒有明顯的促進多酚的溶出率，對覆盆子多酚提取得率增加量較小。在實際操作中考慮多酚的充分溶出，同時也為避免溶劑的浪費，從提取得率、溶劑用量和生產(chǎn)成本等角度綜合考慮，固液比選擇為1∶20(g/mL)時提取效果好。

2.1.4提取時間對多酚提取得率的影響

結(jié)果表明隨著提取時間的增加，覆盆子多酚提取得率呈現(xiàn)增加后降低的變化趨勢。在1～3 h隨著提取時間的延長，覆盆子多酚提取得率逐漸增加。當(dāng)提取時間為2 h時，多酚提取得率為40.53 mg/g，提取時間繼續(xù)延長，覆盆子多酚提取得率緩慢下降?？紤]到浸提時間越長，多酚類成分易因高溫提取條件而發(fā)生氧化分解，因此提取時間選擇2 h。

2.1.5提取次數(shù)對多酚提取得率的影響

結(jié)果表明隨著提取次數(shù)的增加，覆盆子多酚提取得率逐漸增加。當(dāng)提取2 次后，多酚提取得率隨提取次數(shù)的增加上升幅度緩慢，這可能是由于隨著提取次數(shù)的增加覆盆子中多酚已基本溶出?？紤]提取次數(shù)過多會給后續(xù)的濾液濃縮帶來困難，從簡化實驗操作和節(jié)省時間考慮，確定提取次數(shù)選擇2次。

2.2 正交試驗結(jié)果

由表2可知，4個因素對覆盆子多酚提取得率的影響順序為B>A>C>D，即提取溫度>乙醇體積分?jǐn)?shù)>料液比>提取次數(shù)，其中提取溫度和乙醇體積分?jǐn)?shù)因素對向覆盆子多酚提取得率具有顯著影響。根據(jù)正交實驗結(jié)果分析，得出乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%，提取溫度70 ℃，料液比為1∶20，提取時間2 h。3次重復(fù)實驗，覆盆子多酚提取得率為42.845 mg/g。

表 2 正交試驗結(jié)果

2.3 體外抗氧化實驗

2.3.1DPPH自由基清除作用

結(jié)果表明，不同濃度的覆盆子多酚表現(xiàn)出不同程度的抗氧化活性，隨著質(zhì)量濃度的增加，覆盆子多酚對DPPH自由基的清除能力逐漸增加。其中當(dāng)覆盆子多酚濃度達(dá)到2 g/L時，對DPPH自由基的清除達(dá)到74.34%，濃度增加到4 g/L自由基的清除率能達(dá)到91%以上，但覆盆子多酚類化合物對DPPH自由基的清除能力略弱于維生素C。結(jié)果表明覆盆子多酚類化合物對DPPH自由基有良好的清除能力。

2.3.2ABTS自由基清除作用

隨著質(zhì)量濃度的增加，覆盆子多酚對ABTS自由基的清除率呈線性增加。當(dāng)覆盆子多酚質(zhì)量濃度為2 g/L時，對ABTS自由基的清除達(dá)到61.02%，濃度增加到4 g/L自由基的清除率能達(dá)到87%以上，但覆盆子多酚類化合物對ABTS自由基的清除能力略弱于維生素C。結(jié)果表明覆盆子多酚類化合物對ABTS自由基有良好的清除能力。

2.3.3超氧化物陰離子清除作用

結(jié)果表明覆盆子多酚對超氧化物陰離子清除能力不及陽性對照維生素C，對超氧化物陰離子清除率隨著覆盆子多酚質(zhì)量濃度的增加緩慢增強，當(dāng)質(zhì)量濃度增加到4 g/L，對超氧化物陰離子清除率最高達(dá)到43.80%。結(jié)果表明覆盆子多酚類化合物對超氧化物陰離子有一定的清除能力。

2.3.4鐵離子螯合能力

隨著濃度的增加，覆盆子多酚對鐵離子螯合能力幾乎呈線性增加。當(dāng)覆盆子多酚濃度為2 g/L時，對鐵離子螯合能力達(dá)到56.37%，濃度增加到4 g/L對鐵離子螯合能力能達(dá)到88%以上，但覆盆子多酚類化合物對鐵離子螯合能力略小于維生素C。表明覆盆子多酚類化合物對鐵離子有良好的螯合能力。

3 結(jié) 論

本研究采用正交實驗考察提取條件對覆盆子多酚提取得率的影響，影響提取得率的因素次序為：提取溫度>乙醇體積分?jǐn)?shù)>料液比>提取次數(shù)，確定了最佳提取工藝參數(shù)為：乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%，提取溫度70 ℃，料液比為1∶20，提取時間2 h，覆盆子多酚提取得率為42.845 mg/g。體外抗氧化能力測試結(jié)果表明，覆盆子多酚質(zhì)量濃度為4 g/L時，對DPPH自由基的清除率為91.34%，對ABTS自由基的清除率為87.26%，對超氧化物陰離子清除率為43.80%，對鐵離子螯合能力能為88.12%，說明覆盆子多酚具有很強的抗氧化活性，為深入分析其活性以及進一步開發(fā)覆盆子功能性食品提供理論依據(jù)。

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