卞曉翠，楊振麗，左春霞，周芳穎，劉玉琴*

(中國醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所 北京協(xié)和醫(yī)學院基礎學院 1.病理學系；2.細胞資源中心， 北京 100005)

在生命科學和醫(yī)學領域，細胞系是進行分子水平、細胞水平及動物實驗研究重要實驗材料。細胞系的交叉污染無疑會造成實驗結果不可重復，甚至導致結論的錯誤。2010年公布了360種被交叉污染或錯誤認定的人源細胞系，種間交叉污染占9%(33/360)[1]。細胞種屬鑒定是排除種間交叉污染的重要內容，常見的檢測方法有染色體分析、同工酶分析、DNA條碼(DNA barcode)測序以及PCR法。早在2009年，中國醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所細胞資源中心(簡稱北京協(xié)和細胞資源中心)針對常見的哺乳動物細胞系，創(chuàng)建了PCR檢測細胞來源種屬的方法[2]。該方法操作簡單， 結果穩(wěn)定， 自創(chuàng)建來已經(jīng)累計檢測細胞系1 000余株次。同時，本單位作為國家實驗細胞資源共享服務平臺的依托單位，也將該方法推廣到其他細胞資源保藏中心，包括武漢大學中國典型培養(yǎng)物保藏中心和中國食品藥品檢定研究院等單位，還為生物醫(yī)藥企業(yè)的細胞質控提供了服務。對于人源細胞交叉污染的情況，本中心已有報道，本文主要研究非人源細胞的情況。

1 材料與方法

1.1 樣品收集

為160例非人源細胞，均由本中心于2008—2016年收集，中心入庫質控或其他單位和實驗室委托質控的樣品。部分細胞目錄見表1。所有細胞在培養(yǎng)和傳代過程中收集細胞團，-20 ℃保藏。

1.2 基因組DNA的提取

細胞基因組DNA的提取按照試劑盒(PureLink?Genomic DNA Mini Kit, K1820- 02, Invitrogen公司)說明書進行，通過Nanodrop2000檢測提取DNA的濃度和質量。

1.3 種屬鑒定

采用先前建立的PCR法進行種屬鑒定，其敏感性、特異性及具體方法已報道。簡言之，針對人、小鼠、大鼠、中國倉鼠、敘利亞倉鼠、猴、牛、狗、豬及兔等10個種屬設計特異性的引物；將樣本基因組DNA分別用這10種引物進行擴增，然后通過瓊脂糖電泳檢測擴增產(chǎn)物，觀察是否有特異性條帶出現(xiàn)，從而判斷樣品的來源種屬。PCR反應同時設立陰性對照和陽性對照，以去離子水作為陰性對照模板，分別以細胞系RD(人橫紋肌肉瘤細胞)、Hepa 1- 6(小鼠肝癌細胞)、PC- 12(大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤細胞)、CHO(中國倉鼠卵巢細胞)、 MDBK (牛腎細胞)、MDCK(狗腎細胞)、VERO(非洲綠猴腎細胞)、LLC-PK1(豬腎細胞)、BHK- 21(敘利亞倉鼠腎細胞)和CCC-SMC- 1(兔主動脈平滑肌細胞)作為相應種屬的陽性對照模板。PCR程序為: 95 ℃ 5 min,95 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，共26個循環(huán); 72 ℃ 10 min。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳，觀察拍照。

1.4 染色體分析

對本中心收集的PCR法鑒定種屬有誤的細胞，重新復蘇，通過染色體分析確定細胞的來源種屬。具體做法為：待細胞培養(yǎng)至對數(shù)增殖期，加入終濃度為0.01 mg/L的秋水仙素，37 ℃孵育2 h；去除含秋水仙素的培養(yǎng)液，用0.25%胰蛋白酶溶液消化細胞，使細胞變圓，脫離培養(yǎng)瓶壁，加入含血清的培養(yǎng)液終止消化；1 000 r/min離心、收集細胞；棄上清，用5～10 mL的0.075 mol/L的氯化鉀溶液重懸細胞團，37 ℃作用10～20 min；離心，棄上清，加入2～5 mL新鮮配制的固定液(甲醇∶冰醋酸3∶1混合)，混勻，室溫下固定5～10 min；重復固定細胞2～3次；離心，收集細胞，用少量新鮮固定液重懸；用吸管滴加懸液到干凈的載玻片上，使細胞懸液在載玻片上鋪展開來，室溫下自然干燥；用Giemsa染液染載玻片10～15 min；流水沖洗載玻片，空氣干燥。油鏡下觀察中期染色體并拍照和計數(shù)。

表1 研究中使用的細胞系Table 1 List of the cell lines tested

2 結果

2.1 160例非人源細胞系概況

收集到的160例非人源細胞，涵蓋9個種屬，包括小鼠源細胞97種、大鼠源細胞27種、中國倉鼠細胞4種、敘利亞倉鼠細胞3種、猴源細胞10種、牛源細胞7種、兔源細胞5種、狗源細胞2種及豬源細胞5種(圖1)。

圖1 160例非人源細胞種屬公布Fig 1 Overview of the 160 non-human cell lines tested

2.2 非人源細胞系種間交叉污染的情況

在這160例非人源細胞中，發(fā)現(xiàn)154株非人源細胞經(jīng)種屬鑒定與預期一致，排除種間的交叉污染，部分細胞種屬鑒定的結果(圖2)。另外，有6種細胞存在種間交叉污染的情況，發(fā)生率為3.75%。這6種細胞包括H9C2(2- 1)-Luc2-TdT(熒光素酶-紅色熒光蛋白標記的大鼠胚胎心肌細胞)、RGC- 5(大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞)、Marc- 145(猴腎細胞)、AtT20(小鼠垂體瘤細胞)、ST(豬睪丸細胞)和IPEC-J2B(豬小腸上皮細胞)(表1)。H9C2(2- 1)-Luc2-TdT來源于大鼠胚胎心肌細胞H9C2(2- 1)，但是不同于母系細胞單一的成肌細胞樣，該細胞在鏡下顯示出兩種明顯不同的形態(tài)——成肌細胞樣和上皮樣(圖2)。通過PCR種屬鑒定，發(fā)現(xiàn)該細胞是大鼠細胞和人源細胞的混合培養(yǎng)物(圖2)。后經(jīng)STR檢測，發(fā)現(xiàn)混入的人源細胞為SV40T轉化的人胚腎細胞293T。在檢測發(fā)現(xiàn)的6株種內交叉污染的動物細胞中，有3株是來自于同一個獸醫(yī)學實驗室，包括Marc-145(猴腎細胞系)、IPEC-J2B(豬小腸上皮細胞)和ST(豬睪丸細胞)，這3種細胞經(jīng)鑒定分別為敘利亞倉鼠源細胞、人源細胞和猴源細胞(圖2)。其中IPEC-J2B后經(jīng)STR鑒定發(fā)現(xiàn)實為CW- 2細胞，一種人結腸癌細胞系。另外，小鼠垂體瘤細胞AtT20被鑒定為大鼠源細胞，大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞RGC- 5經(jīng)鑒定為小鼠源細胞(表2)。

表2 種間交叉污染的非人源細胞系

2.3 染色體分析結果

在6例出現(xiàn)種間交叉污染的細胞中，僅小鼠垂體瘤細胞AtT20為本中心保藏細胞，其余5例均為其他實驗室送檢細胞，送檢樣品為-20 ℃凍存的細胞團，故無法進行進一步的染色體分析。為了確認本中心原來保藏的AtT20的種屬，制備了該細胞的染色體鋪片。經(jīng)計數(shù)，發(fā)現(xiàn)該細胞的染色體分布在65～71條，染色體形態(tài)不符合小鼠端著絲粒染色體的特征，為大鼠來源(圖4)。

3 討論

細胞系交叉污染是指一種細胞被另外一種不相關的細胞污染，20世紀50年代首次報道。但是，由于重視程度不夠，近些年細胞系交叉污染的現(xiàn)象仍然非常嚴重[3- 5]。細胞系交叉污染主要是操作者的問題。不同細胞共用培養(yǎng)基、同時操作多種細胞、錯誤標記或者標記不清以及飼養(yǎng)層細胞或條件性培養(yǎng)基的使用都可能會導致細胞系的交叉污染。有些交叉污染可能出現(xiàn)的比較早，即在細胞系建立的過程就出現(xiàn)了，比如人臍靜脈內皮細胞ECV304，其建系實驗室保存的細胞就已經(jīng)被人膀胱癌細胞T24所污染[6]。有的交叉污染可能局限在某些實驗室的， 建系的實驗室或者大的保藏機構仍能找到的正確的細胞。本研究中發(fā)現(xiàn)的6種錯誤細胞均是這種情況。

T.test sample; P.cell lines of corresponding species used as positive control separately; P1.RD (human rhabdomyosarcoma cell line); P2.Hepa 1-6 (mouse hepatocarcinoma cell line); P3.PC- 12 (rat phaeochromocytoma cell line); P4.CHO (Chinese hamster ovary cells); P5.MDBK(bovine kidney cell line); P6.MDCK(dog kidney cell line); P7.VERO(African green monkey kidney cell line); P8.LLC-PK1(pig kidney cell line); P9.BHK- 21(Syrian hamster kidney cell line); P10.CCC-SMC- 1(rabbit aortic smooth muscle cells); M.DNA marker

圖210個種屬細胞的PCR檢測電泳圖
Fig2GelelectrophoresisofthePCRproductsfrom10species

但是，一份針對483名細胞使用人員的調查結果顯示，35%的人使用細胞時是從其他實驗室獲得的，而非正規(guī)的細胞保藏機構，且受試者中近一半不會對拿到的細胞進行身份認證[7]。這就使得那些局限在某些實驗室的錯誤細胞得到了推廣。

A.two distinct morphology was found in the microscopic view of H9C2(2- 1)-Luc2-TdT; B.the microscopic view of normal H9C2(2- 1); C.by PCR-based species identification, H9C2(2- 1)-Luc2-TdT was cross-contaminated with human cells; D,E.by PCR-based species identification, Mac- 145 and IPEC-J2B were identified as cells of Syrian hamster and human origin, respectively

圖3種間交叉污染的非人源細胞系

Fig3Interspeciescross-contaminationofnon-humancells

Rat chromosomes were found in the metaphase spreads of AtT20(mouse pituitary cells)圖4 AtT20細胞中期染色體形態(tài)Fig 4 Chromosome morphology in the metaphase spreads of AtT20(×1 000)

短串聯(lián)重復序列(short tandem repeat，STR)是人源細胞身份認證的金標準[8]。國家實驗細胞資源共享服務平臺負責人同步撰文，告知研究用細胞的質量要求[9]。本中心通過STR對進行細胞身份鑒定時發(fā)現(xiàn)聯(lián)合種屬鑒定可以提高細胞交叉污染的檢出率。國內常用的482例人腫瘤細胞中，20.5%(99/482)為錯誤細胞系，其中14.5%為種內交叉污染，4.4%為種間交叉污染，另有1.7%的細胞實為兩種細胞混合培養(yǎng)物[10]。非人源細胞交叉污染的比例低于人源細胞的污染比例。國際細胞系認證委員會(International Cell Line Authentication Committee，ICLAC)最新公布的數(shù)據(jù)中，有488例實驗細胞被交叉污染或錯誤認定，其中非人源細胞占4.9%(24/488)(http://iclac.org/databases/cross-contaminations/)。低污染比例與非人源細胞的使用較少有關。

通過種屬鑒定和人源細胞的STR分析，細胞的身份可以得到初步的驗證。但是仍需要開發(fā)更多的技術來完善，比如小鼠、大鼠等常見動物細胞的STR分析，用于排除種內的交叉污染[11]。另外，通過高通量RNA測序的方法，發(fā)現(xiàn)多種鼻咽癌細胞如CNE- 1和CNE- 2等是被Hela細胞與另外一種未知的細胞融合而產(chǎn)生的錯誤細胞[12]。細胞身份認證仍有大量的工作需要完成。但是，對于實驗細胞的使用者來說，從正規(guī)途徑獲取細胞和嚴格執(zhí)行無菌操作是避免細胞交叉污染的有效方法。

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