非連續(xù)密度梯度法對(duì)弱精子癥患者精子參數(shù)及DNA完整性的影響*

鄧順美 龐 韜 李月華 馬春杰 王奇玲 劉 晃 秦衛(wèi)兵 劉曉華 張欣宗 唐運(yùn)革

國(guó)家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)男性生殖與遺傳重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、廣東省計(jì)劃生育科學(xué)技術(shù)研究所（廣州 510600）

對(duì)于部分弱精子癥患者而言, 僅僅依靠藥物治療是無(wú)法獲得自然妊娠的，必須依靠人類(lèi)輔助生殖技術(shù)才能使他們達(dá)到生育后代的目的。然而無(wú)論是采用人工授精，還是體外受精與胚胎移植技術(shù)（IVF-ET）都需要對(duì)精子進(jìn)行制備優(yōu)選, 篩選出活力更強(qiáng)、精子形態(tài)更好的精子來(lái)實(shí)施人類(lèi)輔助生殖技術(shù)。目前，對(duì)于弱精子癥患者的精液通常采用非連續(xù)密度梯度法來(lái)優(yōu)選精子，本方法優(yōu)選出的精子通常精子活力和精子形態(tài)都會(huì)得到改善，但對(duì)精子功能相關(guān)參數(shù)的影響尚不明確。本實(shí)驗(yàn)試圖采用非連續(xù)密度梯度法對(duì)弱精子癥患者精液進(jìn)行精子制備優(yōu)選，分析精子制備前后的精液質(zhì)量參數(shù)和精子DNA完整性，評(píng)估非連續(xù)密度梯度法在改善精子質(zhì)量參數(shù)和精子DNA完整性方面的有效性。

資料與方法

一、樣本來(lái)源

26例弱精子癥精液標(biāo)本來(lái)自于2016年3月至2016年6月在廣東省計(jì)劃生育專(zhuān)科醫(yī)院男科門(mén)診就診的男性不育癥患者，年齡22～35歲，平均年齡（32±6）歲。弱精子癥患者準(zhǔn)入標(biāo)準(zhǔn)為精液標(biāo)本量≥1.5mL，精子濃度≥15×106/mL，精子總活力[前向運(yùn)動(dòng)精子（PR）+非前向運(yùn)動(dòng)精子（NP）]＜40%，前向運(yùn)動(dòng)精子（PR）百分率＜32%，正常形態(tài)精子百分率≥4%，所有樣本均排除支原體、衣原體感染， 附睪或睪丸炎，系統(tǒng)性疾病病史，且患者常規(guī)體格檢查正常。準(zhǔn)入患者禁欲2～7d，采用手淫法收集精液于干燥無(wú)菌取精杯, 置于37℃恒溫水浴箱中待液化。

二、儀器與試劑

SCA精子質(zhì)量分析系統(tǒng)，精子計(jì)數(shù)玻片均為西班牙Microptic s.l.公司產(chǎn)品。改良巴氏染色液來(lái)自于貝索生物技術(shù)有限公司，精子洗液、40%和80%梯度離心液購(gòu)置于Gynotec公司。精子核DNA熒光染色試劑盒來(lái)自于深圳市華康公司。80i熒光顯微鏡為日本尼康公司產(chǎn)品。

三、精液常規(guī)及精子形態(tài)分析

使用一次性精子計(jì)數(shù)玻片（goldcyto），采用SCA精子質(zhì)量分析系統(tǒng)對(duì)精子制備前后精子濃度、精子總活力、PR百分率進(jìn)行分析。對(duì)于精子濃度大于50×106/mL的標(biāo)本先進(jìn)行稀釋, 然后再做精液常規(guī)分析。儀器參數(shù)設(shè)置與操作方法嚴(yán)格按照生產(chǎn)廠(chǎng)家制定的操作規(guī)程實(shí)施。采用WHO主編的《人類(lèi)精液檢查與處理實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》[1]推薦的改良巴氏染色法分析精子形態(tài)。

四、精子DNA完整率檢測(cè)

采用精子核DNA熒光染色試劑盒進(jìn)行精子DNA完整性檢測(cè)分析。雙鏈DNA結(jié)合吖啶橙熒光染料后精子在熒光顯微鏡下呈現(xiàn)綠色熒光，單鏈DNA結(jié)合熒光染料后精子顯示紅色熒光。每份精液標(biāo)本染色后，在熒光顯微鏡下記數(shù)至少200個(gè)精子，計(jì)算綠色熒光精子所占的百分率，該百分率即為精子DNA完整率。

五、非連續(xù)密度梯度法

采用WHO主編的《人類(lèi)精液檢查與處理實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》推薦的非連續(xù)密度梯度離心法對(duì)精液標(biāo)本進(jìn)行精子制備[1]。非連續(xù)密度梯度離心制備后的精子沉淀物用培養(yǎng)液統(tǒng)一調(diào)至0.5mL。

六、制備后檢測(cè)

對(duì)制備后的精子標(biāo)本按照上述三和四所述方法進(jìn)行精液常規(guī)、精子形態(tài)分析和精子DNA完整性檢測(cè)。

七、統(tǒng)計(jì)分析方法

采用SPSS軟件對(duì)精子制備前后各精液參數(shù)進(jìn)行配對(duì)t檢驗(yàn)。

結(jié) 果

26例弱精子癥患者精液標(biāo)本通過(guò)非連續(xù)密度梯度離心法進(jìn)行精子制備，制備前精液體積為（4.22±1.54）mL，制備后精子體積統(tǒng)一調(diào)至0.5mL。其他精液參數(shù)制備前后的檢測(cè)數(shù)據(jù)見(jiàn)表1。統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示精子制備后精子濃度顯著下降，精子總活力、PR百分率，正常形態(tài)精子百分率，以及精子DNA完整率較制備前顯著提高，差異均具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表1 26例弱精子癥患者精子制備前后各精液參數(shù)檢測(cè)結(jié)果比較（±s）

表1 26例弱精子癥患者精子制備前后各精液參數(shù)檢測(cè)結(jié)果比較（±s）

精液參數(shù) 制備前 制備后 t值 P值精子濃度ρB(106?mL-1) 51.9±44.65 18.91±24.61 4.57 0.000精子總活力(%) 22.5±6.34 31.77±21.15 -2.46 0.021 PR(%) 17.3±5.5 26.2±20.00 -2.44 0.022正常形態(tài)精子(%) 6.58±2.50 7.77±3.14 -4.14 0.000精子DNA完整率(%) 64.96±13.33 72.23±12.43 -3.38 0.001

討 論

在不育癥患者夫婦中，大約有30%～40%是由男方因素引起，15%～20%是由男女雙方因素共同所致。因此，男性因素是不育癥不可忽視的重要原因。精液參數(shù)異常是引起男性不育的常見(jiàn)原因，弱精子癥導(dǎo)致的男性不育就是其中之一。由于男性生殖系統(tǒng)特殊的解剖及生理特性，使得因男性因素引起的不育癥通過(guò)藥物或手術(shù)治療的效果較差，而且，約有3%～5%的不育癥屬于難治性的，必須通過(guò)輔助生殖技術(shù)才能達(dá)到妊娠的目的[2]。

弱精子癥患者由于精子活力降低導(dǎo)致精子穿透宮頸黏液的功能下降，無(wú)法在最佳時(shí)間內(nèi)游到卵子所在位置，因而，也就導(dǎo)致精子的受精能力下降，甚至部分弱精子癥患者只能通過(guò)人類(lèi)輔助生殖技術(shù)才能解決生育問(wèn)題。無(wú)論是采用人工授精，還是IVF-ET，輔助生殖治療前都必須制備優(yōu)化精子，去除精漿中使精子失去受精能力的物質(zhì)。目前，常用的精液優(yōu)化處理方法有簡(jiǎn)單洗滌法、直接上游法和非連續(xù)密度梯度離心法等。對(duì)于精液參數(shù)正常的標(biāo)本，多采用上游法，對(duì)于弱精子癥患者精液標(biāo)本，則多采用非連續(xù)密度梯度離心法[1]。不同的精子制備方法有不同的優(yōu)缺點(diǎn)，上游法能顯著提高PR百分率，但對(duì)提高正常形態(tài)精子百分率無(wú)明顯改善[3]；選擇非連續(xù)密度梯度離心則可富集更多活力好、形態(tài)正常的精子，有利于提高卵子的受精率[4]。精子制備方法很多，各種方法對(duì)精液常規(guī)分析參數(shù)的影響大都已有定論，但對(duì)精子DNA 完整性的影響，研究結(jié)果卻不盡相同。已有研究報(bào)道，上游法、密度梯度離心法均可以不同程度優(yōu)化精液質(zhì)量，顯著提高精子DNA完整率[5]，但是其研究對(duì)象均來(lái)自于精液參數(shù)正常的男性。另一方面，精子DNA損傷又與男性不育密切相關(guān)，其損傷程度與自然受孕率呈顯著負(fù)相關(guān)。有報(bào)道認(rèn)為精子DNA碎片指數(shù)（DFI）≥30%，則自然生育的可能性幾乎為零[6]。本研究運(yùn)用非連續(xù)密度梯度離心法對(duì)弱精子癥患者精液標(biāo)本進(jìn)行精子優(yōu)選制備，并對(duì)制備前后的精液標(biāo)本進(jìn)行精液常規(guī)和精子形態(tài)分析，采用吖啶橙染色方法檢測(cè)精子DNA完整性。26例弱精子癥患者精液標(biāo)本通過(guò)非連續(xù)密度梯度離心法制備精子后，精子DNA完整率較制備前明顯改善，而且精子總活力、PR和正常形態(tài)精子百分率也得到顯著提高。精子濃度較制備前之所以顯著下降，是因?yàn)樵诰觾?yōu)選制備過(guò)程中部分精子丟失的緣故。已知精子成熟是精子核高度濃縮、組蛋白被魚(yú)精蛋白取代的過(guò)程，成熟后的精子其密度較高，因此，在非連續(xù)密度梯度離心過(guò)程中，正常精子與非成熟精子、畸形精子、不活動(dòng)精子及精液中的其他細(xì)胞成分在運(yùn)動(dòng)能力、運(yùn)動(dòng)軌跡和浮力密度等方面存在差異，在非連續(xù)密度梯度溶液柱中運(yùn)動(dòng)的能力也有差異，離心后精液中的各種成分在密度梯度溶液柱中達(dá)到平衡，成熟精子因密度最高而沉淀在離心管底部，從而可以有效篩選出分化成熟而形態(tài)相對(duì)正常、活動(dòng)力更好的精子。已有文獻(xiàn)報(bào)道通過(guò)非連續(xù)密度梯度離心法體外處理后的精子發(fā)生凋亡和壞死的比例明顯降低，有活力的精子平均百分比明顯升高[7]。本研究顯示，弱精子癥患者精液經(jīng)非連續(xù)密度梯度離心法處理后，大量的死亡或 DNA 損傷的精子被去除，從而使分化成熟的正常精子（綠色熒光精子）比例增加，精子DNA 完整率得到顯著提高，結(jié)果與Xue等[8]在優(yōu)化處理畸形精子癥精液標(biāo)本時(shí)所得結(jié)果類(lèi)似。

綜上所述，對(duì)于弱精子癥患者精液標(biāo)本，采用非連續(xù)密度梯度法制備精子，不僅能提高精子活力和正常形態(tài)精子百分率，還能富集到更多DNA完整的精子，有效提高制備后精子的DNA完整率，為后續(xù)實(shí)施人類(lèi)輔助生殖技術(shù)提供安全保障。

參考文獻(xiàn)

1 WHO主編.國(guó)家人口和計(jì)劃生育委員會(huì)科學(xué)技術(shù)研究所譯.人類(lèi)精液檢查與處理實(shí)驗(yàn)室手冊(cè).北京: 人民衛(wèi)生出版社, 2011: 135-139

2 熊承良, 吳明章, 劉繼紅, 等主編.人類(lèi)精子學(xué).武漢: 湖北科學(xué)技術(shù)出版社, 2002: 548

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