楊樹和柳樹基因組共線性的可視化分析

徐逸卿，杜思源，蔣安納，王啟昂，薛倚鷺

（南京林業(yè)大學(xué)信息科學(xué)技術(shù)學(xué)院，江蘇南京210037）

在楊柳科中，楊屬和柳屬是姐妹屬［1］，它們廣泛地分布在北半球地區(qū)，具有適應(yīng)力強(qiáng)、生長迅速、易繁殖、用途廣等特點(diǎn)，是維護(hù)生態(tài)環(huán)境和解決木材短缺的重要物種［2］。楊屬和柳屬各自擁有相對較小的基因組，隨著研究的大量開展以及基因組資源的迅速增長，楊柳科植物成為了木本植物在遺傳學(xué)研究中的模式生物。在楊屬中，毛果楊（Populus trichocarpa）的全基因組測序及染色體的組裝早在2006年就已經(jīng)完成［3］，是第一個(gè)被測序的木本植物，之后楊屬的物種陸續(xù)被測序；在柳屬中，簸箕柳（Salix suchowensis）的全基因組測序、染色體組裝分別于 2014、2016年完成［4－5］。細(xì)胞遺傳學(xué)研究表明，楊屬和柳屬這2個(gè)屬主要包含二倍體植物，其單倍型染色體數(shù)目是19對（n＝19）［6］。在將楊樹的基因組和柳樹的遺傳圖譜進(jìn)行比較時(shí)，研究人員經(jīng)發(fā)現(xiàn)了染色體裂變、融合等現(xiàn)象［7］。但是遺傳圖譜與基因組相比，精度較低，因此需要通過對基因組信息進(jìn)行分析來研究楊柳科的進(jìn)化機(jī)制。

基因共線性是指在具有同源性關(guān)系的2個(gè)物種中，其基因組中有共同的連鎖基因，且同源基因的相對順序具有較高保守性的現(xiàn)象［8］。在生物進(jìn)化中，基因組會在全基因組復(fù)制、染色體重組、染色體倒位和易位等過程中發(fā)生結(jié)構(gòu)和數(shù)量的變化［9－10］。因此，基因組的共線性分析在非編碼序列的確認(rèn)［11］、新測序物種的注釋［12］和全基因組復(fù)制事件的估計(jì)［8］等過程中具有重要作用。本研究使用 MCScanX［13］、VGSC［14］這2個(gè)軟件分別進(jìn)行共線性分析和作圖，對楊樹和柳樹的種內(nèi)、種間基因組同源關(guān)系進(jìn)行分析，并繪制相應(yīng)的關(guān)系圖，進(jìn)而探討導(dǎo)致楊屬和柳屬進(jìn)化的基因組機(jī)制。本研究結(jié)果可為研究楊柳科祖先基因組復(fù)制事件提供重要依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)數(shù)據(jù)

本試驗(yàn)采用楊柳科的毛果楊和簸箕柳這2個(gè)物種進(jìn)行基因組內(nèi)和基因組間的共線性分析，從而確定楊樹和柳樹的進(jìn)化機(jī)制。毛果楊是第一個(gè)被用于全基因組測序的樹種，具有生長速度快、基因組較小、經(jīng)濟(jì)價(jià)值高等特點(diǎn)。2006年，Tuskan等利用鳥槍測序法完成毛果楊基因組的測序，結(jié)果表明，毛果楊基因組內(nèi)含有堿基對4.85億個(gè)，染色體19對，推測基因數(shù)量為45 555個(gè)［3］。隨著國內(nèi)外有關(guān)研究的大量開展，毛果楊現(xiàn)已成為木本植物研究中的模式物種［15］。毛果楊的全基因組信息可從JGI數(shù)據(jù)庫［16］下載，下載地址為http：／／genome.jgi.doe.gov／pages／dynamicOrganismDownload.jsf？organism＝Ptrichocarpa。由于大多數(shù)林木研究物種的世代周期較長，多為高大的喬木，實(shí)際操作麻煩，而柳屬中的簸箕柳的世代周期只有1年，個(gè)體較小，取材方便，并且易于栽培，對環(huán)境要求不高，可以極大提高研究人員的試驗(yàn)效率，因此簸箕柳成為了木本植物研究的新熱點(diǎn)。Dai等于2014年完成了簸箕柳的全基因組測序［4］，共發(fā)現(xiàn)了26 599個(gè)編碼基因，其中20 261個(gè)基因與楊樹基因同源。柳樹的全基因組信息發(fā)布的網(wǎng)址為 http：／／115.29.234.170／willow，可以直接下載。下載的數(shù)據(jù)包括全基因組的序列（Fasta格式，https：／／en.wikipedia.org／wiki／FASTA＿format）和基因注釋文件（GFF格式，www.gmod.org／wiki／GFF3），這些都被廣泛應(yīng)用于常見的基因組裝軟件和數(shù)據(jù)庫。

1.2 試驗(yàn)工具軟件

全基因組數(shù)據(jù)為科研人員提供了大量的信息，在全基因組水平上進(jìn)行共線性分析是比較基因組學(xué)的重要研究內(nèi)容。因此，越來越多研究共線性的方法被提出，早期的軟件多采用傳統(tǒng)的聚類算法，如 OrthoCluster［17－18］、ADHoRe［19］和 Maxgap Clusters by Multiple Sequence Comparison（簡 稱MCMuSeC）［20］，對鄰近的基因?qū)M(jìn)行匹配。這些軟件在計(jì)算過程中由于影響因素較多，結(jié)果的可靠性并不是很高。另一種常見的算法是使用動(dòng)態(tài)算法線性雙向匹配基因?qū)Γ⑶依谩板^基因”對相鄰的線性基因進(jìn)行打分。此類軟件包括ColinearScan［21］、MCScanX［8］和 SyMAP［12］等。ColinearScan利用基因組蛋白質(zhì)的比對序列確定同源基因?qū)κ欠翊嬖冢行У仡A(yù)測了待測基因的共線性。SyMAP的優(yōu)點(diǎn)在于尋找共線性基因的速度很快，但是由于參數(shù)的設(shè)置只能識別大片段的共線性基因，小片段的共線性基因很容易被漏掉。MCScanX（簡稱Multiple Collinearity Scan）是目前最流行的共線性分析軟件，它采用匹配的錨點(diǎn)掃描多個(gè)基因中的序列或子序列，然后對假定的同源染色體區(qū)域進(jìn)行匹配計(jì)分，最后給出計(jì)算的共線性分值。綜上所述，本試驗(yàn)選用MCScanX軟件作為共線性分析的主要工具。

上述共線性分析軟件的側(cè)重點(diǎn)集中在數(shù)據(jù)的處理上，缺少了對下游數(shù)據(jù)分析結(jié)果的可視化，絕大多數(shù)都沒有提供可視化的輸出接口。因此，近年來出現(xiàn)了一些專門進(jìn)行共線性圖形化的軟件，例如 SynChro［22］、GSV［23］和 Easyfig［24］，但是這些軟件只能提供雙線圖的顯示，顯示效果不直觀并且也不利于導(dǎo)出和發(fā)表。Circos是科學(xué)可視化領(lǐng)域一個(gè)著名的圖形化工具，它可以將基因匹配與比較分析異同的結(jié)果用圓形圖案表示出來，提供點(diǎn)陣圖和矢量圖的輸出，在生物信息學(xué)研究中很受歡迎［25］。但它也僅限于圓形圖形的處理，使得共線性研究受到了一定程度的限制。為了彌補(bǔ)這些不足，MCScanX設(shè)計(jì)并實(shí)現(xiàn)了15個(gè)用于共線性分析和顯示的工具，并提供了點(diǎn)圖、圓圖、雙線圖等多種展示類型，實(shí)用性很強(qiáng)。然而，MCScanX只能允許用戶在命令行的環(huán)境中進(jìn)行操作，并且只能輸出低分辨率的點(diǎn)陣圖，在高通量測序逐漸普及的今天，成為了數(shù)據(jù)精細(xì)化分析的瓶頸。VGSC（A Web－Based Vector Graph Toolkit of Genome Synteny and Collinearity）［14］是 2016年最新發(fā)布的共線性分析作圖的在線平臺，自發(fā)布以來，該在線平臺已經(jīng)在生物學(xué)領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用，不僅推動(dòng)了生物進(jìn)化分析的發(fā)展，也給基因家族分析、結(jié)構(gòu)變異、新物種全基因組注釋等方面帶來了極大的便利。該平臺最大的優(yōu)勢就在于分析結(jié)果的矢量圖輸出能力。如表1所示，經(jīng)過比較，本試驗(yàn)選用VGSC繪制楊、柳物種基因組內(nèi)與組間共線性關(guān)系圖。

表1 共線性可視化軟件基本信息

VGSC可以利用用戶上傳的GFF格式的基因注釋文件和共線性分析生成的關(guān)系文件計(jì)算并生成對應(yīng)的圖形結(jié)果。如圖1所示，VGSC提供了圓圖、條狀圖、散點(diǎn)圖和雙線圖4種不同的圖形。用戶可以根據(jù)研究的需要，選取并創(chuàng)建合適類型的圖形，并且每種類型都支持高分辨率的點(diǎn)陣圖（如BMP、JPEG和PNG）和高清晰度的矢量圖的輸出方式（如PDF、EPS和SVG）。VGSC的一個(gè)重要的特性就是它的矢量圖輸出能力，如圖2演示了點(diǎn)陣圖像和矢量圖形在細(xì)節(jié)表現(xiàn)中的差異，隨著高通量測序的不斷發(fā)展，新測序技術(shù)帶來的海量數(shù)據(jù)常常生成巨幅的運(yùn)算結(jié)果。因此，在進(jìn)行比對時(shí)，矢量圖形的大小無關(guān)性和方向無關(guān)性的特點(diǎn)，對研究的開展及其報(bào)告的展示產(chǎn)生了積極的意義。

1.3 分析過程

楊柳基因組內(nèi)、基因組間的共線性分析流程分別如圖3、圖4所示。在進(jìn)行基因組內(nèi)共線性研究時(shí)，第1步是利用序列比對檢索工具BLASTp，分別將該物種內(nèi)的每條染色體與其他所有染色體進(jìn)行蛋白質(zhì)序列比對，得到各自的比對結(jié)果；在進(jìn)行組間共線性分析時(shí)，對楊樹基因組和柳樹基因組進(jìn)行1次全基因組比對檢索。第2步是利用MCScanX計(jì)算比對結(jié)果的BLAST文件和GFF格式的基因注釋進(jìn)行計(jì)算，得到共線性分析結(jié)果collinearity文件。第3步是在VGSC的在線服務(wù)平臺上傳得到的collinearity文件和GFF格式的基因注釋文件，配置參數(shù)并作圖得到共線性圖形，保存為矢量圖形便于進(jìn)一步分析。

具體地講，圖5、圖6分別演示了第3步VGSC對楊樹、柳樹基因組內(nèi)和基因組間共線性作圖的參數(shù)。VGSC的圖形繪制流程與常見的圖形化工具類似，首先，它提供了圓圖、條狀圖、散點(diǎn)圖和雙線圖4種不同的圖形，其中圓圖能夠直觀展現(xiàn)1條染色體和多條染色體之間的共線性關(guān)系，雙線圖則更適合展現(xiàn)2條染色體間的共線性關(guān)系。在進(jìn)行基因組內(nèi)和組間共線性繪圖時(shí)，我們分別選取圓圖、雙線圖作為輸出圖形。其次，上傳BLASTp工具的比對結(jié)果和GFF基因注釋文件。再次，對繪圖參數(shù)進(jìn)行配置，包括圖形的大小、輸出文件格式和共線性分析的染色體名稱。

2 結(jié)果與分析

以上共線性分析及作圖對于揭示楊柳科植物的近源關(guān)系具有積極的作用。通過觀察楊樹的共線性分析圓形圖可以發(fā)現(xiàn)，各個(gè)染色體間同源片段的整體分布情況與Tuskan等的研究結(jié)果［3］大致一致，但是由于基因組信息的不斷更新而造成了一些小差異（圖7）。楊樹基因組內(nèi)的每條染色體都可以在其他染色體上找到同源片段，柳樹基因組內(nèi)也是如此。通過比較楊樹和柳樹對應(yīng)的染色體的同源片段分布情況，我們可以發(fā)現(xiàn)只有Ⅰ、Ⅲ、Ⅵ和ⅩⅥ這4條染色體的同源關(guān)系圖存在較大差異（圖7），其余15條染色體幾乎一樣。通過試驗(yàn)還可以發(fā)現(xiàn)，楊樹的1號染色體的上半部分的同源基因片段在其3號染色體上，而柳樹的1號染色體的上半部分的同源基因片段在6號染色體上。楊樹的16號染色體的同源基因片段在其6號染色上，而柳樹16號染色體的同源基因片段基本上在3號染色體上。假設(shè)楊樹和柳樹基因組之間的差異是由1號染色體和16號染色體之間的重排引起的，為了驗(yàn)證此猜想，可以對楊樹和柳樹基因組中相應(yīng)的染色體進(jìn)行共線性分析比較。如圖8所示，在對楊樹和柳樹基因組間共線性進(jìn)行分析時(shí)，除了1號染色體和16號染色體這2組染色體間存在較大的差異，其他組染色體間的共線性關(guān)系都很高。而楊樹1號染色體與柳樹16號染色體，以及柳樹1號染色體與楊樹16號染色體共線性分析結(jié)果顯示，楊樹1號染色體的上半部分與柳樹的16號染色體同源，而下半部分與柳樹的1號染色體同源。楊樹16號染色體的同源片段存在于柳樹1號染色體的上半部分。這一發(fā)現(xiàn)為發(fā)生在1號染色體和16號染色體間的斷裂融合提供了有力證據(jù)。除此之外，楊樹和柳樹基因組內(nèi)和基因組間的共線性分析結(jié)果表明，還存在一些染色體間的重排現(xiàn)象。Hou等采用簡單序列重復(fù)（simple sequence repeats，簡稱SSR）標(biāo)記分析進(jìn)一步驗(yàn)證了楊樹、柳樹的1號染色體與16號染色體間發(fā)生了重排［5］。

3 討論與結(jié)論

共線性分析軟件的出現(xiàn)極大地推動(dòng)了基因共線性分析的發(fā)展，近年來，更多的工具能夠讓用戶以在線形式快速高效地將共線性分析結(jié)果以高清晰度的矢量圖或高質(zhì)量點(diǎn)陣圖的方式輸出。通過比對分析VGSC繪制的楊樹、柳樹基因組內(nèi)和基因組間共線性關(guān)系圖，筆者發(fā)現(xiàn)基因組內(nèi)不同染色體間存在大量重復(fù)片段，并且基因組間大多數(shù)染色體間的共線性關(guān)系很高。這一現(xiàn)象說明，楊樹和柳樹的分化是在古四倍體基因組二倍化之后完成的。經(jīng)過基因組間的共線性分析，筆者發(fā)現(xiàn)了2個(gè)大的染色體重排現(xiàn)象，由此推測1號染色體與16號染色體間發(fā)生了斷裂融合，這一結(jié)果說明楊樹和柳樹沒有同時(shí)進(jìn)行分化，而是一個(gè)物種是由另一個(gè)物種進(jìn)化而來的。Dorn等研究表明，楊樹的進(jìn)化早于柳樹，因此可以推測楊樹向柳樹進(jìn)化的過程：古四倍體祖先的基因組在染色體的斷裂融合之后進(jìn)行了二倍化，由此出現(xiàn)了楊樹［26－27］。楊樹在進(jìn)化的過程中，其1號染色體和16號染色體間發(fā)生了重排事件，進(jìn)而出現(xiàn)了現(xiàn)代柳樹的祖先。綜上所述，本研究結(jié)合了MCScanX的分析工具和VGSC的高質(zhì)量圖形化服務(wù)，更直觀地再現(xiàn)了楊樹和柳樹基因組內(nèi)和基因組間染色體基因的對應(yīng)關(guān)系，推測了楊屬和柳屬進(jìn)化的機(jī)制，為楊柳科植物的起源提供了重要依據(jù)，為更好地認(rèn)識楊柳科植物打下了基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)：

［1］Heywood V H，Moore D M，Richardson IB K，et al.Flowering plants of the world［M］.Oxford：Oxford University Press，1993：316.

［2］Isebrands JG，Richardson J.21st session of the international poplar commission（IPC 2000）.Poplar and willow culture：meeting the needs of society and the environment［J］.Art Education，2000，41（1）：9－17.

［3］Tuskan G A，di Fazio S，Jansson S，et al.Supporting online material for the genome of black cottonwood，Populus trichocarpa（Torr.＆Gray）［J］.Science，2006，313（5793）：1596－1604.

［4］Dai X，Hu Q，CaiQ，etal.Thewillow genome and divergentevolution from poplar after the common genome duplication［J］.Cell Research，2014，24（10）：1274－1277.

［5］Hou J，Ye N，Dong Z，et al.Major chromosomal rearrangements distinguish willow and poplar after the ancestral“Salicoid”genome duplication［J］.Genome Biology＆Evolution，2016，8（6）：1868－1875.

［6］Blackburn K B，Harrison JW H.A preliminary account of the chromosomes and chromosome behaviour in the salicaceae［J］.Annals of Botany，1924，38（150）：361－378.

［7］Berlin S，Lagercrantz U，Arnold S V，et al.High－density linkage mapping and evolution of paralogs and orthologs in Salix and Populus［J］.BMC Genomics，2010，11（1）：129.

［8］Tang H，Bowers JE，Wang X，et al.Synteny and collinearity in plant genomes［J］.Science，2008，320（5875）：486－488.

［9］Dujon B，Sherman D，F(xiàn)ischer G，et al.Genome evolution in yeasts［J］.Nature，2004，430（6995）：35－44.

［10］Nakatani Y，Takeda H，Kohara Y，et al.Reconstruction of the vertebrate ancestral genome reveals dynamic genome reorganization in early vertebrates［M］.Japan：Springer，2011.

［11］Lyons E，Pedersen B，Kane J，et al.Finding and comparing syntenic regions among Arabidopsis and the outgroups papaya，poplar，and grape：CoGe with rosids［J］.Plant Physiology，2008，148（4）：1772－1781.

［12］Soderlund C，Bomhoff M，Nelson W M.SyMAP v3.4：a turnkey synteny system with application to plant genomes［J］.Nucleic Acids Research，2011，39（10）：e68.

［13］Wang Y，Tang H，Debarry J D，et al.MCScanX：a toolkit for detection and evolutionary analysis of gene synteny and collinearity［J］.Nucleic Acids Research，2012，40（7）：e49.

［14］Xu Y，Bi C，Wu G，et al.VGSC：A web－based vector graph toolkit of genome synteny and collinearity［J］. Biomed Research International，2016，2016（1）：7823429.

［15］張 勇，張守攻，齊力旺，等.楊樹——林木基因組學(xué)研究的模式物種［J］.植物學(xué)報(bào)，2006，23（3）：286－293.

［16］Grigoriev IV，Nordberg H，Shabalov I，et al.The genome portal of the Departmentof Energy JointGenome Institute［J］.Nucleic Acids Research，2012，40：D26－D32.

［17］Vergara IA，Chen N.Using OrthoCluster for the detection ofsynteny blocks among multiple genomes［M］／／Current Protocols in Bioinformatics.John Wiley＆Sons Inc，2009.

［18］Zeng X，Nesbitt M J，Pei J，etal.OrthoCluster：a new tool formining synteny blocks and applications in comparative genomics［C］／／Proceedings of the International Conference on Extending Database TechnologyAdvances in Database Technology，2008：656－667.

［19］Vandepoele K，Saeys Y，Simillion C，et al.The automatic detection of homologous regions（ADHoRe） and its application to microcolinearity between Arabidopsis and rice［J］. Genome Research，2002，12（11）：1792.

［20］Ling X，He X，Xin D.Detecting gene clusters under evolutionary constraint in a large number of genomes［J］.Bioinformatics，2009，25（5）：571－577.

［21］Wang X，Shi X，Li Z，et al.Statistical inference of chromosomal homology based on gene colinearity and applications to Arabidopsis and rice［J］.BMC Bioinformatics，2006，7（1）：447.

［22］Drillon G，Carbone A，F(xiàn)ischer G.SynChro：a fast and easy tool to reconstruct and visualize synteny blocks along eukaryotic chromosomes［J］.PLoSOne，2014，9（3）：e92621.

［23］Revanna K V，Chiu C C，Bierschank E，et al.GSV：a web－based genome synteny viewer for customized data［J］. BMC Bioinformatics，2011，12（1）：316.

［24］Sullivan M J，Petty N K，Beatson SA.Easyfig：a genome comparison visualizer［J］.Bioinformatics，2011，27（7）：1009－1010.

［25］Gascoyne R D，Krzywinski M，Birol I，et al.Circos：an information aesthetic for comparative genomics［J］.2009，

［26］Dorn R D.A synopsis of American Salix［J］.Canadian Journal of Botany，2011，54（24）：2769－2789.

［27］Skvortsov A K. Willows of Russia and adjacent countries：taxonomical and geographical revision［M］.Joensuu：University of Joensuu Press，1999：1－307.