張 嵐，袁 敏，王振怡，潘玉欣

（華北理工大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院／華北理工大學(xué)基因組學(xué)與計(jì)算生物學(xué)研究中心，河北唐山063210）

全基因組加倍，又稱伴隨基因丟失的多倍化，長期以來已經(jīng)成為動(dòng)物、真菌和其他生物，尤其是植物基因組進(jìn)化的一個(gè)重要驅(qū)動(dòng)力［1］。隨著全基因組加倍的進(jìn)行，基因組結(jié)構(gòu)常常會(huì)發(fā)生明顯改變，如染色體重組、基因倒位、基因丟失等，而多倍化產(chǎn)生的大量重復(fù)基因成為遺傳創(chuàng)新的重要材料來源［2］。被子植物是迄今為止陸地植物的最大族群，有超過300 000種生物，大多數(shù)開花植物的進(jìn)化過程均受到多倍化影響［3］。研究表明，在被子植物的早期進(jìn)化過程中甚至存在古多倍化事件。無油樟是縱觀被子植物歷史的一個(gè)重要的參照，是已測(cè)序的開花植物中最古老的物種之一，基因組結(jié)構(gòu)和種系基因組學(xué)分析表明，被子植物的祖先是多倍體，祖先基因在被子植物生物學(xué)中起著關(guān)鍵作用［4－6］。雙子葉植物的共同祖先有7條染色體，在13 000萬年前經(jīng)歷了雙子葉植物共有的三倍乘（γ）事件后，又經(jīng)歷染色體的融合等過程，葡萄基因組形成現(xiàn)有的19條染色體［7－8］。作為首先被測(cè)序完成的開花植物，擬南芥在和葡萄一樣經(jīng)歷了雙子葉植物共同祖先的三倍乘（γ）事件后，又發(fā)生了最近的 2次二倍乘（α，β）事件［9－12］。水稻是單子葉禾本科植物中重要的模式植物，基因組拼接較為完整，其結(jié)構(gòu)也最接近禾本科植物基因組。水稻基因組在約1億年前經(jīng)歷了禾本科植物共有的全基因組加倍事件，而后又先后發(fā)生了2次自己獨(dú)立的全基因組二倍乘事件［13－14］。這些多倍化產(chǎn)生的重復(fù)基因?yàn)榇蠓秶治龌蜻M(jìn)化和功能提供了有價(jià)值的參考。

本研究對(duì)無油樟、葡萄、擬南芥、水稻基因組進(jìn)行比較基因組學(xué)分析，通過4個(gè)物種基因組內(nèi)和基因組間的同源共線性分析，明確多倍化過程對(duì)重復(fù)基因造成的影響，解析基因組在進(jìn)化過程中發(fā)生的變化，對(duì)于探尋單、雙子葉植物的共同起源以及研究被子植物的進(jìn)化過程具有重要的意義。

1 材料與方法

1.1 全基因組序列數(shù)據(jù)

葡萄（Vitis vinifera，簡(jiǎn)稱 Vv）的全基因組序列來自Phytozome（https：／／phytozome.jgi.doe.gov），無油樟（Amborella trichopoda，簡(jiǎn)稱 Ar）、擬南芥（Arabidopsis thaliana，簡(jiǎn)稱 At）和水稻（Oryza sativa，簡(jiǎn)稱 Os）的全基因組數(shù)據(jù)來自 PGDD（http：／／chibba.agtec.uga.edu／duplication）。其中，無油樟基因組涉及1 210個(gè)scaffolds，26 846個(gè)基因；葡萄有19條染色體，26 346個(gè)基因；擬南芥有5條染色體，27 416個(gè)基因；水稻有12條染色體，39 049個(gè)基因。

1.2 全基因組同源結(jié)構(gòu)分析

為了更準(zhǔn)確地尋找各物種基因組內(nèi)以及基因組間的同源結(jié)構(gòu)片段，本研究對(duì)獲取的原始基因組數(shù)據(jù)進(jìn)行了數(shù)據(jù)預(yù)處理。對(duì)于無油樟，選取前100個(gè)長度2 Mb以上的scaffolds，其他物種均去除沒有錨定到染色體上的基因。利用基本局部序列比對(duì)工具 BLASTP（E≤10－5）［15］，對(duì)單一物種基因組內(nèi)以及2個(gè)物種基因組間作雙序列比對(duì)，獲取基因組內(nèi)以及基因組間的同源基因?qū)Α?/p>

結(jié)合基因組內(nèi)及基因組間雙序列比對(duì)結(jié)果與各個(gè)物種染色體的長度信息、染色體上各個(gè)基因的位置信息，編寫Perl程序繪制同源結(jié)構(gòu)點(diǎn)陣圖，并且標(biāo)記出基因?qū)﹂g匹配最好、次好以及其余的3個(gè)基因?qū)?。根?jù)同源結(jié)構(gòu)點(diǎn)陣圖上基因?qū)M成的成線性的片段，驗(yàn)證各個(gè)物種在進(jìn)化歷程中發(fā)生的全基因組加倍事件，同時(shí)為共線性數(shù)據(jù)分析提供圖示化依據(jù)。

1.3 全基因組共線性分析

利用共線性分析工具 MCScan［16］和 Colinearscan（P＜0.05）［14］，獲取基因組內(nèi)以及基因組間同源共線區(qū)域。為了描述同源共線片段的相似性，在基因組內(nèi)和基因組間，考慮到大的基因家族（重復(fù)基因?qū)?shù)≤30個(gè)）［17］以及串聯(lián)重復(fù)基因（基因?qū)﹂g相對(duì)位置 ＜2×106bp）［18］的影響，按照同源共線區(qū)域內(nèi)包含的基因?qū)?shù)量，統(tǒng)計(jì)在不同長度范圍的同源共線區(qū)域的數(shù)量和區(qū)域內(nèi)包含的同源共線基因?qū)?shù)量、無油樟與其他物種基因組間共線性基因的保留情況，以及無油樟與擬南芥、葡萄、水稻基因組間共有的無油樟基因占共線性基因的百分比。

1.4 多物種基因組聯(lián)合比對(duì)圖譜的構(gòu)建

本研究以葡萄基因組三倍乘事件的共線性基因作為參考列，結(jié)合基因組內(nèi)和基因組間同源共線性分析結(jié)果，建立多物種基因組聯(lián)合比對(duì)列表，并編寫python程序，利用Matplotlib繪制多物種基因組聯(lián)合比對(duì)圖譜，以圈圖的形式反映基因組間的相似性。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因組內(nèi)及基因組間同源結(jié)構(gòu)分析

以1個(gè)已知的較為古老的物種或者全基因組發(fā)生加倍次數(shù)較多的物種基因組內(nèi)的同源結(jié)構(gòu)點(diǎn)陣圖為依據(jù)，結(jié)合2個(gè)物種基因組間的同源結(jié)構(gòu)點(diǎn)陣圖，可以基本推斷后一物種在進(jìn)化過程中在全基因組層面發(fā)生的主要加倍事件，而且能夠統(tǒng)計(jì)出在不同加倍事件中參與的基因數(shù)量。

在同源結(jié)構(gòu)點(diǎn)陣圖中，紅色的點(diǎn)表示在物種基因組間進(jìn)行的蛋白質(zhì)序列比對(duì)中，處于最佳匹配的同源基因?qū)?，表示物種間的直系同源片段；藍(lán)色的點(diǎn)表示的是次好匹配的同源基因?qū)?，而灰色的點(diǎn)表示的是其余的同源基因?qū)Γ硎痉N間旁系同源片斷。

無油樟是被子植物中已測(cè)序的最古老的物種，其基因組沒有被錨定到某一條染色體上，從無油樟基因組內(nèi)的同源結(jié)構(gòu)點(diǎn)陣圖中，看到的是一些非常短小的線段，很難分析出其自身的加倍過程。而在無油樟和葡萄2個(gè)物種基因組間的同源結(jié)構(gòu)分析中，發(fā)現(xiàn)無油樟的9號(hào)scaffold與葡萄的2、5、16號(hào)染色體之間存在1∶3同源共線關(guān)系，無油樟的29號(hào)scaffold與葡萄的6、8、13號(hào)染色體之間存在的1∶3同源共線關(guān)系。在無油樟的第12、40號(hào)scaffold與葡萄的6、8、13號(hào)染色體之間，以及第49號(hào)scaffold與葡萄的第1、14、17號(hào)染色體間也存在明顯的1∶3的同源共線關(guān)系。同樣，在其他scaffold與葡萄染色體之間也存在類似情況（圖1）。這與 Amborella Genome Project報(bào)道的結(jié)果［4］相符。

2.2 同源共線片段推斷

本研究使用共線性分析工具推測(cè)無油樟與葡萄、擬南芥、水稻基因組內(nèi)和基因組間的同源共線片段。結(jié)果表明，同源性往往依賴于長的同源共線性片段，而不同基因組間的高相似性對(duì)解析基因組結(jié)構(gòu)、功能與基因家族的分析提供了幫助［18］。

在無油樟基因組內(nèi)，存在102個(gè)長度≥4個(gè)基因?qū)Φ耐垂簿€區(qū)域，包含473個(gè)基因?qū)Γ@說明其同源共線性較差。同樣，在同源結(jié)構(gòu)點(diǎn)陣圖中也看不到大段的連續(xù)區(qū)域。當(dāng)同源共線區(qū)域≥20個(gè)基因?qū)﹂L度時(shí)，葡萄基因組內(nèi)部包含21個(gè)同源共線區(qū)域，595個(gè)同源共線基因?qū)Γ铋L的片段位于葡萄的5號(hào)和7號(hào)染色體之間，包含52個(gè)基因?qū)Γ粩M南芥基因組內(nèi)部包含52個(gè)同源共線區(qū)域，有2 472個(gè)同源共線基因?qū)?，最長的片段位于擬南芥的3號(hào)和2號(hào)染色體之間，包含181個(gè)基因?qū)?；水稻基因組內(nèi)包含34個(gè)同源共線區(qū)域，共2 774個(gè)同源共線基因?qū)Γ铋L的片段位于水稻的1號(hào)和5號(hào)染色體之間，包含250個(gè)基因?qū)?。而在水稻基因組內(nèi)，在不同的基因?qū)﹂L度范圍，得到的同源共線性區(qū)域以及同源共線性基因?qū)Φ臄?shù)量相對(duì)較多，超過200個(gè)基因?qū)﹂L度的區(qū)域有2個(gè)，包含499個(gè)同源基因?qū)Α４罅康拈L片段存在于水稻和擬南芥基因組內(nèi)（表1），這與同源結(jié)構(gòu)點(diǎn)陣圖得到的結(jié)論相符。研究表明，無油樟與其他幾個(gè)物種相比，擁有最短的共線性同源區(qū)域，它是最古老的物種，在漫長的歷史進(jìn)程中，基因組的結(jié)構(gòu)遭受了嚴(yán)重的破壞，而其他幾種模式植物則相對(duì)保存了較好的同源共線性。

在無油樟基因組與其他物種的共線性分析中，發(fā)現(xiàn)在不同長度同源共線區(qū)域限定時(shí)，無油樟與葡萄的基因組間保存相對(duì)較好的同源共線區(qū)域及同源共線基因?qū)?shù)量。當(dāng)同源共線區(qū)域≥10個(gè)基因?qū)﹂L度時(shí)，在無油樟與葡萄基因組間有139個(gè)同源共線區(qū)塊，包含2 311個(gè)基因?qū)?；無油樟與擬南芥基因組間包含14個(gè)同源共線區(qū)塊，包含164個(gè)基因?qū)Γ辉跓o油樟與水稻基因組間包含49個(gè)同源共線區(qū)塊，包含622個(gè)基因?qū)?。?dāng)同源共線區(qū)域≥20個(gè)基因?qū)﹂L度時(shí)，在無油樟與葡萄基因組間有33個(gè)共線性區(qū)塊，包含928個(gè)基因?qū)?，最長的片段位于無油樟的第2號(hào)scaffold和葡萄的第5號(hào)染色體之間，包含52個(gè)基因?qū)?；在無油樟和水稻基因組間包含2個(gè)共線性區(qū)塊，包含42個(gè)基因?qū)?，最長的片段位于無油樟的第25號(hào)scaffold和水稻的第2號(hào)染色體之間，包含22個(gè)基因?qū)?；無油樟和擬南芥基因組間沒有發(fā)現(xiàn)超過20個(gè)同源共線基因?qū)Φ耐垂簿€區(qū)域。在無油樟與葡萄間甚至存在2個(gè)超過50個(gè)基因?qū)﹂L度的區(qū)域，共有102個(gè)同源共線基因?qū)Γū?）。研究發(fā)現(xiàn)，以只經(jīng)歷了古老的被子植物全基因組加倍事件的無油樟基因組為參考，水稻和擬南芥基因組在進(jìn)化歷程中經(jīng)歷的加倍事件相對(duì)葡萄基因組復(fù)雜，二者所保留的同源共線區(qū)域和同源共線基因?qū)?shù)比葡萄基因組少。

2.3 同源共線性基因的保留情況分析

本研究涉及的4個(gè)物種在經(jīng)歷了各自的加倍事件后，其基因組不可避免地發(fā)生了分離、融合現(xiàn)象，從而導(dǎo)致各物種的基因存在不同程度的丟失，其中葡萄基因組丟失得最少（49.1%），水稻的次之（62.1%），擬南芥丟失得最為嚴(yán)重（652%）。這可能是由于葡萄有19條染色體，其基因組保留了大量的祖先基因，基因組比較穩(wěn)定。在葡萄、擬南芥、水稻3個(gè)物種之間，擬南芥和葡萄間保留的同源共線性基因比例達(dá)到了40.8%，而水稻和葡萄、水稻和擬南芥之間保留的同源共線性基因則相對(duì)較少，顯然這與被子植物單、雙子葉間的親緣關(guān)系相關(guān)，親緣關(guān)系越近，同源共線性基因丟失得越少（表2）。

表1 無油樟（Sca1～Sca100）與其他物種基因組內(nèi)與基因組間同源共線性區(qū)域以及基因?qū)?shù)量統(tǒng)計(jì)結(jié)果

表2 無油樟、葡萄、擬南芥和水稻基因組間同源共線性基因保留情況統(tǒng)計(jì)結(jié)果

本研究統(tǒng)計(jì)了無油樟和擬南芥與無油樟和水稻、無油樟和擬南芥與無油樟和葡萄、無油樟和葡萄與無油樟和水稻保留的無油樟的基因數(shù)。發(fā)現(xiàn)無油樟和葡萄與無油樟和水稻間保留的無油樟基因數(shù)最多（30.6%），無油樟和擬南芥與無油樟和水稻間保留的無油樟的基因數(shù)最少（26.7%），詳見表3，這說明被子植物的祖先基因在進(jìn)化過程中發(fā)生了大規(guī)模丟失，可能是由于物種各自的加倍事件造成的。

2.4 多物種基因組聯(lián)合比對(duì)圖譜的構(gòu)建

作為雙子葉植物中重要的模式植物，葡萄基因組保存了雙子葉植物最完整的γ事件，在13 000萬年前經(jīng)歷了雙子葉植物共同祖先的全基因組三倍乘（γ）事件，而后并未發(fā)生單獨(dú)的多倍化事件，因此以葡萄為參考，基于物種基因組內(nèi)和基因組間的同源共線性分析結(jié)果，構(gòu)建多物種基因組聯(lián)合比對(duì)圖譜。

表3 無油樟與葡萄、擬南芥、水稻基因組間保留的Amborella同源共線基因保留情況統(tǒng)計(jì)結(jié)果

由于葡萄和擬南芥共同經(jīng)歷了雙子葉植物共同祖先的三倍乘事件，而擬南芥又先后發(fā)生了自己的2次二倍乘事件，因此，圖2中的3圈葡萄分別對(duì)應(yīng)3組擬南芥，而每組擬南芥又分別對(duì)應(yīng)自己的2次二倍乘事件。由圖2還可以看出，由內(nèi)往外圈顏色分布越來越淡，這說明物種間的直系同源關(guān)系在進(jìn)化過程中保持了相對(duì)完整，而物種內(nèi)的旁系同源基因?qū)t發(fā)生了大規(guī)模的丟失。由于無油樟與葡萄間存在1∶3的共線性關(guān)系，因此對(duì)應(yīng)有1圈無油樟，可以看出圖2在此圈有大量空白，說明存在大量基因片段的缺失。在多物種基因組聯(lián)合比對(duì)圖譜中，可以根據(jù)不同顏色來判定同源基因在物種間的分布情況，還可以用于分析各物種染色體的重組現(xiàn)象，其中每條染色體上不同的顏色區(qū)域都預(yù)示可能的染色體重組現(xiàn)象。圖譜直觀地闡釋了各個(gè)物種基因組在進(jìn)化過程中發(fā)生的基因丟失情況，同時(shí)也反映各物種染色體的結(jié)構(gòu)變化。物種基因組的加倍規(guī)模和次數(shù)對(duì)基因組的影響在圖譜中清晰可見，重復(fù)基因越多，可能造成基因組的不穩(wěn)定以及基因丟失的增多。

3 討論與結(jié)論

多倍化是被子植物進(jìn)化史上的重要特征，全基因組加倍對(duì)基因組結(jié)構(gòu)及基因家族的進(jìn)化有重要的影響［19］。本研究對(duì)無油樟、葡萄、擬南芥和水稻基因組進(jìn)行了比較基因組學(xué)分析，在同源基因點(diǎn)陣圖中發(fā)現(xiàn)無油樟基因組內(nèi)的同源性較差，而在無油樟與其他幾個(gè)物種的點(diǎn)陣圖中也得到類似結(jié)果。而由無油樟與葡萄的點(diǎn)陣圖得到與已有報(bào)道相同的結(jié)果，結(jié)構(gòu)分析表明，無油樟和葡萄基因組之間存在很明顯的1∶3的關(guān)系，這與古多倍體的γ事件相契合，表明無油樟發(fā)生的全基因組加倍不是特殊的譜系事件，可能是發(fā)生在2個(gè)物種的共同祖先中的，由此推斷無油樟的分化要早于古γ事件。這可能是受無油樟基因組測(cè)序質(zhì)量的影響，并與無油樟是已測(cè)序的最古老的開花植物有關(guān)［4］。

本研究在推測(cè)同源共線片段時(shí)，采用了嚴(yán)格的閾值限制，包括合適的E值、P值、刪除可能的大的重復(fù)基因家族和串聯(lián)重復(fù)基因，同時(shí)區(qū)分同源共線片段的大小，從而保證了研究結(jié)果的可靠性［17－18，20］。本研究結(jié)果表明，在與無油樟的比較分析中，擬南芥和水稻同源共線性區(qū)域以及基因?qū)?shù)都比葡萄少，葡萄基因組所擁有的大片段數(shù)也是最多的，這說明物種基因組的加倍次數(shù)越多，加倍情況越復(fù)雜，所擁有的同源共線區(qū)域以及基因?qū)?shù)就越少，擁有的祖先基因也就越少。同時(shí)，在2個(gè)物種基因組間雙向BLASTp得到的最佳匹配基因在共線基因的保留情況統(tǒng)計(jì)結(jié)果中［19］，發(fā)現(xiàn)葡萄基因組所保留的基因數(shù)最多（50.9%），無油樟與擬南芥、水稻間丟失的無油樟的基因數(shù)最多（73.3%），無油樟與葡萄、水稻間丟失的無油樟的基因數(shù)最少（69.4%），整體來說，保留的無油樟基因數(shù)在1／3左右。本研究結(jié)果表明，在經(jīng)歷了物種基因組各自共有和單獨(dú)加倍事件后，基因組的穩(wěn)定性明顯降低，并伴隨著基因的丟失，而丟失仍將繼續(xù)，該過程大多存在隨機(jī)性。實(shí)際上，從多倍化的推斷、非正常重組的分析、基因家族的進(jìn)化分析等，在很大程度上都依賴于共線性分析，可以說，物種基因組內(nèi)和基因組間共線性分析是比較基因組研究最重要的內(nèi)容之一，是解析基因組結(jié)構(gòu)和功能、研究基因、基因家族，以及調(diào)控路徑等進(jìn)化規(guī)律的重要契機(jī)，對(duì)基因組學(xué)許多研究工作都發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。

參考文獻(xiàn)：

［1］Edger P P，Pires JC.Gene and genome duplications：the impact of dosagesensitivity on the fate of nuclear genes［J］.Chromosome Research，2009，17（5）：699－717.

［2］Otto S P.The evolutionary consequences of polyploidy［J］.Cell，2007，131（3）：452－462.

［3］Lyons E，Pedersen B，Kane J，et al.Finding and comparing syntenic regions among Arabidopsis and the outgroups papaya，poplar，and grape：CoGewith rosids［J］.Plant Physiology，2008，148（4）：1772－1781.

［4］Amborella Genome Project.The Amborella genome and the evolution of flowering plants［J］.Science，2013，342（6165）：1241089.

［5］Chamala S，Chanderbali A S，Der JP，et al.Assembly and validation of the genome of the nonmodel basal angiosperm Amborella［J］.Science，2013，342（6165）：1516－1517.

［6］Rice DW，Alverson A J，Richardson A O，etal.Horizontal transfer of entire genomes via mitochondrial fusion in the angiosperm Amborella［J］.Science，2013，342（6165）：1468－1473.

［7］Tang H B，Bowers JE，Wang X Y，et al.Synteny and collinearity in plant genomes［J］.Science，2008，320（5875）：486－488.

［8］Jaillon O，Aury JM，Noel B，et al.The grapevine genome sequence suggests ancestral hexaploidization in major angiosperm phyla［J］.Nature，2007，449（7161）：463－467.

［9］Vision T J，Brown D G，Tanksley S D.The origins of genomic duplications in Arabidopsis［J］.Science，2000，290（5499）：2114－2117.

［10］Barker M S，Vogel H，Schranz M E.Paleopolyploidy in the Brassicales：analyses of the cleome transcriptome elucidate the history of genome duplications in Arabidopsis and other Brassicales［J］.Genome Biology and Evolution，2009，1（1）：391－399.

［11］Jiao Y N，Leebens－Mack J，Ayyampalayam S，et al.A genome triplication associated with early diversification of the core eudicots［J］.Genome Biol，2012，13（1）：R3.

［12］Kaul S，Koo H L，Jenkins J，Analysis of the genome sequence of the flowering plant Arabidopsis thaliana［J］.Nature，2000，408（6814）：796－815.

［13］Wang X Y，ShiX L，Hao B L，etal.Duplication and DNA segmental loss in the rice genome：implications for diploidization［J］.New Phytologist，2005，165（3）：937－946.

［14］Wang X Y，Shi X L，Li Z，et al.Statistical inference of chromosomal homology based on gene colinearity and applications to Arabidopsis and rice［J］.BMC Bioinformatics，2006，7（1）：447－459.

［15］Altschul S F，Gish W，Miller W，et al.Basic local alignment search tool［J］.Journal of Molecular Biology，1990，215（3）：403－410.

［16］Tang H B，Wang X Y，Bowers J E，et al.Unraveling ancient hexaploidy through multiply－aligned angioserm gene maps［J］.Genome Research，2008，18（12）：1944－1954.

［17］Wang X Y，Wang JP，Jin D C，et al.Genome alignment spanning major Poaceae lineages reveals heterogeneous evolutionary rates and alters inferred dates for key evolutionary events［J］.Molecular Plant，2015，8（6）：885－898.

［18］Wang JP，Yu JX，Sun PC，et al.Comparative genomics analysis of rice and pineapple contributes tounderstand the chromosome number reduction and genomic changes in grasses［J］.Frontiers in Genetics，2016，7：174.

［19］Jiao Y N，Wickett N J，Ayyampalayam S，et al.Ancestral polyploidy in seed plants and angiosperms［J］.Nature，2011，473（7345）：97－100.

［20］Wang X Y，Tang H B，Paterson A H.Seventy million years of concerted evolution of a homoeologous chromosome pair，in parallel，in major Poaceae lineages［J］.Plant Cell，2011，23（1）：27－37.