高鈣含量肽鈣螯合物的制備與表征分析

申勇濤，原愷，霍乃蕊*，程稚玲，韓克光，范華，樊瑋鑫(.山西農業(yè)大學 動物科技學院，山西 太谷 0080；.山西省院士專家服務中心，山西 太原 00000；.山西農業(yè)大學 實驗中心，山西 太谷 0080)

鈣是動物和人體內含量最豐富的無機元素，約占人體質量的1%～2.2%[1]。作為二價礦物營養(yǎng)，Ca2+參與體內骨骼生長、肌肉收縮、神經(jīng)傳導、胞內代謝、心臟功能等許多重要的生理過程[2,3]，是維持機體全面健康的必需常量元素。目前缺鈣依然是全球性營養(yǎng)和健康問題，我國尤為嚴重[4,5]。所以安全、經(jīng)濟、高效補鈣制劑的研發(fā)隨即成為當今社會急需解決的問題。研究表明，肽可增加礦物元素的生物利用度[6,7]，有助于機體對鈣的吸收[8]，因此肽鈣螯合自然成為促進機體對鈣吸收利用的一種有效方法。同為第3代有機鈣產(chǎn)品，肽螯合鈣在制備機制、轉運機制、穩(wěn)定性及溶解性方面顯著優(yōu)于氨基酸鰲合鈣[9]。盡管國內外學者以不同來源的肽來制備肽鈣螯合物，但在優(yōu)化工藝時，幾乎均以螯合率，少數(shù)以螯合物得率為指標，以螯合物中鈣含量為指標的研究極少。作為鈣制劑，除生物利用度外，鈣含量也是考量其品質的一個重要方面，本研究將綜合考慮螯合率、螯合物得率和螯合物中的鈣含量，以羊骨膠原肽和CaCl2為原料制備高鈣含量的肽鈣螯合物，并對其分子量、微觀結構、紅外光譜、氨基酸組成進行分析。為后續(xù)鈣螯合膠原短肽的工業(yè)化生產(chǎn)、作用及機理研究和應用研究提供參考和奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 原料與試劑

羊骨膠原肽：由內蒙古錫盟肽好生物制品責任有限公司生產(chǎn)，pH為6.0～6.8，在水中100%溶解，出廠報告中蛋白質含量(以干基計)為98.78%，水分4.54%，灰分2.87%。鈣指示劑：4.5 g鹽酸羥胺溶解于5 mL蒸餾水，0.5 g鉻黑T溶解于95 mL分析乙醇，兩種溶液混勻后，保存于棕色瓶。雙縮脲試劑：取10 mol·L-1NaOH 溶液10 mL和250 g·L-1酒石酸鉀鈉溶液20 mL加到一定量蒸餾水中，邊攪拌邊緩慢加入40 g·L-1硫酸銅溶液30 mL，定容至1 000 mL。其他試劑有CaCl2、無水乙醇和三乙醇胺等。

1.2 儀器與設備

Neofuge23R型臺式高速冷凍離心機(上海力申)；JDG-0.2型真空冷凍干燥機(蘭州科近)；質譜儀(urfleXtreme MALDI-TOF/TOF)；L-2000型高效液相色譜儀(日立)；Tensor 27型傅里葉變換紅外光譜儀(Bruker)；JEOL JEM-6490LV型掃描電子顯微鏡(日本電子光學)等。

1.3 螯合物制備

工藝路線：膠原肽溶液→加入適量的CaCl2→溶解攪拌→調pH→水浴→旋轉蒸發(fā)儀40～45 ℃濃縮→8倍體積的無水乙醇沉淀3 h→離心(5 000 r·min-1, 10 min)→真空冷凍干燥(溫度為50 ℃，壓強為85～100 Pa)→ 膠原短肽-鈣螯合物。

設定膠原短肽與氯化鈣的質量比分別為l0∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1、35∶1，膠原短肽濃度為60 mg·mL-1，pH8.0，50 ℃螯合40 min，考察螯合率最高時螯合物中的鈣含量。為了得到含鈣量高的肽鈣螯合物，設定肽鈣質量比為1∶1～6∶1，其他條件同上，以螯合率、肽鈣螯合物得率、螯合物中鈣含量為指標，綜合分析，確定較適的肽鈣質量比。其他條件同上，以確定的肽鈣質量比，在pH6～10范圍內確定反應較適pH。以確定的質量比、pH，分別在30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃下螯合，確定較適螯合溫度。同理在20～60 min范圍內，確定較適螯合時間；最后以確定的質量比、pH、溫度和時間，膠原短肽濃度分別為40、60、80、100、120 mg·mL-1，綜合分析三個指標，確定較適的短肽濃度。

1.4 指標測定

以確定的工藝進行肽鈣螯合反應，取5 mL螯合反應液經(jīng)無水乙醇沉淀離心后，取上清液加2 mL的三乙醇胺，調節(jié)pH至12，加入2～3滴鉻黑T指示劑，搖勻，立即用0.1 mol·L-1EDTA溶液滴定，顏色從紫紅色變成純藍色為終點，記錄EDTA的消耗量(mL)，計算出游離鈣含量，并按下面的3個公式分別計算：螯合率/%=(M1-M2)/M1×100；螯合物得率/%=M3/M4×100；螯合物中鈣含量/%=(M1-M2)/M3×100。式中：M1為鈣離子總量/mg，M2為游離鈣質量/mg，M3為肽鈣螯合物質量/mg，M4為反應中加入膠原短肽和CaCl2的總質量。

1.5 肽鈣螯合物分析

掃描電鏡分析：取適量短肽及肽鈣螯合物的凍干粉樣品均勻涂于樣盤雙面膠上，噴金鍍膜處理后放入掃描電鏡抽真空，施加一定電壓后，在設定倍數(shù)下倍下獲取掃描圖像。電鏡掃描條件：高壓15 kV；束流6.9×10-2mA；工作距離16.2 mm。

紅外光譜分析：在4 000～400 cm-1波段內對樣品粉末進行掃描。

飛行質譜分析：用Bruker公司提供的標準品進行校準，由中國醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所完成。

氨基酸組分分析：由山西糧食質量監(jiān)測中心在常壓，22 ℃，40%相對濕度下，依據(jù)GB/T5009.124-2003進行，均為實測值。

1）充氣膜是一種柔性材料，但是在內壓力下，膜內會形成張力剛度，有一定承載力及抗變形能力。膜內壓力在滿足施工期間的變形和施工人員舒適度的要求即可，否則會增加相關造價。充氣膜的變形可以通過找形進行控制，使之變形滿足設計要求。

螯合物中短肽含量的測定：用5%TCA依次配制膠原短肽標準溶液，與雙縮脲試劑反應，顯色后取上清液測OD540值，繪制標準曲線，利用得到的線性方程和雙縮脲反應計算SBCP-Ca中的短肽含量。

溶解度測定：取SBCP-Ca的飽和溶液100 mL，在105 ℃烘箱中烘干至恒重，干燥器中冷卻后稱重，即為溶解度。

2 結果與分析

2.1 肽鈣螯合物制備

由圖1-1可知，當肽鈣質量比為35∶1時，螯合率基本達到最大值73.23%，但此時，螯合物中鈣含量僅為1.26%，而本研究是為了得到含鈣量相對較高的螯合物，因此，除螯合率外，還應兼顧螯合物中的鈣含量以及肽鈣螯合物的得率，并將肽鈣質量比的研究范圍縮小至1∶1～6∶1進行研究。

由圖1-2可得，隨肽鈣質量比的增大，螯合率和螯合物得率相應增加，螯合物中鈣含量卻呈下降趨勢。當肽鈣質量比為1∶1時，螯合物中的鈣含量最高，達10.50%，但螯合率和得率卻最低，故選擇2:l為較適比。此時，鈣含量雖有所下降，但另兩個指標基本接近于最大值，對投入的短肽和CaCl2利用率高。

pH對螫合率、螯合物得率和螯合物中鈣含量有較大影響[10,11]，本研究的pH范圍為6～10，從圖1-3可以看出，隨pH的升高，3個指標均先升高后降低，在pH為8時，螯合率和螯合物中的鈣含量均達到最大值，所以選取螯合pH為8。

膠原短肽與Ca2十的螯合為吸熱反應，適當提高溫度有利于螯合反應的進行。但溫度過高會使螯合鈣分解[12]，使膠原短肽發(fā)生羰氨反應，與Ca2+形成競爭；圖1-4中，在40 ℃時鈣含量和螯合率達到最大值，而肽鈣螯合物得率在30～50 ℃基本相同，故選擇40 ℃為螯合溫度。

由圖1-5可知，3個指標的變化趨勢相同，30 min均達到最大值，因此選擇30 min為反應時間。

由圖1-6可知，短肽濃度為120 g·L-1時，雖然螯合率和得率均為最大值，但螯合物中的鈣含量最低，膠原短肽濃度在80～100 g·L-1范圍內，鈣含量基本達到最大值，此后螯合率沒有顯著性變化，可能是因為反應體系黏度較大，影響了多肽與氯化鈣的接觸，降低了螯合效果[13]，考慮到成本以及為了獲得更多的肽鈣螯合物，本研究最終選取90 g·L-1作為制備條件。

2.2 肽鈣螯合物分析

2.2.1 掃描電鏡結果

在上述確定的較適工藝條件下進行螯合反應，螯合物經(jīng)8倍體積無水乙醇沉淀，真空冷凍干燥后進行掃描電鏡觀察，由圖2可以看出，所制備的高鈣含量的肽鈣螯合物色澤比膠原短肽要深。膠原短肽螯合鈣離子后，由疏松的片狀結構變成了致密顆粒狀物質，說明短肽與鈣之間發(fā)生了螯合。

2.2.2 紅外光譜分析

從圖3可以看出，SBCP-Ca的紅外光譜圖與SBCP波形大致一樣，但發(fā)生了位移，說明螯合后形成了新的化合物。

對紅外光譜圖進一步分析并總結于表1，說明鈣離子主要與短肽游離氨基端的氨基(-NH2)、游離羧基端的羧基(-COOH)以及位于短肽內部的羰基(C=O)發(fā)生結合。并且鈣的結合引起了肽段結構的變化，羧基中的O及氨基中的N是主要配位原子，膠原肽變成了羧酸鹽和銨鹽。

2.2.3 飛行質譜分析

樣品采用基質輔助激光解吸附飛行時間質譜法(MALDI-TOF)測定分子量分布，結果如圖4所示，肽鈣螯合物離子強度最大的主峰所對應的質荷比為2 278.69，此為肽鈣螯合物主成分的精確分子量。螯合反應前的膠原多肽主峰所對應的質荷比為1 230.57。

2.2.4 SBCP-Ca中的膠原短肽、鈣、水分含量及溶解度

根據(jù)制作的骨膠原短肽標準曲線，y=0.101 6x+0.001 5(R2=0.999 5)，計算得出Hi-Ca SBCP-Ca中的膠原短肽含量為68.16%。經(jīng)測定鈣含量為9.81%，水分6.44%，溶解度100%。

2.2.5 氨基酸組分分析

采用高效液相色譜分析法對樣品的氨基酸組成進行分析，結果見表2，在SBCP和SBCP-Ca中均未檢出胱氨酸、組氨酸、酪氨酸和蛋氨酸。除脯氨酸含量在SBCP-Ca中下降外，含量最多的前7種氨基酸相同，且含量變化幅度均不大。

圖1 肽鈣質量比、pH、溫度、螯合時間和短肽濃度對肽鈣螯合相關指標的影響Fig.1 Effect of the ratio of peptide to calcium,pH,temperature and short peptide concentration on chelating related indices

圖2 羊骨膠原短肽與羊骨膠原短肽-鈣螯合物及其掃描電鏡圖片F(xiàn)ig.2 SBCP and high-calcium SBCP-Ca and their SEM pictures

圖3 羊骨膠原短肽與膠原短肽-鈣螯合物紅外光譜圖Fig.3 Infrared spectra of collagen peptides and short peptides with collagen

表1 羊骨膠原短肽與鈣離子螯合前后紅外光譜分析Table 1 Changes of infrared spectra before and after chelating reaction

圖4 羊骨膠原短肽(A)及肽鈣螯合物(B)的飛行質譜圖Fig.4 Time of flight mass spectrometry of SBCP (A) and SBCP-Ca (B)

3 討論

繼無機鈣、有機酸鈣、氨基酸螯合鈣之后的新生代鈣制劑，肽鈣螯合物在制備過程中已經(jīng)完成“食物在胃里消化”、“小腸處氨基酸分泌”、“小腸處螯合反應”，可被小腸直接吸收，因此提高了鈣的生物利用度，且螯合物中的肽也保持了抗氧化活性、免疫增強活性等一些原有的活性，故具有雙重功效。

本研究中當肽鈣質量比在10∶1～35∶1范圍內，螯合率呈上升趨勢，達到最大值73.23%，但螯合物中鈣含量僅為1.26%。且盡管螯合率增加了，但肽沒有被充分利用，造成浪費。為此縮小肽鈣質量比范圍至1∶1～6∶1，結果顯示螯合物中的鈣含量隨著螯合率和得率的增加呈下降趨勢。所以為了得到高鈣含量的肽鈣螯合物，不能單獨以螯合率為指標進行工藝優(yōu)化，需綜合考慮各個指標進行工藝參數(shù)的測定。

表2 氨基酸成分分析/g·100 g-1Table 2 Amino acid composition analysis

由于鈣的摻入，螯合物中的氨基酸含量由原料肽中的85.62 g·100 g-1下降至78.51 g·100 g-1。原料肽和螯合物中的特征性氨基酸基本一樣，甘氨酸為其第一氨基酸，但脯氨酸在螯合物中的含量下降，其機理有待研究。

紅外光譜分析表明螯合反應引起膠原多肽結構的變化，N-Ca取代了N-H，COOH參與了金屬離子的結合形成-COO-Ca，說明肽鏈羧基中的O及氨基中的N是主要配位原子，螯合部位與其他肽鈣螯合物相同[14～16]，形成了羊骨膠原肽羧酸鹽和銨鹽[17]。飛行質譜結果表明原料肽中含量最多的肽分子的荷質比為1 230.57，肽鈣螯合物中的主物質的荷質比則增加至2 278.69。表征分析結果充分說明羊骨膠原肽與鈣之間通過反應形成了新的化合物。

4 結論

綜合考慮螯合率、螯合物中的鈣含量以及螯合物得率，得到高鈣含量肽鈣螯合物的制備工藝。在此工藝下肽鈣螯合形成了新的化合物，該研究結果可為高效、安全有機鈣制劑的工業(yè)化生產(chǎn)提供理論和技術支持。

參 考 文 獻

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