蔣 葛，沈 輝，萬夕和*，喬 毅

(1.江蘇省海洋水產研究所，江蘇南通 226007；2.上海海洋大學水產與生命學院，上海 201306)

急性肝胰腺壞死綜合征(Acute hepatopancreas necrosis syndrome，AHPNS)是近年來影響對蝦養(yǎng)殖最為嚴重的疾病之一。早期該病主要發(fā)生于對蝦苗期，也被稱為早期死亡綜合征(Early mortality syndrome，EMS)。該病的肝胰腺壞死癥狀與對蝦其他早期死亡癥狀明顯不同，聯(lián)合國糧農組織和亞太地區(qū)水產養(yǎng)殖聯(lián)盟(NACA)將之命名為急性肝胰腺壞死綜合征(Acute hepatopancreas necrosis syndrome，AHPNS)。

1 凡納濱對蝦AHPNS流行病學

2009年，AHPNS首先在我國海南省暴發(fā)，越南、馬來西亞、泰國、菲律賓相繼暴發(fā)該病[1-2]。2011年，越南受該病影響區(qū)域超過68%；我國福建、廣東及廣西等省份因AHPNS病情影響，凡納濱對蝦產量下降80%以上；2012年，泰國凡納濱對蝦產量也因該病影響而減半[3]。2013年，太平洋東岸的墨西哥西北部地區(qū)也受到該病的影響[4]。我國華東、華北地區(qū)凡納濱對蝦主產地關于AHPNS的相關報道較少，影響程度相對低于華南地區(qū)。

凡納濱對蝦發(fā)生AHPNS后體色發(fā)白，蝦殼變軟，攝食明顯減少，活力減弱，行動遲緩，少數(shù)對蝦體表出現(xiàn)黑斑；肝胰腺顏色暗淡蒼白或糜爛發(fā)紅，部分對蝦的肝胰腺明顯萎縮或者異常肥大，空腸空胃。苗種投放10 d就可發(fā)病死亡,瀕死蝦很少出現(xiàn)在池邊或水面。

迄今為止，AHPNS只發(fā)生于凡納濱對蝦、斑節(jié)對蝦和中國明對蝦。已有的研究顯示，在凡納濱對蝦蝦苗、幼蝦階段等都能檢測到病原的存在。但近幾年來，AHPNS的發(fā)生季節(jié)不明顯，放苗60 d后常有發(fā)生。高溫季節(jié)、放養(yǎng)密度高等對蝦發(fā)病率較高，養(yǎng)殖集中區(qū)域發(fā)病率較高，單養(yǎng)池塘的對蝦患病機率和受影響程度均高于混養(yǎng)池塘。

2 病原

2.1 AHPNS病原

有關對蝦AHPNS病原的研究報道較多，已有的研究結果認為，一類攜帶有特定致病基因的弧菌是該病發(fā)生的病原，其中主要是副溶血性弧菌。藻毒素、對蝦種質下降和環(huán)境因子等外界因子可促使對蝦發(fā)生AHPNS。

Tran L等[1]對從越南AHPNS發(fā)病蝦池中分離出1株哈維氏弧菌(Vibrioharveyi)，浸泡感染后對蝦病死率達100%，死亡對蝦的臨床癥狀與病理組織學變化與AHPNS典型癥狀完全相同。Joshi J等[3]從泰國病蝦中分離出數(shù)株副溶血性弧菌，肌注感染對蝦，其中一組24 h內100%死亡，死亡個體病理組織學變化與AHPNS病蝦相同。而另一組48 h后才出現(xiàn)死亡，所有菌株檢測均為陽性。Liu L等[5]在上海的AHPNS發(fā)病蝦池中分離出1株歐文斯氏弧菌(Vibrioowensii)，認為該菌株為AHPNS致病菌株。Xuan D等[6]認為從病蝦體內分離的1株坎氏弧菌可導致AHPNS的發(fā)生。

2.2 AHPNS致病弧菌的毒力因子

副溶血性弧菌是AHPNS的主要致病菌，也是一種人漁共患的致病菌，溶血素是其主要致病因子，包括耐熱性直接溶血素(thermostable direct hemolysin，TDH)、相對耐熱直接溶血毒素( TDH-related hemolysin，TRH) 、不耐熱性溶血素 (thermolabile hemolysin，TLH)等，以TDH和TRH為主。Soto-rodriguez S A等[3]和Joshi J等[4]研究發(fā)現(xiàn)，所分離的發(fā)生AHPNS的副溶血性弧菌(VPAHPNS)泰國和墨西哥株均攜帶TLH，不攜帶TDH和TRH，這與副溶血性弧菌主要人類臨床致病菌株表型不一致，分析認為該種副溶血性弧菌導致人蝦共患疾病的可能性很小。Moonyoung將副溶血性弧菌的環(huán)境株、臨床株以及AHPNS株型分別感染凡納濱，發(fā)現(xiàn)AHPNS株型組24 h對蝦致死率達100%，環(huán)境株與臨床株組96 h致死率僅為0和30%，表明AHPNS株型毒力更強。同時發(fā)現(xiàn)AHPNS株型增殖時間比其他株型更快。Joshi J等[3]應用特異性基因標記技術在4株VPAHPNS中發(fā)現(xiàn)依賴卵磷脂溶血素(LDH)的存在。

Tang K F J等[7]對蝦VPAHPNS中獲得3個毒素復合物(TC)類似物的基因，其中富含GC區(qū)的結構命名為tc-GIvp，它可編碼調節(jié)因子及毒素，是VPAHPNS所特有。Han J E等[8]于VPAHPNS菌株中發(fā)現(xiàn)了一段69 kb大小的隱藏質?！皃VA1”，非VPAHPNS菌株中均沒有發(fā)現(xiàn)，分析認為該隱藏質粒可能編碼了VPAHPNS的毒力因子。

Tran L等[1]利用VPAHPNS菌液上清肛門注射感染后，對蝦也表現(xiàn)出AHPNS的臨床癥狀，表明該菌株胞外產物具有高毒力。Sirikharin R等[9]純化VPAHPNS的菌液上清用來感染健康對蝦，48 h內引起健康對蝦極高的死亡率，SDS瓊脂糖凝膠電泳發(fā)現(xiàn)兩段分子質量分別為12 ku和50 ku的蛋白PirA、PirB。

Lee C T等[10]研究發(fā)現(xiàn)，VPAHPNS產生的二元毒素結構與蘇云金芽胞桿菌所產生的伴孢晶體結構相似，毒力效應也與蘇云金芽胞桿菌Cry蛋白毒力作用相似，都表現(xiàn)為插入宿主細胞膜上形成穿模孔洞，細胞內外滲透壓發(fā)生改變，使靶細胞損傷甚至死亡。將編碼兩者效應蛋白的序列進行比對后同源性不到10%，但是卻與發(fā)光桿菌屬、短桿菌屬編碼二元蛋白質毒素序列的同源性最為相近。

Lee將接合缺少PirvpAB操縱子的pVA1-like質粒的VP菌株進行回歸感染試驗，結果未出現(xiàn)感染現(xiàn)象，進一步證明了PirA和PirB是AHPNS發(fā)生的主要毒力因子的觀點。Lee C T等[10]認為PirA和PirB單獨作用都可以致使健康對蝦出現(xiàn)AHPNS的臨床癥狀，當對蝦肝胰腺檢出PirB時，肝胰腺同時出現(xiàn)了明顯的病變。Han J E等[11]在從AHPNS病蝦體內分離出PirvpAB (+)型副溶血性弧菌2株，PirvpAB(+)坎氏弧菌4株，PirvpAB(-)型副溶血性弧菌3株，PirvpA(-)型副溶血性弧菌3株，對上述菌株進行毒力驗證，發(fā)現(xiàn)PirvpAB(-)型與PirvpA(-)型菌株并不具有毒力,這表明VP僅含有PirB基因時，并不具有致病力。

Han J E等[8]在菌株VPAHPNS13-028/A3確認含有69 kb 的質粒pVpA3-1，其GC含量為5.9%。編碼PirA和PirB的類pir A和pir B基因位于pVpA3-1 3.5 kb片段以內，GC含量為 38.2%，遠低于質粒其余片段,可能是后天獲得。Lee在質粒pVA1的序列中發(fā)現(xiàn)其含有質粒轉移基因簇和pndA相移鍵控系統(tǒng)，這可能與該質粒的水平基因轉移有關。Han J E等[11]發(fā)現(xiàn)PirvpAB基因與同一質粒上的一段插入序列組成一個復合轉座子Tn6264，該插入序列與轉座子ISVal1同源性相近。Han認為可能有某種攜帶Tn6264的未知細菌通過質粒接合等途徑將Tn6264轉移至弧菌基因組中，并且迅速轉移擴散。

VPAHPNS對凡納濱對蝦的免疫調控具有一定的影響。Ponprateep S等[12]研究發(fā)現(xiàn)，凡納濱對蝦感染VPAHPNS早期，體內一種多功能巨球蛋白LvA2M表達受到抑制，酚氧化還原酶表達量持續(xù)上升，LvA2M對酚氧化還原酶基因的表達有一定調控作用。

3 病理學

有關對蝦AHPNS病理學方面的研究主要集中在病理組織學方面。凡納濱對蝦發(fā)生AHPNS后肝胰腺組織儲存脂肪的細胞囊泡數(shù)量明顯降低，細胞分泌活動減少，分泌細胞退化，胚胎細胞有絲分裂減少，壞死的細胞從肝胰腺腎小管基底膜掉入消化腔和腸道；肝胰腺中央?yún)^(qū)域的分泌細胞、纖維細胞和吸收細胞排列紊亂，并向外側蔓延；細胞核發(fā)生不同程度的腫大；組織間隙出現(xiàn)大量的紅細胞[13]。AHPNS病蝦腸壁變薄，腸腔變小，腸黏膜脫落，腸內無食物或糞便，中腸管壁細胞出現(xiàn)自溶現(xiàn)象[14]。有關對蝦發(fā)生AHPNS的細胞病理學研究尚未見報道。

4 檢測技術

副溶血性弧菌是一種常見的海水細菌，可通過TCBS瓊脂等選擇培養(yǎng)基來實施檢測。但引起AHPNS的弧菌株只是其中攜帶特定致病基因的一小部分菌株。因此，通過細菌培養(yǎng)進行該病的檢測有時無法實現(xiàn)。目前，該病的診斷方法以普通PCR、環(huán)介導等溫擴增技術及實時熒光定量PCR為主。

4.1 普通PCR

2013年，F(xiàn)legel 與Lo首次公布了檢測VPAHPNS的AP1、AP2兩種引物(表1)[15]。Sirikharin R等[16]驗證發(fā)現(xiàn)AP2占有優(yōu)勢。后續(xù)研究中致病因子PirA和PirB被發(fā)現(xiàn)，相應編碼基因片段ToxA、ToxB測序分析工作完成，靈敏度更高的檢測方法也相繼被開發(fā)出來(表2)。Sirikharin等根據(jù)ToxA設計了AP3一步PCR檢測法。Soto-rodriguez S A等[3]比較認為，AP3方法更為科學。

2014年，一種套式PCR檢測技術AP4被開發(fā)出來，Dangtip S等[17]應用104份對蝦樣品對AP4方法進行驗證，準確達100%，最低DNA檢測限可至100 fg，靈敏度比AP3提高 100倍。

表1 基于PCR檢測的AP1和AP2 兩種引物

表2 幾種引物設計基于ToxA、ToxB的PCR檢測技術

4.2 環(huán)介導等溫擴增

Kongrueng J等[19]以PirvpAB-like基因(AB972427.1)為目的基因設計了4對引物，識別并擴增目的基因上的6個區(qū)域，以副溶血性弧菌的管家基因tox-R作為內參基因，成功區(qū)別了AHPNS陰性、陽性菌株。使用Tinwongger設計的PCR方法作為對照，核酸靈敏度低至1 pg。

4.3 實時熒光定量PCR

Han J E等[20]以pirA-like為目的基因設計了TaqMan探針，建立了一種VPAHPNS定量PCR檢測方法，目的片段為135 bp。通過構建pirA-like的標準質粒制作標準曲線，越南病蝦最高檢出每mg病蝦含有5.8×105拷貝，中國病蝦樣品最高檢出每mg 含1.5×104拷貝，死亡對蝦上檢出范圍為1.8×103拷貝～4.7×106拷貝，發(fā)病池水樣每mL檢出范圍為3.5×102拷貝～2.2×106拷貝，該法最低靈敏度為10個拷貝，對于環(huán)境樣品的定量檢測和研究具有重要意義。

5 AHPNS的防控

5.1 選擇健康蝦苗

選擇不攜帶病原的種蝦和健康蝦苗是防控對蝦AHPNS關鍵措施之一。2016年，張娜等[21]使用AP3、AP4等PCR檢測方法對進口凡納濱對蝦親蝦進行AHPNS病原檢測，可有效排除存在AHPNS病原的陽性種蝦。為了培育優(yōu)質的SPF蝦苗，應當在源頭上嚴格把關。選擇豐年蟲、沙蠶等生物餌料也應進行檢疫，減少攜帶病原的生物餌料給種蝦或對蝦苗種帶來的風險。

5.2 維護養(yǎng)殖環(huán)境

大多數(shù)發(fā)病池塘存在養(yǎng)殖密度過高、過度投喂、H2S濃度偏高、過度使用生石灰、缺乏蓄水池等現(xiàn)象，建議應加強管理，外源水須在蓄水池進行暴曬、曝氣處理。周邊一旦暴發(fā)AHPNS，換水必須嚴格操作。

王磊等[22]從對蝦養(yǎng)殖水體和對蝦腸道中分離篩選出3株兼具除氮能力的副溶血性弧菌拮抗菌，添加于含有一定量副溶血性弧菌菌液的對蝦養(yǎng)殖水體，蝦存活率達35%，可很好地調節(jié)養(yǎng)殖生態(tài)系統(tǒng)。Ching S等[23]開發(fā)一種包含黏土、酵母和功能性氨基酸等黏土復合物，可吸附細菌產生的胞外產物，減低VPAHPNS對養(yǎng)殖對蝦的影響，但未見更多的有關推廣應用的報道。

5.3 餌料控制技術

張盛靜等[24]在飼料中添加地衣芽胞桿菌和枯草芽胞桿菌，可提高凡納濱對蝦的抗感染能力，酚氧化酶原、溶菌酶等表達量上升。姜禮燔等[25]從中藥成分中篩選出一種NO前體，認為對病原的滅活水平超過氟苯尼考，對于AHPNS的防治具有重要意義。

5.4 科學的投喂方式

應根據(jù)對蝦生長情況，適時地調整投喂量，避免過度投喂。過度投喂不僅會浪費飼料，污染水質，而且增加對蝦消化系統(tǒng)負擔，使對蝦長期處于亞健康狀態(tài)。在陰雨天、急劇降溫或升溫、pH變化劇烈、發(fā)生肝胰腺病變、出現(xiàn)白便、水體有泡沫或有異味、倒藻等情況下，應減料或停料。

5.5 藥物防治

許多學者對藥物防治AHPNS進行了積極有效的探索。Supungul P等[26]從中國明對蝦體內分離到一種具有抗脂多糖活性的重組蛋白rALFPm3，對于VPAHPNS具有良好的抗菌活性，最低抑菌濃度為1.25 μmol/L～5.00 μmol/L，rALFPm3可以引起VPAHPNS產生細胞畸變和空泡。Tinh T H等[27]從芒果和柑橘類植物中提取了一類多酚類物質——焦培酸，可以抑制VPAHPNS，MIC為32 μg/mL～64 μg/mL。Junprung W等[28]將感染VPAHPNS的對蝦暴露于非致死性熱休克蛋白HSP70和HSP90中，試驗組存活率提高50%以上。

5.6 生物防治

2014年，Tran L H等[29]研究了對蝦與羅非魚混養(yǎng)來防治AHPNS的技術。研究認為，羅非魚具有保持微生物群體平衡的能力，在生態(tài)系統(tǒng)中，病原菌沒有繁殖的機會，細菌密度在一個比較安全的水平，另外，羅非魚的存在能有效幫助微生物系統(tǒng)應對突然變化，降低發(fā)病率。在蝦塘中低密度放養(yǎng)羅非魚，控制底棲藻類，清理塘底，清除死蝦去除病原。Jin W J等[30]篩選得到了1株噬菌體pVp-1，能夠對22株VPAHPNS中的20株產生明顯的抑制作用。

6 結語

對蝦急性肝胰腺壞死綜合征是近年來對蝦養(yǎng)殖中危害最為嚴重的疾病之一，并且出現(xiàn)逐年嚴重的趨勢。目前亞洲和中南美洲地區(qū)都出現(xiàn)了嚴重的AHPNS病情，建議應重視進口種蝦和所培育苗種的病原檢測工作，應用現(xiàn)代生物技術開發(fā)對該病防治的產品，加強基于生態(tài)養(yǎng)殖的防控技術研發(fā)和應用，以減少該病的發(fā)生。

參考文獻：

[1] Tran L,Nunan L,Redman R M,et al.Determination of the infectious nature of the agent of acute hepatopancreatic necrosis syndrome affecting penaeid shrimp.[J].Dis Aquat Org,2013,105(1):45-55.

[3] Joshi J,Srisala J,Truong V H,et al.Variation inVibrioparahaemolyticus,isolates from a single Thai shrimp farm experiencing an outbreak of acute hepatopancreatic necrosis disease (AHPNS)[J].Aquaculture,2014,s 428-4429(s 428-429):297-302.

[4] Soto-rodriguez S A,Gomezgil B,Lozanoolvera R,et al.Field and experimental evidence ofVibrioparahaemolyticusas the causative agent of acute hepatopancreatic necrosis disease of cultured shrimp (Litopenaeusvannamei) in Northwestern Mexico.[J].Appl Environ Microbiol,2015,81(5):1689-1699.

[5] Liu L,Xiao J,Xia X,et al.Draft genome sequence ofVibrioowensiistrain SH-14,which causes shrimp acute hepatopancreatic necrosis disease[J].Genome Announc,2015,3(6):e01395-1415.

[6] Xuan D,Wang H,Xie G,et al.An isolate ofVibriocampbelliicarrying the pirVP gene causes acute hepatopancreatic necrosis disease[J].Emerg Microbes Infec,2017,6(1):e2.

[7] Tang K F J,Lightner D V.Homologues of insecticidal toxin complex genes within a genomic island in the marine bacteriumVibrioparahaemolyticus[J].FEMS Microbiol Lett,2014,361(1):34-42.

[8] Han J E,Mohney L L,Tang K F J,et al.Plasmid mediated tetracycline resistance ofVibrioparahaemolyticus,associated with acute hepatopancreatic necrosis disease (AHPNS) in shrimps[J].Aquac Rep,2015,2:17-21.

[9] Sirikharin R,Taengchaiyaphum S,Sanguanrut P,et al.Characterization and PCR detection of binary,pir-like toxins fromVibrioparahaemolyticusisolates that cause acute hepatopancreatic necrosis disease (AHPNS) in shrimp.[J].PLoS One,2015,10(5):219-220.

[10] Lee C T,Chen I T,Yang Y T,et al.Correction for Lee et al.The opportunistic marine pathogenVibrioparahaemolyticusbecomes virulent by acquiring a plasmid that expresses a deadly toxin.[J].P Nati Acad Sci,2015,112(39):798-803.

[11] Han J E,Tang K F J,Aranguren L F,et al.Characterization and pathogenicity of acute hepatopancreatic necrosis disease natural mutants,pir AB vp,(‐)V.parahaemolyticus,and pir AB vp,(+)V.campbellii,strains[J].Aquaculture,2017,470:84-90.

[12] Ponprateep S,Vatanavicharn T,Chu F L,et al.Alpha-2-macroglobulin is a modulator of prophenoloxidase system in pacific white shrimpLitopenaeusvannamai[J].Fish Shellfish Immun,2017,62:68-74.

[13] Flegel T W.Historic emergence,impact and current status of shrimp pathogens in Asia[J].J Invertebr Pathol,2012,110(2):166-173.

[14] 蘇樹葉.凡納濱對蝦“早期死亡綜合癥”的初步研究[D].海南?？冢汉Ｄ洗髮W,2013.

[15] NACA.Acute hepatopancreatic necrosis disease card (updated June 2014) [EB/OL].Network of Aquaculture Centres in Asia-Pacific (NACA) (www.enaca.org),2014.

[16] Sirikharin R,Taengchaiyaphum S,Sritunyalucksana K,et al.A new and improved PCR method for detection of AHPNS bacteria [EB/OL].Network of Aquaculture Centres in Asia-Pacific (NACA) (http://www.enaca.org/modules/news/article.php?article-id=2030).2014.

[17] Dangtip S,Sirikharin R,Sanguanrut P,et al.AP4 method for two-tube nested PCR detection of AHPNS isolates ofVibrioparahaemolyticus[J].Aquac Rep,2015,2:158-162.

[18] Tinwongger S,Proespraiwong P,Thawonsuwan J,et al.Development of PCR diagnosis for shrimp acute hepatopancreatic necrosis disease (AHPNS) strain ofVibrioparahaemolyticus[J].Fish Pathol,2014,49(4):159-164.

[19] Kongrueng J,Tansila N,Mitraparp-Arthorn P,et al.LAMP assay to detectVibrioparahaemolyticuscausing acute hepatopancreatic necrosis disease in shrimp[J].Aquacult Int,2015,23(5):1-10.

[20] Han J E,Tang K F J,Pantoja C R,et al.qPCR assay for detecting and quantifying a virulence plasmid in acute hepatopancreatic necrosis disease (AHPNS) due to pathogenicVibrioparahaemolyticus[J].Aquaculture,2015,442:12-15.

[21] 張 娜,王津津,謝艷輝,等.進口南美白對蝦親蝦急性肝胰腺壞死病的檢測分析[J].中國動物檢疫,2016,33(7):90-94.

[22] 王 磊,王志杰,高 戈,等.一株兼具氨氮去除能力和對副溶血弧菌拮抗作用的有益菌的篩選及其初步應用[J].漁業(yè)科學進展,2016(3):79-84.

[23] Ching S,Chi F,Cravens R.Use of a clay product to decrease the effects of bacterial disease in shrimp:,WO 2016019343 A1[P].2016.

[24] 張盛靜,宋曉玲,趙小金,等.飼料中添加益生菌對凡納濱對蝦抗感染和5種免疫基因表達的影響[J].水產學報,2015,39(6):899-907.

[25] 姜禮燔,許云萍,吳 敏.中藥一氧化氮NO復合劑在防控對蝦肝胰腺壞死癥中應用[J].當代水產,2015(4):76-78.

[26] Supungul P, Jaree P, Somboonwiwat K, et al.A potential application of shrimp antilipopolysaccharide factor in disease control in aquaculture[J].Aquac Res,2017,48(3):1775-1779.

[27] Tinh T H,Nuidate T,Vuddhakul V,et al.Antibacterial activity of pyrogallol,a polyphenol compound againstVibrioparahaemolyticusisolated from the central region of Thailand[J].Procedia Chem,2016,18:162-168.

[28] Junprung W,Supungul P,Tassanakajon A.HSP70 and HSP90 are involved in shrimpPenaeusvannameitolerance to AHPNS-causing strain ofVibrioparahaemolyticusafter non-lethal heat shock.[J].Fish Shellfish Immun,2016, 60:237-246.

[29] Tran L H，F(xiàn)itzsimmons K M，Lightner D V .Tilapia could enhance water conditions,help control EMS in shrimp ponds[J].Global Aquac A,2014(Jan/Feb):26-28.

[30] Jin W J,Han J E,Tang K F J,et al.Potential application of bacteriophage pVp-1:Agent combatingVibrioparahaemolyticus,strains associated with acute hepatopancreatic necrosis disease (AHPNS) in shrimp[J].Aquaculture,2016,457:100-103.