陳代武

(邵陽學(xué)院 藥學(xué)院，湖南邵陽，422000)

白藜蘆醇(Resveratrol，簡寫為Res)，化學(xué)名:3，4'，5－三羥基二苯乙烯，為非黃酮類多羥基和苯乙烯結(jié)構(gòu)化合物，廣泛存在于多種植物體內(nèi)，在葡萄和葡萄酒中含量較高［1］，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)Res具有多種藥理活性，是細胞內(nèi)有效的氧化劑，對氧化DNA的損害具有保護作用［2］，能抗腫瘤，降血壓，抗細菌和真菌感染，影響胃酸分泌等;對人的皮膚真菌和皮膚細菌具有抑制作用［3－7］。目前，Res引起了廣大學(xué)者們的極大關(guān)注。納米材料可用于生物檢測和疾病診斷，也可作為藥物載體［8－10］，碳納米管(carbon nanotubes簡寫為CNTs)具有很高的化學(xué)穩(wěn)定性和很大的表面積，可以作為細胞內(nèi)蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運和抗癌藥物的載體［11］。小分子與蛋白質(zhì)的作用可以提供相關(guān)藥物結(jié)合的特征及藥物療效的影響。由于血清蛋白中含有酪氨酸(Tyr)或色氨酸(Trp)和苯丙氨酸(Phe)等殘基，這些殘基都具有特殊的光學(xué)性質(zhì)，因此分子間的相互作用常用光學(xué)技術(shù)來監(jiān)測，這種方法簡單，靈敏度高。牛血清白蛋白(Bovine Serum Albumin，簡寫為BSA)作為應(yīng)用于研究蛋白質(zhì)的代表物［12］，被廣泛地應(yīng)用于蛋白質(zhì)與其他化合物配合的熒光光譜法分析，但未查到碳納米粒子存在時Res與牛血清白蛋白結(jié)合的熒光光譜法研究，因此，本研究采用熒光光譜法研究Res與牛血清白蛋白結(jié)合及共存納米粒子的影響具有一定的研究意義，對了解藥物吸收、代謝、藥理機理及藥物改良和研發(fā)具有參考作用。

1 材料與方法

1.1 試劑與設(shè)備

BSA(Sigma，MW=68000)，Res(長沙艾茵生物制品有限公司)，0.1mol·L－1磷酸鹽緩沖溶液(簡 稱 PBS，pH=7.4)，CNTs(多壁，直徑約 20nm，純度＞95%，深圳市納米港有限公司)，實驗用水為MilliQ超純水，NaH2PO4，Na2HPO4，Na2SO4，氯金酸，檸檬酸三鈉硼氫化鈉，所有試劑為分析純。

F4500熒光分光光度計(Hitachi，日本)，Tu－1221紫外－可見分光光度計(北京普析通用儀器有限公司)，pHS－3C pH計(上海雷磁儀器廠)，SigmaPlot V2.0科學(xué)繪圖軟件。

1.2 實驗方法

分別量取緩沖溶液3.0mL至1cm大小的不同熒光比色皿中，用微量注射器加入一定量的樣品液，配成多個不同濃度的待測溶液。每次測量前樣品要求充分反應(yīng)，至少放置10min以上，Res的激發(fā)/發(fā)射波長分別為326/410nm，BSA的激發(fā)/發(fā)射波長分別為282/345nm，測試BSA的狹縫寬度均為5nm，Res的狹縫寬度為10nm，光電倍增管電壓為700 V，在300－550nm范圍內(nèi)記錄室溫下的熒光光譜。

2 結(jié)果與討論

2.1 Res和BSA的熒光光譜及紫外吸收光譜

圖1為pH=7.20，λex=282nm時Res對BSA的熒光猝滅光譜，從圖1可以看出:Res使BSA的熒光減弱，發(fā)生了顯著的猝滅作用，說明Res與BSA之間有較強的結(jié)合和能量的變化，所有曲線都相交在410nm，證實Res與BSA相互作用形成了結(jié)合物，說明BSA熒光的猝滅依靠BSA與Res的相互作用形成絡(luò)合物所致。由圖1看出Res只引起B(yǎng)SA的最大發(fā)射波長輕微移動，說明在此條件下Res并沒有引起B(yǎng)SA構(gòu)象顯著變化。

圖1 0.1mol·L－1PBS中Res對 BSA熒光光譜的影響Fig.1 Effect of resveratrol on the fluorescence quenching of BSA under the condition of 0.1mol·L－1 PBS.c(resveratrol)/10－6mol·L－1，a to e:0.00，1.00，2.00，5.00，7.00

圖2是BSA和Res及二者混合后的紫外吸收光譜譜圖。從圖中可以看出，三者在200～240nm之間均有較強的吸收，BSA的吸收峰位于206nm，Res的吸收峰位于214nm，二者混合物的吸收峰位于220nm，且Res和BSA混合液的吸光度遠遠大于Res和BSA的吸光度。同時Res在310nm處有一個較強的吸收峰，混合物在280nm處有一個較弱的吸收峰，而BSA沒有。三者吸收曲線的不同說明Res和BSA之間有強烈的相互作用，生成了配合物。

圖2 BSA和Res的紫外吸收光譜Fig.2 UV absorbance spectra of BSA and Res(a)2.00×10－6mol·L－1BSA in the presence of 2.00×10－6mol·L－1resveratrol;(b)5.00×10－6mol·L－1resveratrol;(c)5.00×10－6mol·L－1BSA

2.2 Res和BSA配合物的熒光光譜

根據(jù)2.1我們知道，Res與BSA能相互作用形成配合物，且該配合物在410nm處有熒光發(fā)射，從圖3(b)發(fā)現(xiàn)在Res中加入不同濃度BSA時，配合物的熒光強度隨BSA濃度的增加而增加，圖3(a)為減去BSA的熒光背景下的配合物的熒光光譜圖，可以發(fā)現(xiàn)其熒光光譜強度小很多，但其熒光強度也隨BSA濃度的增加而增大，這是由于Res與BSA作用不斷形成配合物。

圖3 在1.00×10－6molL－1Res溶液中加入不同濃度的BSA溶液的熒光光譜圖，圖a為消除BSA熒光背景的Res與BSA混合物的熒光光譜圖，圖b是分別加入濃度為0.00，2.00 5.00，10.0，20.0，40.0，60.0，80.0，100.0，120.0，130.0×10－6molL－1BSA 的 Res熒光光譜圖(從下至上)Fig.3 Fluorescence intensity of BSA in the presence of 1.00×10－6molL－1Res.(λex=326nm).The concentrations of the added BSA were 0.00，2.00 5.00，10.0，20.0，40.0，60.0，80.0，100.0，120.0，130.0 × 10－6mol· L－1respectively(from bottom to top)at 298K.(a)subtract the BSA fluorescence background from the mixture fluorescence versus cBSA curves，(b)Fluorescence intensity of Res with different concentrations of BSA

2.3 金納米粒子和碳納米管對BSA和Res的熒光猝滅效應(yīng)

圖4和圖5分別為不同濃度AuNP或CNTs的BSA的熒光光譜圖，從圖4和圖5看出:在BSA溶液中加入AuNP和CNTs時，BSA的熒光強度都發(fā)生改變，隨著納米粒子的濃度增大，BSA熒光強度降低，由此證明AuNP和CNTs對BSA的熒光具有猝滅效應(yīng)。Res在326nm光的激發(fā)下，在410nm左右有較強的熒光信號，同理AuNP和CNTs同樣對Res的熒光具有猝滅效應(yīng)。

猝滅過程一般使用 Stern－Volmer方程來描述［12－14］:

式中F0和F分別加入AuNP和CNTs等猝滅劑前后的BSA或Res熒光強度，kq為兩種相互作用分子的表觀猝滅常數(shù)，τ0為納米粒子不存在時熒光分子的平均壽命，［Q］為猝滅劑CNTs和AuNP溶液的濃度，ksv為猝滅常數(shù)，且kq和ksv之間關(guān)系為:

圖4 在2.00"mol·L－1BSA中加入不同濃度CNTs的熒光光譜圖(cCNTs0.00，7.00，15.00，25.00，40.00，55.00，70.00"mol·L－1從上至下)Fig.4 Fluorescence spectra of 2.00"mol·L－1 BSA in 0.1mol·L－1PBS with different concentrations of CNTs

圖5 在2.00"mol·L－1BSA中加入不同濃度AuNP 的熒光光譜圖(cAuNP:0.00，7.00，15.00，25.00，40.00，55.00，70.00"mol·L－1，從上至下)Fig.5 Fluorescence spectra of 2.00"mol·L－1 BSA in 0.1mol·L－1PBS with different concentrations of AuNP

圖6為CNTs猝滅BSA(a)和Res(b)熒光的Stern－Volmer曲線，圖7為AuNP猝滅BSA(a)和Res(b)熒光的Stern－Volmer曲線，用F0/F對濃度［Q］作圖，將實驗數(shù)據(jù)代入擬合而得一直線，求出圖6和圖7中直線的斜率得到猝滅常數(shù)(ksv)和相關(guān)系數(shù)(r)列于表1。因生物大分子熒光壽命約為10－8s［14］，根據(jù)式(2)可以求出他們的表觀猝滅常數(shù)(kq)也列入表1，從表1可看出表觀猝滅常數(shù)均大于猝滅常數(shù)，故屬于形成復(fù)合物的靜態(tài)猝滅，服從Lineweaver－ Burk 方程［13］:

圖6 CNTs猝滅BSA(a)和Res(b)熒光的Stern－Volmer曲線Fig.6 Stern－Volmer curves of BSA(a)and resveratrol(b)fluorescence quenched by CNTs

圖7 AuNP猝滅BSA(a)和Res(b)熒光的Stern－Volmer曲線Fig7 Stern－Volmer curves of BSA(a)and resveratrol(b)fluorescence quenched by AuNP

表1 CNTs和AuNP與BSA和Res作用時的ksv和kq值Table 1 ksvand kqvalues of the interaction of CNTs or AuNP with BSA or Res

式中 Kx為結(jié)合常數(shù)，同理，根據(jù)式(3)進行實驗數(shù)據(jù)處理，將(F0－F)－1對［Q］－1做圖得圖8和圖9，再從圖8和圖9求出直線的斜率，根據(jù)斜率和F0可求得結(jié)合常數(shù)Kx(結(jié)果見表2)。可見在常溫下CNTs和AuNP能與BSA和Res有效結(jié)合，因此CNTs和AuNP可以作為Res與BSA相互作用的載體。

圖8 CNTs猝滅BSA(a)和Res(b)熒光的Lineweaver－Burk 圖Fig.8 Lineweaver－Burk curves of the BSA(a)and resveratrol(b)fluorescence quenched by CNTs

圖9 AuNP猝滅BSA(a)和Res(b)熒光的Lineweaver－Burk 圖Fig.9 Lineweaver－Burk curves of the BSA(a)and resveratrol(b)fluorescence quenched by AuNP

表2 CNTs和AuNP與BSA和Res作用時的Kx值Table 2 Kxvalues for interactions of CNTs+BSA or Res and AuNP+BSA or Res

2.4 同步熒光光譜法研究CNTs、AuNP和Res對BSA構(gòu)象的影響

在同步熒光中，在Δλ=60nm和Δλ=15nm時分別表現(xiàn)出色氨酸殘基(Trp)和酪氨酸殘基(Tyr)的特征熒光光譜，因此根據(jù)最大發(fā)射波長的改變可判斷蛋白質(zhì)構(gòu)象的變化。

在CNTs和AuNP存在下，BSA的同步熒光光譜見圖10，從圖10看出:在BSA溶液中加入CNTs和AuNP時，BSA的熒光強度減小，表明對BSA具有猝滅效應(yīng)，在猝滅過程中，色氨酸殘基的最大發(fā)射波長發(fā)生了較小的改變，從圖中看到稍有藍移，表明色氨酸殘基所處的環(huán)境發(fā)生改變，疏水性增加，由此證明CNTs和AuNP引起B(yǎng)SA構(gòu)象的變化。

圖10 CNTs對BSA分子的Trp(a)和AuNp對BSA分子的Trp(b)的同步熒光光譜及l(fā)og(F0－F)/F與logc的擬合曲線(c):(1:AuNP+Trp，2:CNTs+Trp)Fig.10 The synchronous fluorescence spectra and log(F0－F)/F versus logc curves of tryptophan residuals of BSA with CNTs(a)and AuNP(b)，(c)curves(1:AuNP+Trp，2:CNTs+Trp)

圖11為Res對BSA影響的同步熒光光譜圖，隨Res濃度增大，BSA的熒光強度減小，表明BSA中的酪氨酸和色氨酸殘基熒光均被猝滅，酪氨酸殘基(290nm左右)和色氨酸殘基(350nm左右)的最大發(fā)射波長均略有藍移，表明Trp和Tyr的疏水性增加，酪氨酸和色氨酸殘基所處環(huán)境發(fā)生變化，因此Res也能引起B(yǎng)SA的構(gòu)象變化。

圖11 Res對BSA分子的Tyr(a)和Trp(b)的同步熒光光譜及l(fā)og(F0－F)/F與logc的擬合曲線(c)(1.Res－Trp，2:Res+Tyr)Fig.11 The synchronous fluorescence spectra of Tyr(a)and Trp(b)of BSA with resveratrol and log(F0－F)/F versus logc curves of tryptophan residuals(c)(1:resveratrol－Trp，2:resveratrol+Tyr)

從同步熒光光譜可以看到(見圖11)，在BSA中加入Res后，與熒光光譜的實驗相同，Res與BSA中的Tyr和Trp作用時也有一個很好的交點，同樣證明Res能和BSA發(fā)生反應(yīng)形成配合物。

2.5 同步熒光光譜法求算K及n

根據(jù)同步熒光研究發(fā)現(xiàn):CNTs和AuNP不改變BSA分子中酪氨酸殘基的熒光，只改變色氨酸殘基的熒光，而Res對BSA中的酪氨酸和色氨酸殘基熒光都發(fā)生了改變，說明CNTs和AuNP只與BSA中的Trp殘基作用，可能是因為BSA分子的Trp靠近BSA分子表面，而Tyr一般都處于蛋白質(zhì)分子內(nèi)部［14］，又因為CNTs和AuNP的大小與蛋白質(zhì)分子接近，故只能與蛋白質(zhì)分子表面的Trp作用。而Res分子較小，可以插入到分子內(nèi)部與BSA分子中的酪氨酸和色氨酸作用。

在同步熒光光譜中，根據(jù)熒光強度的變化數(shù)據(jù)，利用用靜態(tài)猝滅公式，可以求出CNTs、AuNP、Res與BSA分子中酪氨酸和色氨酸作用的結(jié)合常數(shù)K和結(jié)合位點數(shù)n。

表3為同步熒光法測得的Res與BSA的Trp或Tyr殘基作用的K和n，從表3可以看出:Res與BSA中的氨基酸殘基的結(jié)合常數(shù)大于CNTs和AuNP的結(jié)合常數(shù)，且結(jié)合的位點數(shù)大，說明Res和BSA的結(jié)合能力強，在納米粒子存在下不會影響Res與BSA的結(jié)合，因此，當使用CNTs和AuNP作為載體時，不會影響小分子和蛋白質(zhì)的結(jié)合。由表3發(fā)現(xiàn)Res與Trp的作用比與Tyr的作用強，結(jié)合的位點數(shù)大，可能是與Trp處于蛋白質(zhì)的表面，作用的機會比Tyr大的緣故。

表3 同步熒光法測得的Res與BSA的Trp或Tyr殘基作用的K和nTable 3 The K and n values of the interactions of Res with Tyr or Trp residuals of BSA by synchronous fluorescence

3 結(jié)論

當Res和BSA混合時，Res和BSA的熒光光譜和紫外吸收光譜都發(fā)生改變，通過對Res和BSA混合液的熒光光譜與BSA的熒光光譜的比較，證明了Res與BSA之間能相互作用并形成了配合物。CNTs、AuNP對Res和BSA具有熒光猝滅效應(yīng)，根據(jù)熒光猝滅原理，求出了CNTs和AuNP與Res和BSA的結(jié)合常數(shù)，結(jié)果表明CNTs和AuNP可以作為Res與BSA相互作用的載體;同時采用了同步熒光光譜法，利用Lineweaver－Burk方程求算了CNTs(或AuNP)與Trp/BSA)和Res與Trp/BSA(或Tyr/BSA)的結(jié)合常數(shù)K和配位數(shù)n，研究結(jié)果表明CNTs和AuNP主要與BSA表面附近的Trp殘基作用，不與分子內(nèi)部的Tyr殘基作用，而Res可與Trp和Trp兩種殘基結(jié)合，且Res與Trp的結(jié)合比與Tyr的結(jié)合強;Res與BSA中的氨基酸殘基的結(jié)合常數(shù)大于CNTs和AuNP的結(jié)合常數(shù)，若使用CNTs和AuNP作為載體，不會影響Res和BSA之間的相互作用。

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