王 婧 王 敏 范玉敏 王 燕

(甘肅中醫(yī)藥大學(xué)繼續(xù)教育學(xué)院,甘肅 蘭州 730000)

研究發(fā)現(xiàn)，下呼吸道病原菌定植可能是導(dǎo)致慢性阻塞性肺病(COPD)患者氣道生理功能失調(diào)和炎癥反應(yīng)的主要原因〔1〕。肺泡巨噬細(xì)胞是介導(dǎo)COPD氣道炎癥的主要細(xì)菌之一，其分泌出的細(xì)胞因子可調(diào)控局部免疫反應(yīng)，在炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用〔2〕。TLR4是肺泡巨噬細(xì)胞表面病原菌識別受體，被激活后可啟動MyD88依賴的信號通路，激活核因子(NF)-κB、MAPKs，引發(fā)炎癥反應(yīng)，在免疫屏障和氣道炎癥中發(fā)揮關(guān)鍵作用〔3〕。萊菔硫烷是從十字花科植物中提取的成分，具有抗癌、抗感染作用，可抑制NF-κB通路活化，可能對COPD的炎癥反應(yīng)有抑制作用〔4〕。COPD患者肺功能偏低，難以通過支氣管肺泡灌洗獲取肺泡巨噬細(xì)胞，而外周血單核細(xì)胞源性巨噬細(xì)胞的生物學(xué)功能與其相似，可替代肺泡巨噬細(xì)胞作為體外研究模型〔5〕。本次研究采用外周血單核細(xì)胞源性巨噬細(xì)胞探討TLR-MyD88信號通路在COPD中的作用及萊菔硫烷的抗感染效果。

1 對象與方法

1.1研究對象 選取2016年1～12月酒泉市人民醫(yī)院住院患者中COPD穩(wěn)定期患者64例為COPD組，男44例，女20例，年齡57～89歲，平均(72.69±7.01)歲；中度44例、重度14例、極重度6例。選取同年齡段肺功能正常的體檢者60名為非COPD組，男40名，女20名，年齡58～77歲，平均(70.05±5.69)歲。本研究通過醫(yī)院倫理委員會審批，入選患者均簽署知情同意書。

1.2主要試劑 DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基、集落刺激因子、胰蛋白酶購于上?；鄯f生物科技有限公司；萊菔硫烷購于上海賓智生物科技有限公司；TLR4、MyD88 PCR擴增引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成；兔抗人Tlr4多克隆抗體、鼠抗人MyD88多克隆抗體、鼠抗人β-actin抗體、辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗兔IgG和羊抗鼠IgG購于上海遠(yuǎn)慕生物科技有限公司。

1.3巨噬細(xì)胞培養(yǎng)及鑒定 抽取兩組受試者空腹外周靜脈血15 ml，抗凝處理后梯度離心分離單核細(xì)胞，按4×109/L密度接種到24孔板中，CO2孵箱中常規(guī)培養(yǎng)2 h，收集貼壁細(xì)胞放入含終濃度為3 μg/L集落刺激因子的DMEM完全培養(yǎng)基，置于37℃ CO2孵箱中培養(yǎng)10 d。取對數(shù)期單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，胰酶消化后，2 000 r/min離心10 min，棄去上清，滴加AO/EB溶液懸浮細(xì)胞，熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。同時采用流式細(xì)胞術(shù)檢測單個核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞表面CD14表達(dá)情況。

1.4分組與干預(yù) 將COPD組的巨噬細(xì)胞分4組：空白對照組、脂多糖組(終濃度為1 mg/L的脂多糖干預(yù))、萊菔硫烷組(終濃度為30 μmol/L的萊菔硫烷干預(yù))、聯(lián)合干預(yù)組(終濃度為1 mg/L的脂多糖和30 μmol/L的萊菔硫烷聯(lián)合干預(yù))，干預(yù)時間根據(jù)基因、蛋白檢測的不同分為12 h和36 h。非COPD組巨噬細(xì)胞不給予任何干預(yù)，細(xì)胞密度4×106/L。

1.5實時熒光定量PCR檢測 提取巨噬細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA。TLR4上游引物：5′-TCCTACTACGGTCCTCCTAC-3′，下游引物：5′-AGTCCAGGTCCAAGAACGG-3′，擴增長度182 bp；MyD88上游引物：5′-TCGGTCCGACCTCGTTCCAT-3′，下游引物：5-CCGTCGATTTACGGAGTTCT-3′，擴增長度85 bp；內(nèi)參GADPH上游引物：5′-CGTGGCAGTTCCGACTCTTG-3′，下游引物：5′-ACCACTTCTGCGGTCACCTA-3′，擴增長度127 bp。擴增條件：95℃ 30 s，95℃ 5 s，60℃ 30 s，共40個循環(huán)，延伸72℃ 5 s，55℃ 20 s。2-△△Ct法檢測TLR4、MyD88基因表達(dá)情況。

1.6Western印跡檢測 提取細(xì)胞總蛋白，測定濃度后取50 μg樣品行10%十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳，重復(fù)2次，濕法轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯(PVDF)，室溫下脫脂奶粉封閉1 h，滴加兔抗人TLR4多克隆抗體(1∶1 000)、鼠抗人MyD88多克隆抗體(1∶1 000)，內(nèi)參為鼠抗人β-actin抗體(1∶500)，4℃孵育過夜，滴加HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG(1∶2 000)、羊抗鼠IgG(1∶2 000)，室溫下反應(yīng)2 h。電化學(xué)發(fā)光法(ECL)顯色，檢測各特異性條帶灰度值。

1.7酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)法檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清液中腫瘤壞死因子(TNF)-α、白細(xì)胞介素(IL)-6濃度 收集各組巨噬細(xì)胞培養(yǎng)液上清，-80℃保存待測，ELISA試劑盒檢測TNF-α、IL-6濃度，操作嚴(yán)格按試劑盒說明書進(jìn)行。

1.8統(tǒng)計學(xué)分析 應(yīng)用SPSS6.0軟件進(jìn)行t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察及流式細(xì)胞術(shù)鑒定 外周血單核細(xì)胞體積較小，呈圓形，細(xì)胞核位于中央；集落刺激因子作用后細(xì)胞體積明顯增加，多為圓形，少數(shù)周邊有板形突起，顆粒較多，呈現(xiàn)巨噬細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征。見圖1。流式細(xì)胞術(shù)檢測顯示，外周血單核細(xì)胞中CD14表達(dá)量為(89.61±5.97)%，明顯高于巨噬細(xì)胞中的(42.15±9.30)%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，說明單核細(xì)胞成功誘導(dǎo)為巨噬細(xì)胞。

2.2各組巨噬細(xì)胞TLR4、MyD88 mRNA表達(dá)情況 非COPD組、空白對照組、脂多糖組、萊菔硫烷組、聯(lián)合干預(yù)組TLR4 mRNA相對表達(dá)量分別為：1.00±0.00、3.65±0.49、5.69±0.95、1.34±0.52、3.10±0.61；MyD88 mRNA相對表達(dá)量分別為：1.00±0.00、1.87±0.30、3.31±1.75、1.15±0.52、1.62±0.81?；A(chǔ)狀態(tài)下COPD組巨噬細(xì)胞中TLR4、MyD88 mRNA表達(dá)水平均明顯高于非COPD組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；COPD組巨噬細(xì)胞經(jīng)脂多糖刺激后，TLR4、MyD88 mRNA表達(dá)水平明顯高于空白對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；萊菔硫烷組、聯(lián)合干預(yù)組TLR4、MyD88 mRNA表達(dá)水平明顯低于脂多糖組和空白對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。萊菔硫烷組TLR4、MyD88 mRNA表達(dá)水平與非COPD組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

2.3各組巨噬細(xì)胞TLR4、MyD88 蛋白表達(dá)情況 非COPD組、空白對照組、脂多糖組、萊菔硫烷組、聯(lián)合干預(yù)組TLR4蛋白相對表達(dá)量分別為：0.37±0.05、0.56±0.13、0.76±0.17、0.36±0.10、0.44±0.21；MyD88 蛋白相對表達(dá)量分別為：0.69±0.35、1.22±0.76、1.75±0.71、0.73±0.45、0.88±0.36。COPD組巨噬細(xì)胞中TLR4、MyD88 蛋白表達(dá)水平均明顯高于非COPD組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；脂多糖組TLR4、MyD88 蛋白表達(dá)水平明顯高于空白對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；萊菔硫烷組、聯(lián)合干預(yù)組TLR4、MyD88 蛋白表達(dá)水平明顯低于脂多糖組和空白對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。萊菔硫烷組TLR4、MyD88 蛋白表達(dá)水平與非COPD組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見圖2。

圖1 熒光顯微鏡下觀察單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征(×400)

1.非COPD組；2.空白對照組；3.脂多糖組；4.萊菔硫烷組；5.聯(lián)合干預(yù)組圖2 各組巨噬細(xì)胞TLR4、MyD88 蛋白電泳

2.4各組巨噬細(xì)胞TNF-α、IL-6分泌情況 非COPD組、空白對照組、脂多糖組、萊菔硫烷組、聯(lián)合干預(yù)組巨噬細(xì)胞培養(yǎng)液上清中TNF-α濃度(μg/L)分別為：20.15±3.09、32.90±5.61、48.77±5.37、21.64±4.25、32.98±4.33；IL-6濃度(μg/L)分別為：32.91±5.47、44.12±5.69、55.71±6.35、28.68±4.80、34.16±5.49。COPD患者TNF-α、IL-6濃度均明顯高于非COPD組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；脂多糖組TNF-α、IL-6濃度明顯高于空白對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；萊菔硫烷組、聯(lián)合干預(yù)組TNF-α、IL-6濃度明顯低于脂多糖組和空白對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；萊菔硫烷組TNF-α、IL-6濃度與非COPD組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

3 討 論

COPD患者下呼吸道存在多種微生物定植，可引發(fā)持續(xù)的氣道炎癥反應(yīng)，其中肺泡巨噬細(xì)胞發(fā)揮重要作用。肺泡巨噬細(xì)胞具有包括抗原呈遞、調(diào)節(jié)炎性因子分泌、吞噬在內(nèi)的多種生物學(xué)功能〔6〕。激活肺泡巨噬細(xì)胞可釋放大量炎性因子及蛋白酶，同時匯聚炎癥細(xì)胞，參與炎性反應(yīng)、組織損傷及修復(fù)。相關(guān)研究顯示，COPD患者肺泡巨噬細(xì)胞吞噬細(xì)菌功能障礙，是下呼吸細(xì)菌定植的主要誘因〔7〕。單核細(xì)胞源性巨噬細(xì)胞在表型和生理功能方面與肺泡巨噬細(xì)胞相似，可作為肺泡巨噬細(xì)胞研究模型。本次研究通過流式細(xì)胞術(shù)檢測顯示，外周血單核細(xì)胞表面CD14表達(dá)水平較高，誘導(dǎo)成巨噬細(xì)胞后CD14表達(dá)水平明顯下降，結(jié)合熒光顯微鏡下形態(tài)學(xué)觀察，提示成功誘導(dǎo)為巨噬細(xì)胞。

TLR4作為膜識別受體，多表達(dá)于免疫細(xì)胞、上皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞，其中以巨噬細(xì)胞和樹突細(xì)胞最為多見，脂多糖是TLR4的主要配體。配體激活TLR4后，可經(jīng)MyD88依賴途徑傳導(dǎo)，激活I(lǐng)L-1、TNF-6受體相關(guān)因子，介導(dǎo)炎性因子轉(zhuǎn)錄。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，脂多糖刺激氣道上皮細(xì)胞中TLR4表達(dá)，是COPD發(fā)病的主要因素之一〔5〕。脂多糖可通過TLR-MyD88信號通路提高大鼠肺泡巨噬細(xì)胞中IL-6、TNF-α等細(xì)胞因子水平，在肺炎的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮調(diào)控作用〔8〕。本研究提示COPD患者氣道可能在定植菌長期刺激下，巨噬細(xì)胞經(jīng)表面TLR4識別MyD88信號通路，誘發(fā)炎癥反應(yīng)并維持炎癥狀態(tài)。脂多糖刺激后，TLR4、MyD88 mRNA和蛋白表達(dá)水平和TNF-α、IL-6分泌量均增加，提示脂多糖刺激經(jīng)TLR-MyD88信號通路加重炎癥反應(yīng)，該信號通路可能參與COPD的炎癥過程。

萊菔硫烷易溶于水，存在于甘藍(lán)、西蘭花、蘿卜等十字花科蔬菜的根、莖、種子中，可誘發(fā)腫瘤細(xì)胞凋亡和清除，具有抗癌作用，是癌癥治療研究的新熱點。近年來研究發(fā)現(xiàn)，萊菔硫烷還具有較強的抗炎、抗氧化作用，可通過抑制小鼠前B細(xì)胞中TLR4聚集，抑制炎癥反應(yīng)〔9〕。本研究提示萊菔硫烷可通過抑制TLR-MyD88信號通路減少下游炎性因子的釋放并發(fā)揮抗感染作用。

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