梁文懂，羅 春，張海祿，張春桃

(1.武漢科技大學(xué)煤轉(zhuǎn)化與新型炭材料湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢,430081; 2. 中國(guó)科學(xué)院蘇州納米技術(shù)與納米仿生研究所，江蘇 蘇州,215123)

異煙肼(Isoniazid，INZ)是目前廣泛用于各型肺結(jié)核治療的首選藥物[1]，水溶性好(183 mg/mL, pH=7.5)[2]，但在用藥時(shí)會(huì)引起諸多不良反應(yīng)，特別是生成大量親電子基、氧自由基等活性代謝產(chǎn)物，耗竭肝內(nèi)谷胱甘肽(GSH)，造成肝損傷[3]，嚴(yán)重時(shí)甚至導(dǎo)致必須停止用藥[4]。柚皮素(Naringenin，NAR) 是一種黃酮類(lèi)天然產(chǎn)物，能夠抑制脂肪肝形成過(guò)程中自由基的產(chǎn)生，增強(qiáng)對(duì)Hep G2細(xì)胞氧化應(yīng)激的緩解作用，減弱肝損傷[5]，并可使CCl4所致急性肝損傷過(guò)程中的氧化應(yīng)激反應(yīng)減輕,顯著降低肝細(xì)胞核DNA單鏈斷裂氧化損傷水平[6]，因而有望在降低肝損傷方面得到應(yīng)用。但由于柚皮素的溶解度很低(46±6 μg/mL，298 K)，客觀上導(dǎo)致其生物利用度相當(dāng)?shù)蚚7-8]。

近年來(lái)，藥物共晶在改善藥物的理化性質(zhì)方面得到了廣泛應(yīng)用[9]。藥物共晶可在不改變藥物分子結(jié)構(gòu)的同時(shí)，改善藥物的理化性質(zhì)，因而在藥物研發(fā)中具有很高的應(yīng)用價(jià)值。柚皮素的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)均適宜與異煙肼形成共晶，有鑒于此，本文通過(guò)混懸法制備了異煙肼-柚皮素的藥物-藥物共晶，考察了柚皮素的多羥基結(jié)構(gòu)與異煙肼上的吡啶氮和酰肼基團(tuán)間的氫鍵作用，確定了共晶中異煙肼和柚皮素的比例，測(cè)定了原料以及共晶的表觀平衡溶解度，分析了共晶產(chǎn)物中異煙肼和柚皮素平衡溶解度的變化對(duì)肝損傷以及對(duì)護(hù)肝作用的影響，以期為解決異煙肼所導(dǎo)致的肝損傷問(wèn)題提供借鑒，并為異煙肼的共晶研究提供參考。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 試劑和儀器

異煙肼 (純度不低于98%)；柚皮素(純度不低于97%)；甲醇、乙醇、甲苯、乙腈(分析純)。德國(guó)Bruker公司D8 ADVANCE粉末X射線(xiàn)衍射儀；美國(guó)TA Instruments公司Q2000差示掃描量熱儀；美國(guó)Thermo Fisher傅里葉變換紅外光譜儀；美國(guó)Varian公司Varian 400液態(tài)核磁共振儀；德國(guó)Bruker公司ADVANCEⅢ-500固態(tài)核磁共振儀；美國(guó)Wtaers2535高效液相色譜儀，PDA檢測(cè)器；RC-6溶出度測(cè)試儀。

1.2 共晶的制備

分別稱(chēng)量137 mg異煙肼和272 mg柚皮素于20 mL凍干瓶中，加入5 mL甲醇/甲苯(體積比為1∶1)混合溶劑作為混旋液，在室溫下磁力攪拌72 h后離心分離，除去上層清液，下層離心產(chǎn)物置于烘箱中，40 ℃烘干12 h即得共晶樣品。

1.3 共晶的分析與表征

粉末X射線(xiàn)衍射(XRPD)：銅靶作為X射線(xiàn)源，工作電壓40 V,電流40 A，粉末樣品的掃描步長(zhǎng)為0.02°，掃描角度范圍為3°～40°，每步停留時(shí)間17s；差示掃描量熱(DSC)：N2流速50.0 mL/min，加熱速率5 ℃/min；傅里葉變換紅外光譜(FTIR)：粉末樣品用溴化鉀壓片后測(cè)試，掃描波數(shù)范圍為400～4000 cm-1，掃描次數(shù)100，分辨率4 cm-1；固態(tài)核磁共振(SSNMR)：在11.7 T的場(chǎng)強(qiáng)下，用4 mm雙共振魔角旋轉(zhuǎn)探頭采集固態(tài)下13C的交叉極化/魔角(CP/MAS)譜圖，譜圖采集條件：旋轉(zhuǎn)速度為8 kHz MAS，接觸時(shí)間為2 ms，13C化學(xué)位移參考值為四甲基硅烷(TMS,δ=0)；液態(tài)核磁共振(LNMR)：取5 mg左右樣品溶解于氘代二甲基亞砜后進(jìn)行掃譜，以四甲基硅烷(TMS，δ=0)為內(nèi)標(biāo)。

1.4 表觀平衡溶解度測(cè)試

分別稱(chēng)量20 mg柚皮素、2000 mg異煙肼以及500 mg共晶樣品，置于10 mL凍干瓶中，分別加入5 mL、 pH=1.2的鹽酸溶液(模擬胃液)和pH=6.8的磷酸緩沖液(模擬腸液)。通過(guò)熱臺(tái)精確控溫到37 ℃，并控制磁力攪拌轉(zhuǎn)速為350 rpm，連續(xù)攪拌72 h后，抽取懸濁液，采用0.22 μm 的水系濾膜過(guò)濾并立刻用超純水稀釋。其中，柚皮素樣品稀釋5倍，異煙肼樣品稀釋1000倍，共晶樣品稀釋100倍。稀釋液通過(guò)高效液相色譜檢測(cè)其濃度。色譜條件為：固定相，C18反相柱(GraceSmart RP C18，4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動(dòng)相，甲醇-水(體積比為1∶1)，流速為1 mL/min,柱溫37 ℃。每個(gè)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行3次取平均值。未溶解的殘?jiān)ㄟ^(guò)濾紙過(guò)濾收集，經(jīng)40 ℃烘箱干燥，通過(guò)粉末XRD確定其物相組成。

2 結(jié)果與分析

2.1 XRPD分析

原料異煙肼、柚皮素和共晶產(chǎn)物的XRPD圖譜如圖1所示。由圖1可見(jiàn)，共晶的XRPD譜圖在2θ為4.34°、8.60°、21.64°、26.70°等處出現(xiàn)新的特征峰，其中柚皮素在15.82°、17.28°、20.04°、22.46°、23.83°、24.57°、25.51°、27.82°等處的主峰都消失，異煙肼在11.92°、14.28°、15.61°、16.79°、25.26°、26.20°等處的主峰幾乎全部消失，由此可見(jiàn)柚皮素和異煙肼之間確實(shí)形成了共晶。

圖1 異煙肼、柚皮素和共晶的粉末XRD圖譜

2.2 DSC分析

原料異煙肼、柚皮素和共晶產(chǎn)物的DSC譜圖如圖2所示。異煙肼和柚皮素的熔點(diǎn)分別為173.3 ℃和254.1 ℃，混懸產(chǎn)物的熔點(diǎn)為227.4 ℃，不同于任何一種原料，表明該產(chǎn)物為完全不同于原料的新相，這是典型的共晶形成的熱力學(xué)標(biāo)志。共晶的DSC只有一個(gè)特征熔融峰并沒(méi)有原料的熔融峰，表明通過(guò)混懸制備的共晶樣品晶相很純。

圖2 異煙肼、柚皮素和共晶的DSC圖譜

2.3 FTIR分析

圖3 異煙肼、柚皮素和共晶的FTIR圖譜

2.4 SSNMR分析

通過(guò)密度泛函理論(DFT)計(jì)算，對(duì)兩種原料和共晶的SSNMR圖譜中碳峰進(jìn)行了歸屬，結(jié)果如圖4所示。由圖4可以看出，共晶中的每個(gè)碳峰均為單峰，說(shuō)明在一個(gè)不對(duì)稱(chēng)單元里Z′=1，表明共晶的摩爾計(jì)量比為1∶1。異煙肼原料中酰肼基C(11)的化學(xué)位移為166.62，在形成共晶后變?yōu)?169.18，吡啶氮兩側(cè)的C(14)、C(15)的化學(xué)位移則由149.19、151.42合并為共晶后的148.51；柚皮素在δ為166.86、165.31、153.41處的峰分別歸屬于C(5)、C(7)和C(4)的碳峰，在形成共晶后化學(xué)位移分別變?yōu)?69.18、163.75、158.02。這些碳原子化學(xué)環(huán)境變化表明，異煙肼上的酰肼基和吡啶氮與柚皮素O(4)H、O(5)H、O(3)H三個(gè)羥基之間形成新的氫鍵作用，這與FTIR的結(jié)果一致。

圖4 異煙肼、柚皮素和共晶的13C固態(tài)核磁共振圖譜

Fig.4CP/MASTOSSNMRspectraofINZ,NARandcocrystal

2.5 LNMR分析

液態(tài)核磁共振氫譜是確定共晶分子間計(jì)量比最直觀且有效的方法。異煙肼、柚皮素和共晶的LNMR氫譜如圖5所示。圖5中，RI表示氫峰的相對(duì)積分面積；NH表示異煙肼或柚皮素的各氫原子數(shù)目。由圖5可見(jiàn)，共晶LNMR氫譜中的氫峰是兩種原料氫峰的疊加，柚皮素與異煙肼的摩爾計(jì)量比為1∶1，與固態(tài)核磁共振所得出的結(jié)果相一致。

圖5 異煙肼、柚皮素和共晶的液態(tài)核磁共振氫譜

2.6 表觀平衡溶解度分析

異煙肼、柚皮素以及共晶在模擬生理液中的表觀平衡溶解度如圖6所示。由圖6(a)可見(jiàn)，在pH=1.2的鹽酸溶液和pH=6.8的磷酸緩沖液中，異煙肼的平衡溶解度分別為264 mg/mL和190 mg/mL，溶解度太大，容易在代謝過(guò)程中產(chǎn)生過(guò)量的親電子基、氧自由基，人體沒(méi)有足夠谷胱甘肽(GSH)與之結(jié)合解毒，這正是其造成肝損傷的重要原因。異煙肼在與柚皮素形成共晶以后，在兩種pH值條件下其溶解度分別減小到20.8 mg/mL和0.74mg/mL，分別降低為原來(lái)的7.9%和0.39%，意味著在同等給藥條件下，異煙肼的肝損傷會(huì)大大減小。由圖6(b)可見(jiàn)，柚皮素在與異煙肼形成共晶以后，在pH=1.2的介質(zhì)中，其平衡溶解度從0.044 mg/mL提高到0.064 mg/mL；在pH=6.8的介質(zhì)中，則由0.061 mg/mL提高到0.227mg/mL，分別提高到原來(lái)的1.45倍和3.72倍。柚皮素溶解度的提高意味著其清除自由基和親電子基的能力的提高，從而提高護(hù)肝的功效。異煙肼、柚皮素和共晶溶解前后的粉末XRD圖譜如圖7所示。由圖7可以看出，異煙肼和柚皮素在兩種介質(zhì)中達(dá)到溶解平衡后的殘?jiān)詾樵袭悷熾潞丸制に?，沒(méi)有發(fā)生相轉(zhuǎn)化；圖7(a)顯示，共晶在pH=1.2介質(zhì)中部分發(fā)生了裂解，殘?jiān)屑扔泄簿?，也有柚皮素；圖7(b)則表明，在pH為6.8的介質(zhì)中，共晶沒(méi)有發(fā)生裂解，殘?jiān)廊皇枪簿А?/p>

(a)異煙肼INZ

(b)柚皮素NAR

Fig.6ApparentequilibriumsolubilityofINZ,NARandcocrystal

(a)pH=1.2

(b)pH=6.8

Fig.7XRPDpatternsofINZ,NARandcocrystalbeforeandafterdissolutionexperiment

3 結(jié)論

(1)選用柚皮素作為共晶前驅(qū)體，以甲醇和甲苯的混合溶劑作為混旋懸液，可制備得到異煙肼-柚皮素的藥物-藥物共晶，共晶產(chǎn)物中異煙肼與柚皮素的摩爾比為1∶1，異煙肼的酰肼基團(tuán)和吡啶氮與柚皮素上三個(gè)羥基形成了氫鍵。

(2)在pH值為1.2和6.8的兩種模擬生理

液中，共晶產(chǎn)物中柚皮素相比純柚皮素的平衡溶解度分別提升到原料的1.45倍和3.72倍，而共晶產(chǎn)物中異煙肼的平衡溶解度分別為純異煙肼的7.9%和0.39%，表明在同等給藥量的條件下，柚皮素的抗氧化、清除自由基、保肝護(hù)肝功效得到提高，同時(shí)異煙肼所致的肝損傷也會(huì)大幅減低，這種共同作用能夠進(jìn)一步強(qiáng)化保肝護(hù)肝的功效，藥理作用明顯。

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