陳忠秋,馮 濤,莊海寧*,楊 焱,張勁松
(1.上海應(yīng)用技術(shù)大學(xué)香料香精技術(shù)與工程學(xué)院,上海 201418;2.上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所,農(nóng)業(yè)部南方食用菌資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,國家食用菌工程技術(shù)研究中心,上海市農(nóng)業(yè)遺傳育種重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室,上海 201403)
香菇是一種重要的食藥兩用菌,不僅具有獨(dú)特的香氣,鮮美的味道,并且具有極高的營養(yǎng)價(jià)值。香菇干品的主要成分為碳水化合物(58%~60%)、蛋白質(zhì)(20%~23%)、膳食纖維(9%~10%)、脂類(3%~4%)以及灰分(4%~5%)[1]。香菇被認(rèn)為是藥物、營養(yǎng)品和藥妝品開發(fā)的天然來源。香菇中的β-葡聚糖被認(rèn)為是最有潛力的活性成分之一。有研究表明,香菇粗多糖中含有大約27.19%的β-葡聚糖,是豐富的β-葡聚糖的來源[2]。香菇β-葡聚糖(Lentinus edodes β-glucan,LEBG)的主要成分為β-1,3-葡聚糖[3]。β-葡聚糖具有免疫活性、抗腫瘤活性[4]、放射防護(hù)性能[5]、抗氧化活性[6]和肝臟保護(hù)活性[7]。
隨著人口老齡化以及人們生活習(xí)慣、飲食習(xí)慣的改變,與飲食密切相關(guān)的代謝類疾病(如糖尿病等)的發(fā)病率逐年上升。據(jù)世界衛(wèi)生組織報(bào)道,全世界范圍內(nèi)至少有3億人正在遭受糖尿病帶來的痛苦,而中國糖尿病患者已達(dá)1億[8]。淀粉廣泛存在于食物中,其消化性會直接影響到機(jī)體的餐后血糖水平添加。根據(jù)其消化速率和程度,淀粉通常分為快速消化淀粉(rapidly digestible starch,RDS)、緩慢消化淀粉(slowly digestible starch,SDS)和抗性淀粉(resistant starch,RS)[9]。加拿大學(xué)者Jenkins提出血糖指數(shù)預(yù)測值(predicted glycemic index,pGI)概念,根據(jù)其對餐后血糖的影響,將不同的富含碳水化合物的食物進(jìn)行了分類[10]。因此,食品可以分為3 類:低pGI、中pGI和高pGI。研究表明SDS、RS可以提高對胰島素的敏感性并調(diào)節(jié)身體的血糖平衡。此外,它還可以改善餐后飽腹感,減少身體的熱量攝入。另外還可以防止腸道疾病、糖尿病、肥胖癥等慢性疾病的發(fā)生。攝入高水平的SDS不會產(chǎn)生高血糖和胰島素反應(yīng)[11]。Puls等[12]從小麥中分離得到β-葡聚糖為一種α-淀粉酶抑制劑,能降低淀粉的消化速率。張宇[13]在研究燕麥β-葡聚糖對淀粉體外消化影響實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),燕麥β-葡聚糖能夠延緩淀粉的消化,并且隨著燕麥β-葡聚糖分子質(zhì)量和溶液濃度的增加,其延緩淀粉消化的效果越好,表現(xiàn)為慢消化淀粉增加。
在本研究中,從香菇中提取LEBG,并將LEBG添加到兩種淀粉中,將其糊化后對其流變學(xué)特性進(jìn)行檢測,并研究LEBG對兩種淀粉的體外消化的影響。本研究旨在為LEBG應(yīng)用于淀粉基質(zhì)食品以及降血糖食品的開發(fā)提供理論依據(jù)。
香菇子實(shí)體 上海百信生物科技有限公司;小麥淀粉 山東渠風(fēng)食品科技有限公司;玉米淀粉 山東大宗玉米淀粉公司。
胃蛋白酶(EC 3.4.23.1,51 U/mg)、轉(zhuǎn)化酶(EC 3.2.1.26,300 U/mg)、淀粉轉(zhuǎn)葡糖苷酶(EC 3.2.1.3,21.1 U/mg)、α-淀粉酶(EC 3.2.1.1,19.6 U/mg)、熒光染料FITC 美國Sigma公司;葡萄糖測定試劑盒 上海榮盛生物藥業(yè)有限公司;葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品南京建成生物工程研究所;普魯蘭標(biāo)準(zhǔn)品(shodex standard p-82) 昭和電工株式會社;苯酚、無水葡萄糖、濃硫酸、三氟乙酸、乙醇、鹽酸、乙酸(均為分析純) 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。
電熱鼓風(fēng)干燥箱、電熱恒溫振蕩水槽 上海一恒科學(xué)儀器有限公司;臺式高速冷凍離心機(jī) 湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司;紫外分光光度計(jì) 尤尼柯(上海)儀器有限公司;旋渦混合儀 海門市其林貝爾儀器制造有限公司;高效液相排阻色譜與多角度激光光散射分析儀、示差折光儀聯(lián)用系統(tǒng)(high-performance sizeexclusion chromatography coupled with multi-angle laser light scattering-refractive index,HPSEC-MALLS-RI)(由Waters 2414示差檢測器、Waters 2695高效液相色譜泵配以串聯(lián)的凝膠色譜柱TSK PWXL6000 和TSKPWXL400、Waters 717 plus自動進(jìn)樣器和氦-氖激光光源的八角度激光光散射檢測器組成) 美國Wyatt公司;紅外光譜儀賽默飛世爾科技有限公司;共聚焦激光掃描顯微鏡(配備有兩個空氣冷卻激光器Ar和He/Ne的TCS SP2 AOBS)德國Leica Microsystem Heidelberg GmbH公司。
1.3.1 LEBG的提取及基本的組分測定
圖1 LEBG的提取Fig. 1 Flow chart of LEBG extraction
參照Zhuang Haining等[14]提取β-葡聚糖的實(shí)驗(yàn)方法,按照圖1的提取流程進(jìn)行LEBG的提取,具體操作為:稱取200 mg干香菇,按料液比1∶15(g/mL)加入蒸餾水,浸泡0.5 h;煮沸后100 ℃浸提2 h,濾布過濾,將濾渣進(jìn)行第2次浸提,操作同上;將2 次得到的濾液混合,濃縮后,濃縮液于25 ℃、10 000 r/min離心25 min,轉(zhuǎn)移上清液至燒杯,在4 ℃冰箱中存放12 h;在4 ℃、10 000 r/min離心25 min后得到部分沉淀;用20%的乙醇溶液醇洗沉淀;每次清洗后,在3 ℃、10 000 r/min離心15 min,得到離心后的沉淀;重復(fù)醇洗4~5 次,直至得到比較透明純凈的沉淀為止。醇洗后的沉淀,用蒸餾水溶解后透析3 d,將透析后的樣品進(jìn)行冷凍干燥,得到LEBG。
采用苯酚-硫酸法[15]、β-葡聚糖試劑盒法[16]分別對LEBG多糖含量和β-葡聚糖含量進(jìn)行測定,并按照GB 5009.3—2016《食品中水分的測定》測定其水分含量,按照下式計(jì)算LEBG得率。
1.3.2 LEBG的分子質(zhì)量和純度
利用HPSEC-MALLS-RI分析多糖的分子質(zhì)量分布,計(jì)算其分子質(zhì)量[17]。稱取5 mg樣品,溶解于1 mL流動相中,流動相為含0.05 mol/L的NaH2PO4·2H2O 和0.15 mol/L的NaNO3溶液(pH 7,0.02%疊氮鈉),配制成質(zhì)量濃度5 mg/mL的溶液。用12 000×g離心20 min后取上清液進(jìn)行HPSEC-MALLS-RI分析[18]。其中,流速為0.5 mL/min,色譜柱溫用柱溫箱恒定在35 ℃;激光檢測器光源波長選用623.8 nm。多糖在溶液中的折光指數(shù)增量(dn/dc)按照0.146 mL/g計(jì)算。
1.3.3 LEBG單糖組成分析
表1 高效陰離子色譜的洗脫程序Table 1 Elution program of high performance anion chromatography
精確稱取3 mg LEBG樣品放入耐高溫具塞試管中,加入2 mol/L三氟乙酸溶液4.5 mL,將具塞試管置于110 ℃的油浴鍋中水解3 h。水解后用氮吹儀吹干,待試管內(nèi)的液體較少時(shí),加入3 mL甲醇繼續(xù)吹干,直至完全吹干無酸味。水解產(chǎn)物加入超純水溶解,溶解后取25 μL用高效陰離子色譜測定其單糖組成和物質(zhì)的量之比。標(biāo)準(zhǔn)品為葡萄糖、木糖、甘露糖、半乳糖、鼠李糖、阿拉伯糖、巖藻糖、果糖、葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸混標(biāo)[19]。
色譜條件:Dionex CarboPac PA20陰離子交換分析柱;采用脈沖安培檢測器進(jìn)行檢測,柱溫為30 ℃,流動相:去離子水、0.25 mol/L氫氧化鈉和1 mol/L乙酸鈉溶液,按照表1的程序進(jìn)行洗脫。
1.3.4 LEBG的紅外光譜
稱取樣品1~2 mg,進(jìn)行常規(guī)紅外光譜分析,掃描區(qū)間為4 000~400 cm-1[20]。
1.3.5 LEBG-淀粉的混合凝膠的動態(tài)流變學(xué)測試
1.3.5.1 混合凝膠的制備
向小麥淀粉及小麥淀粉中加入基于干質(zhì)量0%和20%的LEBG,加入一定量的去離子水配制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6%的淀粉漿[21],將各組樣品置于沸水浴中進(jìn)行糊化,不斷攪拌避免結(jié)塊直至完全糊化。
1.3.5.2 動態(tài)流變學(xué)的測定
為了測量受LEBG影響淀粉凝膠的黏彈性改變,采用TA流變儀對上述混合凝膠進(jìn)行動態(tài)流變學(xué)的檢測。在0.1 Hz和25 ℃條件下對0.1%~10%的形變范圍掃描以測定其線性黏彈區(qū)。確定1%的形變?yōu)榫€性黏彈區(qū)范圍內(nèi)的形變值,樣品的頻率掃描程序在25 ℃條件下在1%的形變內(nèi)從0.1~10 Hz運(yùn)行[22],并記錄儲能模量G’和損耗模量G”以顯示其黏彈性性能。
1.3.6 LEBG對淀粉體外消化的影響
1.3.6.1 制備LEBG-小麥淀粉的混合凝膠
按照總質(zhì)量的0%、20%的LEBG分別替代小麥淀粉、玉米淀粉。將淀粉和LEBG的混合物(200 mg)分散在蒸餾水(2 mL)中,混勻后在95 ℃的水浴中磁力攪拌加熱20 min。制備出的LEBG-淀粉混合凝膠用于淀粉消化的分析。
1.3.6.2 體外消化特性
根據(jù)Englyst方法[9]測定淀粉消化,略有改動。向裝有混合凝膠樣品的玻璃瓶中加入4 mL胃蛋白酶-磷酸緩沖溶液(5 mg/mL)。將在37 ℃條件下保溫30 min。加入6 個玻璃珠和2 mL乙酸鈉緩沖液(0.5 mol/L,pH 5.2),利用于渦旋混合儀進(jìn)行充分混勻。將玻璃管置于37 ℃水浴中并以160 r/min振蕩25 min。然后向玻璃管中加入淀粉轉(zhuǎn)葡糖苷酶和轉(zhuǎn)化酶組成的混合酶溶液(2 mL)。在不同時(shí)間(0、20、30、60、90、120、180 min和240 min)取50 μm使用葡萄糖氧化酶-過氧化物酶法測量酶解葡萄糖的含量。根據(jù)G20和G120值計(jì)算RDS、SDS和RS的值并繪制淀粉消化曲線。
式中:C為淀粉消化率;t為取樣時(shí)間點(diǎn);Gt為在酶解t min后釋放的葡萄糖含量/mg;G0為混合體系消化前所含游離葡萄糖的含量/mg;G20為在酶解20 min后釋放的葡萄糖含量/mg;G120為在酶解120 min后釋放的葡萄糖含量/mg;TS為淀粉的干基總質(zhì)量/mg。
1.3.6.3 pGI測定
根據(jù)Go?i等[23]提出的如下公式,可通過淀粉酶解率計(jì)算出pGI。
式中:H90為90 min酶解的總淀粉的百分比。
1.3.7 激光共聚焦掃描顯微鏡觀察
利用激光共聚焦掃描顯微鏡觀察LEBG與淀粉的相互作用的方式。向淀粉中加入干基質(zhì)量0%和20%的LEBG,加入一定量的蒸餾水,配制成干基為5%的混合體系,置于沸水浴中糊化20 min(邊糊化邊進(jìn)行磁力攪拌),糊化結(jié)束后,利用熒光染料FITC(20 μL,2 mg/mL)對淀粉-多糖復(fù)合凝膠進(jìn)行染色,并在20 ℃條件下孵育24 h。取一定量混合物置于載玻片上,并在樣品制備后15 min內(nèi)觀察。配備有兩個空氣冷卻激光器Ar和He/Ne的TCS SP2 AOBS共聚焦激光掃描顯微鏡在×40物鏡的熒光模式下觀察。FITC的激發(fā)波長為488 nm,發(fā)射波長為500~525 nm[24]。
采用Origin 9.0和Microsoft Excel 2016對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和圖表繪制;采用IBM SPSS Statistics 22軟件進(jìn)行方差分析;采用ASTRA 6.1數(shù)據(jù)分析軟件對光散射數(shù)據(jù)進(jìn)行采集和分析。
表2 LEBG的基本組成的質(zhì)量分?jǐn)?shù)(x±s,n=3)Table 2 Basic composition of LEBG (x ± s, n= 3)
由表2可見,香菇通過此種熱水浸提方法得到的LEBG的多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為80.04%,其中,β-葡聚糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為70.62%,其得率為0.49%。
如圖2所示,利用HPSEC-MALLS-RI聯(lián)用系統(tǒng)測定LEBG的分子質(zhì)量,LEBG的重均分子質(zhì)量(mw)為1.868×106Da,數(shù)均分子質(zhì)量(mn)為1.854×106Da,多分散性指數(shù)為1.007 6,說明熱水浸提得到的LEBG為大分子的β-葡聚糖,且分子質(zhì)量分布較為集中。該結(jié)果與梅光明等[25]的香菇多糖分子質(zhì)量(mw:5.203×104;mn:4.707×104)測定有一定的差異,造成這一差異的原因可能是香菇的前處理、來源不同,以及不同的提取方法。
圖2 LEBG的高效液相色譜圖譜Fig. 2 HPLC profile of LEBG
圖3 混合標(biāo)準(zhǔn)品的離子色譜圖Fig. 3 Ion chromatograms of mixed standards
圖4 LEBG的離子色譜圖Fig. 4 Ion chromatogram of LEBG
LEBG經(jīng)水解后與標(biāo)準(zhǔn)單糖的離子色譜圖進(jìn)行對比,結(jié)果如圖3、4所示,LEBG的單糖組成為葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖、木糖和甘露糖。LEBG中阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖物質(zhì)的量之比為0.72∶1.61∶2.61∶92.75∶2.34,由此可判斷,葡萄糖是LEBG的單糖組成主要為葡萄糖。這些結(jié)果與先前研究中的結(jié)果類似,Xie Hongqi等[26]從香菇中提取得到的3 種多糖Le1、Le2、Le3均由阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖組成,其中葡萄糖為主要單糖組分。
圖5 LEBG的紅外圖譜Fig. 5 Infrared spectrum of LEBG
由圖5可知,在3 321.82 cm-1處有強(qiáng)的—OH 吸收峰,說明LEBG存在分子間的氫鍵[27];在2 924.31 cm-1有CH3、CH2、CH的C—H伸縮振動吸收峰;波數(shù)為1 647.67 cm-1附近有C=H的伸縮振動吸收峰;波數(shù)為1 423.71 cm-1附近有甲基和次甲基的不對稱C—H(即面內(nèi)搖擺振動)吸收峰,波數(shù)為1 371.36 cm-1附近出現(xiàn)多重吸收峰,為甲基對稱C—H的剪式振動的吸收峰,波數(shù)為1 199.20 cm-1附近為三級醇的伸縮振動吸收峰,1 400~1 200 cm-1附近的吸收峰說明該物質(zhì)為糖類化合物[28];波數(shù)為1 073.40 cm-1處有強(qiáng)的C—O—C醚鍵的吸收峰,波數(shù)為889.20 cm-1有吸收峰,說明分子中不存在烷烴直鏈,在889.20 cm-1處吸收是β-吡喃糖苷鍵的特征峰[29],說明LEBG為β-吡喃型多糖。
圖6 LEBG對小麥淀粉和玉米淀粉黏彈性的影響Fig. 6 Effects of LEBG on the viscoelasticity of wheat starch and corn starch
黏彈性是高分子化合物特有的性質(zhì),高分子化合物既有彈性固體特性,又具有黏性流體的特性。淀粉是一種高分子化合物,兼具有彈性和黏性的雙重特性[30]。通常利用動態(tài)流變學(xué)中的G’和G”表征淀粉的黏性和彈性大小。如圖6所示,凝膠體系隨著角頻率的增加,G’和G”均呈現(xiàn)增加的趨勢,G’總是大于G”,添加了LEBG的凝膠比未添加的G’、G”大,表明添加LEBG后,小麥淀粉糊和玉米淀粉糊的G’和G”均顯著增加,這可能是LEBG相互交聯(lián),改善了混合結(jié)構(gòu)分子鏈之間的連接,增強(qiáng)了凝膠的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,富含β-葡聚糖的香菇粉的存在可顯著改變淀粉的黏彈性。同時(shí),香菇粉中的多糖和淀粉交聯(lián),導(dǎo)致分子混合體系的交聯(lián)度增加,凝膠系統(tǒng)網(wǎng)絡(luò)架構(gòu)得到增強(qiáng)[31]。
通過測量淀粉消化過程中的水解速率,研究了小麥淀粉凝膠中LEBG對體外淀粉消化的影響。圖7描述了與小麥淀粉、玉米淀粉和20% LEBG進(jìn)行比較的淀粉酶解曲線。其中,添加了20% LEBG的小麥淀粉消化的速度和程度在所有樣品中是最低的,其次是添加了20% LEBG的玉米淀粉,這歸因于凝膠體系中的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。LEBG可能與淀粉相互纏結(jié)形成了更加穩(wěn)定的凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。從流變學(xué)的結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了此結(jié)論,LEBG增強(qiáng)了與淀粉纏結(jié)的可能性,促進(jìn)了淀粉之間的相互聚集,LEBG和淀粉有一定程度的相互作用,同時(shí)降低了淀粉酶與淀粉接觸的面積[14]。Hrvoje等[32]在研究中也得到相似的結(jié)論,主要由β-D-葡聚糖構(gòu)成的黃原膠在體外消化過程中對淀粉的酶解起到抑制作用,其主要可能原因是其側(cè)鏈與淀粉形成螺旋狀結(jié)構(gòu),使得酶解速率降低。
圖7 LEBG對不同淀粉體外消化的影響Fig. 7 Effect of LEBG on in vitro digestion of different types of starch
4 組樣品RDS、SDS、RS含量和pGI值如表3所示。與未添加LEBG相比,具有LEBG的淀粉表現(xiàn)出較低水平的RDS和pGI。此外,含有LEBG的淀粉含有較高含量的SDS和RS。其中,添加了LEBG的小麥淀粉具有最低的RDS(28.37)和pGI值(59.86),顯著低于未添加LEBG的小麥淀粉,在玉米淀粉組別也有相同結(jié)果。說明LEBG對淀粉的體外消化具有顯著的抑制作用,能顯著降低RDS和pGI,增加SDS和RS的含量(P<0.05)。該結(jié)果與Regand等[33]的研究結(jié)果一致,表明作為可溶性膳食纖維來源的燕麥β-葡聚糖可以顯著降低血糖反應(yīng)峰值和曲線下的增量面積。另一重要原因是β-葡聚糖對體外消化過程所使用的酶有一定的相互作用[34]。張宇等[13]在研究燕麥β-葡聚糖對淀粉體外消化影響時(shí)發(fā)現(xiàn),燕麥β-葡聚糖對α-淀粉酶中的色氨酸殘基發(fā)生了靜電或可能發(fā)生了由氫鍵、范德華力等非共價(jià)鍵的結(jié)合,形成了復(fù)合物,減少了酶和淀粉結(jié)合的機(jī)會,從而減緩了淀粉消化的進(jìn)程。將含有LEBG的香菇超微粉加入淀粉中,也得到相同的結(jié)果,說明無論是提取出的LEBG還是含有LEBG的香菇超微粉對于淀粉的消化都有一定的抑制作用。
表3 LEBG對不同淀粉營養(yǎng)片段的影響以及pGITable 3 Effects of LEBG on different types of nutritive starch fragments and predicted glycemic index
圖8 LEBG-淀粉混合體系的激光共聚焦掃描顯微鏡圖片F(xiàn)ig. 8 Laser confocal scanning microscopy photos of LEBG-starch blend system
如圖8可見,F(xiàn)ITC能夠?qū)矸垡约岸嗵翘峁┝己玫姆直媛?,在激光共聚焦顯微鏡下,糊化后的小麥淀粉和玉米淀粉均呈現(xiàn)綠色熒光,加入20% LEBG的淀粉周圍有更強(qiáng)的綠色熒光,說明LEBG將淀粉包裹其中,這與Funami等[24]的研究結(jié)果一致,多糖與淀粉相互作用方式為多糖包裹淀粉,這進(jìn)一步說明LEBG對淀粉消化的抑制作用是由于LEBG對淀粉的包裹作用,使得淀粉與酶接觸的可能性降低,從而降低其消化速度。
本實(shí)驗(yàn)采用熱水浸提從香菇的子實(shí)體中成功分離得到β-葡聚糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為70.62%,mw為1.868×106Da的LEBG。該LEBG的單糖組分為阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖,其物質(zhì)的量之比為0.72∶1.61∶2.61∶92.75∶2.34,并通過紅外驗(yàn)證其結(jié)構(gòu)為β-吡喃多糖。將20%的LEBG分別加入小麥淀粉和玉米淀粉中,其動態(tài)流變學(xué)揭示了LEBG與淀粉之間有相互作用的存在。體外消化結(jié)果顯示,與未添加LEBG相比,添加了LEBG的小麥淀粉和玉米淀粉的酶解速率顯著降低(P<0.05)。添加了LEBG的兩種淀粉均表現(xiàn)出較低水平的RDS和pGI以及較高含量的SDS和RS。顯然,LEBG對淀粉的體外消化具有一定的抑制作用,綜合動態(tài)流變學(xué)的結(jié)論可以發(fā)現(xiàn),LEBG可能與淀粉相互纏結(jié)形成了更加穩(wěn)定的凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu),降低了淀粉酶與淀粉接觸的面積。在可視化實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步說明LEBG與淀粉相互作用的具體方式為包裹作用。將含有LEBG的香菇超微粉加入淀粉,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明超微粉也具有一定抑制效果,可用于研發(fā)低血糖指數(shù)的淀粉類食品。
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