賈淑偉 王玲 焦?jié)櫳?/p>

[摘要] 目的 探討杏仁核在腦梗死合并心律失常中的作用及可能機(jī)制。 方法 為觀察腦梗死后杏仁核神經(jīng)元活動(dòng)的變化，將48只大鼠隨機(jī)平均分為假手術(shù)組，腦梗死后30 min、1 h、2 h、4 h和8 h組。為觀察谷氨酸在腦梗死誘發(fā)心律失常中的作用，另取40只大鼠隨機(jī)平均分為空白對(duì)照組、生理鹽水組、L-谷氨酸組、MK-801預(yù)處理后側(cè)腦室注射L-谷氨酸組和MK-801預(yù)處理后再進(jìn)行中動(dòng)脈栓塞（MCAO）組。通過(guò)大鼠大腦MCAO建立腦梗死模型，用生物信號(hào)采集系統(tǒng)采集心電圖，用Fos蛋白作為神經(jīng)元激活標(biāo)志物。 結(jié)果 假手術(shù)組心律失常的發(fā)生率為0，腦梗死組心律失常的發(fā)生率為78.75%，明顯高于假手術(shù)組（P < 0.01），且在心律失常發(fā)生的相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)杏仁核Fos蛋白表達(dá)明顯增加（P < 0.01）。空白對(duì)照組和生理鹽水組心律失常的發(fā)生率均為0，L-谷氨酸組心律失常的發(fā)生率為87.5%，明顯高于空白對(duì)照組（P < 0.01），且L-谷氨酸組杏仁核Fos蛋白表達(dá)明顯增高（P < 0.05）。MK-801預(yù)處理后MCAO組和MK-801預(yù)處理后側(cè)腦室注射L-谷氨酸組心律失常的發(fā)生率均為0，且杏仁核Fos蛋白表達(dá)均無(wú)明顯變化（P > 0.05）。 結(jié)論 腦梗死后杏仁核活動(dòng)的增強(qiáng)可能參與了腦梗死后心律失常的發(fā)生發(fā)展，且此作用可能由谷氨酸激活門(mén)冬氨酸受體所介導(dǎo)。

[關(guān)鍵詞] 杏仁核；腦梗死；心律失常；谷氨酸；門(mén)冬氨酸受體

[中圖分類號(hào)] R33 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210（2018）03（a）-0020-04

[Abstract] Objective To investigate the association between ischemic stroke-induced arrhythmia and the activity of amygdala and the possible mechanism. Methods Forty-eight rats were randomly and equally divided into the following groups： sham-operated group， 30 min， 1 h， 2 h， 4 h， and 8 h after ischemic stroke groups， and the changes of the activity of amygdala neurons in ischemic stroke rats were observed. Forty rats were randomly and equally divided into the following groups： blank control group， saline group， L-glutamate group， MK-801 before L-glutamate and MK-801 preceding making model group， and the effects of glutamate on arrhythmia induced by ischemic stroke were observed. The experimental cerebral ischemic animal model was established by occluding the right middle cerebral artery （MCAO）. The electrocardiography was recorded by a biological signal collecting and processing system. Fos protein was used as an objective indicator to illustrate the functional state of neurons. Results The incidence of arrhythmia in model group was 0， and the sham-operated group was 78.75%， the incidence of arrhythmia in the sham-operated group was significantly higher than that in model group （P < 0.01）， and the expression of Fos protein in the amygdala was also increased significantly during the arrhythmia （P < 0.01）. The incidence of arrhythmia in blank control group and saline group was 0， L-glutamate group was 87.5%， which was significantly higher than blank control group （P < 0.01）， and the expression of Fos protein in the amygdala of the L-glutamate group was also increased significantly （P < 0.05）. The incidence of arrhythmia in both MK-801 preceding making model group and MK-801 preceding L-glutamate group was 0， and the expression of Fos protein had no obvious change （P > 0.05）. Conclusion It is concluded that activation of the amygdala in ischemic stroke rats is likely mediated by glutamate via activation of N-methyl-D-aspartic acid receptors， which causes arrhythmias.

[Key words] Amygdala； Ischemic stroke； Arrhythmia； Glutamate； NMDA receptor

腦梗死合并心律失常是腦梗死猝死的主要原因之一[1]，其起病急、變化快的特點(diǎn)不能用腦疝解釋[2]，且許多腦梗死合并心律失常的患者不存在原發(fā)心臟病史[3]，提示腦梗死后心律失常的發(fā)生源于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的活動(dòng)異常。杏仁核是前腦內(nèi)參與自主神經(jīng)系統(tǒng)和心血管功能活動(dòng)的重要整合中樞之一[4]。杏仁核受損時(shí)，心電圖可發(fā)生明顯改變[5]，通過(guò)刺激杏仁核可建立交感源性心律失常動(dòng)物模型[6]。是否腦梗死后心律失常的發(fā)生與杏仁核的活動(dòng)增強(qiáng)有關(guān)？本研究觀察了腦梗死后大鼠杏仁核神經(jīng)元活動(dòng)的改變，并探討了其與腦梗死后心律失常發(fā)生的相關(guān)性及可能的谷氨酸能機(jī)制，以期揭示腦梗死合并心律失常的部分中樞機(jī)制。

1 對(duì)象與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

雄性健康Wistar大鼠，體重210～250 g，購(gòu)自哈爾濱醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)部。

1.2 藥物與試劑

TTC購(gòu)自中國(guó)醫(yī)藥上?；瘜W(xué)試劑公司。GAPDH單克隆抗體購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所。c-fos多克隆抗體（sc-52，Santa Cruz）購(gòu)自中杉金橋公司。AP標(biāo)記馬抗小鼠二抗（zd-2310）購(gòu)自中杉金橋公司。AP標(biāo)記的山羊抗兔二抗（zb-2308）購(gòu)自中杉金橋公司。

1.3 儀器

RM6240B生物信號(hào)采集系統(tǒng)，中國(guó)成都泰盟；大鼠腦立體定位儀SN-3，日本Narishige；石蠟切片機(jī)RM2016，德國(guó)徠卡；凝膠成像系統(tǒng)，美國(guó)Alpha。

1.4 實(shí)驗(yàn)分組

48只大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組，腦梗死后30 min、1 h、2 h、4 h和8 h組，每組8只，以觀察腦梗死后杏仁核神經(jīng)元活動(dòng)的變化。假手術(shù)組在術(shù)后2 h取材，腦梗死各時(shí)間組在梗死后的相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)取材。另取40只大鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組、生理鹽水組（10 μL）、L-谷氨酸組（0.5 μmol，10 μL）、MK-801（4 nmol，10 μL）預(yù)處理后再側(cè)腦室注射L-谷氨酸組和MK-801預(yù)處理后再M(fèi)CAO組，每組8只，分別在側(cè)腦室注射后或術(shù)后30 min取材，以觀察腦梗死誘發(fā)心律失常中谷氨酸的作用。每項(xiàng)實(shí)驗(yàn)前大鼠均監(jiān)測(cè)心電20 min，心電圖正常者用于實(shí)驗(yàn)。

1.5 腦梗死動(dòng)物模型的制備和鑒定

腦梗死動(dòng)物模型的制備方法同前期發(fā)表文章[7-9]，基本過(guò)程為：水合氯醛350 mg/kg腹腔注射麻醉，頸部正中縱行切口，游離右側(cè)頸總、頸內(nèi)和頸外動(dòng)脈，結(jié)扎頸外動(dòng)脈，暫時(shí)夾閉頸內(nèi)動(dòng)脈，頸總動(dòng)脈開(kāi)一小口，將栓線向頭側(cè)插入，經(jīng)頸內(nèi)動(dòng)脈進(jìn)入大腦中動(dòng)脈，進(jìn)線長(zhǎng)度（17.5±0.5）mm，形成大腦中動(dòng)脈栓塞。假手術(shù)組栓線插至大腦中動(dòng)脈起始處撤回，余同模型組。模型的鑒定采用TTC染色和神經(jīng)功能學(xué)評(píng)分[10-11]，TTC染色梗死區(qū)明顯且神經(jīng)功能學(xué)評(píng)分大于2分者造模成功。

1.6 Western Blot檢測(cè)

腦組織入組織裂解液研磨，勻漿液4℃ 1000 r/min離心15 min，取上清，測(cè)蛋白濃度，上樣，電泳分離（10%聚丙烯酰胺凝膠），轉(zhuǎn)膜（聚偏二氟乙烯膜），37℃封閉（3%牛血清白蛋白）1 h，洗膜，加一抗（1∶500）4℃孵育過(guò)夜，洗膜，加二抗（1∶1000）孵育1 h，洗膜，BCIP/NBT顯色。GAPDH作內(nèi)參，結(jié)果用Alphaview 3.1.1.0軟件分析。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析（LSD-t法），兩組間比較采用t檢驗(yàn)，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠大腦中動(dòng)脈栓塞后心電圖變化

假手術(shù)組心律失常發(fā)生率為0，腦梗死組心律失常的發(fā)生率為78.75%，明顯高于假手術(shù)組（P < 0.01），且MCAO后大鼠會(huì)出現(xiàn)2次心律失常，分別在MCAO后30 min和4 h左右?？瞻讓?duì)照組和生理鹽水組心律失常發(fā)生率均為0，L-谷氨酸組心律失常發(fā)生率為87.5%，明顯高于空白對(duì)照組（P < 0.01）。MK-801預(yù)處理20 min心律失常發(fā)生率為0，MK-801預(yù)處理20 min后再側(cè)腦室注射L-谷氨酸組或MCAO心律失常的發(fā)生率均為0。

2.2 大鼠大腦中動(dòng)脈栓塞后杏仁核活動(dòng)的改變

與假手術(shù)組比較，大鼠大腦中動(dòng)脈栓塞后杏仁核神經(jīng)元Fos蛋白的表達(dá)在造模后30 min和4 h明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01），與MCAO后心律失常發(fā)生時(shí)間點(diǎn)相對(duì)應(yīng)。見(jiàn)圖1。

2.3 大鼠大腦中動(dòng)脈栓塞后杏仁核活動(dòng)改變的谷氨酸能機(jī)制

與空白對(duì)照組比較，生理鹽水組杏仁核神經(jīng)元Fos蛋白表達(dá)的變化差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05），L-谷氨酸組杏仁核神經(jīng)元Fos蛋白表達(dá)明顯增加（P < 0.05），MK-801預(yù)處理后給予L-谷氨酸或MCAO后Fos蛋白表達(dá)無(wú)明顯變化（P > 0.05）。見(jiàn)圖2。

3 討論

腦梗死合并心律失常是腦梗死猝死的主要原因之一，嚴(yán)重威脅著人類的健康。本研究發(fā)現(xiàn)，MCAO可誘發(fā)心律失常的發(fā)生，與臨床報(bào)道一致[1]，但MCAO后心律失常的發(fā)生率偏高于臨床，可能與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型腦缺血程度相對(duì)均一有關(guān)。越來(lái)越多的臨床和實(shí)驗(yàn)證明，心律失常的發(fā)生除與心臟自身的病變有關(guān)外，還與中樞神經(jīng)系統(tǒng)的功能狀態(tài)密切相關(guān)。腦梗死可破壞中樞神經(jīng)系統(tǒng)的完整性，進(jìn)而導(dǎo)致自主神經(jīng)系統(tǒng)活動(dòng)異常[12]，特別是交感神經(jīng)過(guò)度激活，與致命性心律失常的發(fā)生密切相關(guān)[13]。杏仁核是前腦內(nèi)參與自主神經(jīng)系統(tǒng)和心血管功能活動(dòng)整合中樞之一[4]，杏仁核受損時(shí)，心電圖會(huì)發(fā)生明顯改變[5]，通過(guò)刺激杏仁核可建立交感源性心律失常動(dòng)物模型[6]。