閆世林，羅永百，朱浩鋒，徐超

研究顯示，動(dòng)脈粥樣硬化、心肌梗死、缺血再 灌注、高血壓等心血管疾病的發(fā)生均與組織中氧自由基有關(guān)，正常組織中氧自由基不僅在維持正常氧化平衡狀態(tài)中有重要作用，在細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中也發(fā)揮重要作用[1-3]。當(dāng)機(jī)體內(nèi)出現(xiàn)氧化損傷時(shí)，細(xì)胞內(nèi)正常的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)等受到破壞，致細(xì)胞功能受損，引起細(xì)胞凋亡發(fā)生[1-3]。鈣超載、細(xì)胞凋亡增加等均與心肌細(xì)胞氧化損傷有關(guān)[4]。鈣敏感受體（CaSR）在心肌細(xì)胞中表達(dá)，能維持細(xì)胞內(nèi)鈣離子及其他相關(guān)金屬離子的穩(wěn)定，對細(xì)胞生長、凋亡等有調(diào)節(jié)作用[5,6]。研究顯示，在缺血再灌注損傷中，心肌細(xì)胞中CaSR表達(dá)上調(diào)，并且與心肌組織氧化損傷和凋亡有關(guān)[7]。本研究用過氧化氫處理心肌細(xì)胞構(gòu)建心肌細(xì)胞氧化損傷模型，用CaSR抑制劑處理心肌細(xì)胞，探討CaSR在過氧化氫心肌細(xì)胞活性和凋亡中的作用，以期為探討CaSR在心血管疾病中的作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 大鼠心肌細(xì)胞H9C2購自于中國科學(xué)院細(xì)胞庫。RNA提取試劑盒為北京天根產(chǎn)品；蛋白提取試劑盒為美國Thermo產(chǎn)品；二喹啉甲酸（BCA）蛋白濃度檢測試劑盒為北京solarbio產(chǎn)品；CaSR抑制劑（NPS2300）為美國MedChemExpress產(chǎn)品；CaSR、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）引物由南京金斯瑞合成；活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3（Cleaved Caspase-3）多克隆抗體、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄因子3（STAT3）多克隆抗體、磷酸化信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄因子3（p-STAT3）多克隆抗體均為美國Abcam產(chǎn)品；丙二醛（MDA）含量檢測試劑盒 、超氧化物歧化酶（SOD）含量檢測試劑盒為碧云天生物研究所產(chǎn)品；乳酸脫氫酶（LDH）含量檢測試劑盒為美國Sigma產(chǎn)品。

1.2 心肌細(xì)胞培養(yǎng) H9C2細(xì)胞從液氮中取出以后，迅速放在37℃的水浴中，觀察細(xì)胞完全融化后，加入細(xì)胞培養(yǎng)液（含有10%胎牛血清的DMEM），種植到細(xì)胞培養(yǎng)瓶，培養(yǎng)條件為：37℃，5% CO2培養(yǎng)箱。培養(yǎng)2～3 d后，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長至90%，進(jìn)行細(xì)胞傳代。傳代方法如下：棄培養(yǎng)液上清，磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌2次，每個(gè)細(xì)胞瓶中加入適量的0.25%的胰蛋白酶，使胰蛋白酶能夠全部覆蓋細(xì)胞，在37℃消化1 min。加入細(xì)胞培養(yǎng)液，根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求把細(xì)胞按照不同比例接種到細(xì)胞培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)。

1.3 細(xì)胞分組 H9C2細(xì)胞培養(yǎng)至對數(shù)期后，用200 μmol/L過氧化氫處理細(xì)胞6 h，記為模型組，同時(shí)以正常培養(yǎng)不加過氧化氫處理的H9C2細(xì)胞為對照組。大鼠心肌細(xì)胞H9C2經(jīng)過40 nM的CaSR抑制劑（NPS2300）作用后12 h再用200 μmol/L過氧化氫處理6 h記為抑制劑組。

1.4 熒光定量PCR檢測CaSR水平 取各組細(xì)胞，按照每一個(gè)50 ml的細(xì)胞培養(yǎng)瓶加入1 ml的Trizol放在冰上裂解10 min。加入200 μl的氯仿溶液，震蕩反應(yīng)15 s后，在冰上靜置5 min。4℃，12000×g離心10 min，用移液槍吸取上層水相溶液，加入500 μl的異丙醇溶液，混勻后，室溫條件下靜置10min。4℃，12000×g離心10 min，用75%的乙醇溶液洗滌兩次，在RNA沉淀中加入20μL的DEPC（焦碳酸二乙酯）水溶解后保存在-80℃。取1 μg的RNA合成cDNA，步驟參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書。熒光定量PCR檢測CaSR水平，以GAPDH為內(nèi)參。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取均值。

CaSR上游引物為5，-TTCGGCATCAGCTTTG TG-3’，下游引物5，-TGAAGATGATTTCGTCTTCC-3’。GAPDH上游引物為5，-CGGAGTCAACGGAT TTGGTCGTAT-3’，

下游引物5，-AGCCTTCTCCATGGTGGTGAA GAC-3’。

1.5 噻唑藍(lán)（MTT）檢測細(xì)胞增殖活性 取對照組、模型組、抑制劑組細(xì)胞，按照每一個(gè)96孔板中加入20 μl的MTT溶液（5 mg/ml），放在37℃培養(yǎng)4 h，將上清液吸除后，每孔中加入150 μl的二甲基亞砜，震蕩混合10 min，酶標(biāo)儀檢測490 nm每孔的光密度值（OD值），每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，重復(fù)3次，取均值。

1.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡 取對照組、模型組、抑制劑組細(xì)胞，加入蛋白酶消化，收集各組細(xì)胞，1000×g離心10 min，棄上清液，用PBS把細(xì)胞濃度調(diào)整為4×105個(gè)/ml。取1 ml的細(xì)胞懸浮液，1000×g離心10 min后，與200μL的Binding Buffer混合，依次加入10 μl膜聯(lián)蛋白 V-FITC和碘化丙啶（PI）5 μl，放置于室溫，避光反應(yīng)15 min，再加入300 μl緩沖液混合后，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況。

1.7 LDH、MDA 、SOD水平檢測 取對照組、模型組、抑制劑組細(xì)胞和培養(yǎng)液上清，分別用二硝基苯肼顯色法LDH含量檢測試劑盒檢測培養(yǎng)液上清中LDH水平，用硫代巴比妥酸法檢測MDA水平，黃嘌呤氧化酶法檢測SOD水平，步驟參照試劑盒說明書。

1.8 Western blot檢測Cleaved Caspase-3、STAT3、p-STAT3水平 取對照組、模型組、抑制劑組細(xì)胞，在每個(gè)50 ml細(xì)胞培養(yǎng)瓶中依次加入80 μl裂解液（PMSF和RIPA按照1:100體積比混合）進(jìn)行細(xì)胞裂解，4℃，12000×g離心10 min，吸取蛋白上清溶液，保存于-80℃。用BCA蛋白定量試劑盒檢測蛋白濃度。在80 V恒壓條件下電泳，肉眼觀察溴酚藍(lán)到達(dá)距離玻璃板底時(shí)停止電泳。在60 mA，4℃轉(zhuǎn)膜80 min。封閉：5%牛

血清白蛋白，室溫反應(yīng)2 h。一抗結(jié)合：加入一抗（Cleaved Caspase-3按照1:600稀釋、STAT3按照1:800稀釋、p-STAT3按照1:600稀釋），在4℃反應(yīng)過夜。二抗結(jié)合：放在1:2000倍稀釋的二抗中，室溫孵育2 h。顯色，曝光后，用ImageJ對蛋白進(jìn)行定量分析，以GAPDH為內(nèi)參。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS21.0軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料用（±s）表示，多組比較采用單因素方差分析，組間比較采用LSD-t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞中CaSR水平比較 對照組、模型組、抑制劑組細(xì)胞中CaSR mRNA水平為：1.00±0.12、1.95±0.17、1.42±0.14。模型組、抑制劑組CaSR mRNA水平高于對照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.000）。抑制劑組CaSR mRNA水平低于模型組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.000）。過氧化氫作用后的心肌細(xì)胞中CaSR表達(dá)上調(diào)，而CaSR抑制劑能夠抑制過氧化氫誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞中CaSR表達(dá)上調(diào)，見表1。

2.2 各組細(xì)胞增殖活性和凋亡比較 對照組、模型組、抑制劑組細(xì)胞OD值為：0.48±0.04、0.21±0.02、0.36±0.03，細(xì)胞凋亡率依次為：（5.92±0.98）%、（39.25±7.16）%、（21.72±1.38）%。模型組、抑制劑組OD值低于對照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.000）。抑制劑組OD值高于模型組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.000）。模型組、抑制劑組細(xì)胞凋亡率高于對照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.000）。抑制劑組細(xì)胞凋亡率低于模型組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.000）。過氧化氫作用后的心肌細(xì)胞增殖活性降低，細(xì)胞凋亡增加，而CaSR抑制劑能夠減弱過氧化氫誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡，見圖1、表2。

2.3 各組LDH、MDA 、SOD水平比較 對照組、模型組、抑制劑組LDH水平為：（136.25±17.03）U/L、（342.87±29.64）U/L、（285.46±21.45）U/L，MDA 水平為：（1.58±0.19）nmol/mg、（2.74±0.31）nmol/mg、（2.11±0.13）nmol/mg，SOD水平為：（86.22±8.36）U/mg、（27.49±2.33）U/mg、（48.26±4.27）U/mg。模型組、抑制劑組LDH、MDA水平高于對照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.000）。抑制劑組LDH、MDA水平低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.000）。模型組、抑制劑組SOD水平低于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.000）。抑制劑組SOD水平高于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.000）。過氧化氫能夠造成心肌細(xì)胞氧化損傷，而CaSR抑制劑能夠減弱過氧化氫誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞氧化損傷，見表3。

表1 各組細(xì)胞中CaSR mRNA水平（±s）

表1 各組細(xì)胞中CaSR mRNA水平（±s）

注：與對照組比較，aP＜0.05 ；與模型組比較，bP＜0.05

組別 CaSR mRNA對照組 1.00±0.12模型組 1.95±0.17a抑制劑組 1.42±0.14ab F值 32.428 P值 0.001

2.4 各組Cleaved Caspase-3、STAT3、p-STAT3水平比較 對照組、模型組、抑制劑組Cleaved Caspase-3水平為：0.25±0.03、1.89±0.17、1.24±0.11，STAT3水平為：1.64±0.13、1.68±0.16、1.65±0.14，p-STAT3水平為：0.75±0.06、0.21±0.02、0.32±0.03。模型組、抑制劑組Cleaved Caspase-3水平高于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.000）。抑制劑組Cleaved Caspase-3水平低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.000）。模型組、抑制劑組p-STAT3水平低于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.000）。抑制劑組p-STAT3水平高于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.000）。過氧化氫能夠抑制心肌細(xì)胞中STAT3磷酸化，而CaSR抑制劑能夠部分拮抗過氧化氫對心肌細(xì)胞STAT3磷酸化水平影響，見圖2和表4。

3 討論

圖1 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡結(jié)果

表2 各組細(xì)胞OD值和細(xì)胞凋亡率

表3 各組LDH、MDA 、SOD水平

圖2 Cleaved Caspase-3、STAT3、p-STAT3水平檢測結(jié)果

表4 各組Cleaved Caspase-3、STAT3、p-STAT3水平（±s）

表4 各組Cleaved Caspase-3、STAT3、p-STAT3水平（±s）

注：與對照組比較，aP＜0.05 ；與模型組比較，bP＜0.05

組別 Cleaved Caspase-3 STAT3 p-STAT3對照組 0.25±0.03 1.64±0.13 0.75±0.06模型組 1.89±0.17a 1.68±0.16 0.21±0.02a抑制劑組 1.24±0.11ab 1.65±0.14 0.32±0.03ab F值 146.799 0.063 149.571 P值 0.000 0.940 0.000

CaSR參與缺氧復(fù)氧心肌細(xì)胞凋亡過程，用CaSR激動(dòng)劑處理后降低心功能，加重心肌損傷[8]。在缺血再灌注心肌損傷中，氧化應(yīng)激導(dǎo)致的心肌組織損傷是其損害正常心功能的重要途徑[9]。目前對于CaSR調(diào)控心肌細(xì)胞凋亡機(jī)制的研究尚不十分清楚，線粒體途徑、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、死亡受體途徑等是其可能的作用機(jī)制[10]。CaSR參與G蛋白-PLC-IP3導(dǎo)致的鈣離子超載進(jìn)而引發(fā)線粒體損傷和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，最終激活Caspase級聯(lián)反應(yīng)，活化Caspase-3誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡發(fā)生，另外CaSR還能夠調(diào)控細(xì)胞內(nèi)絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）、c-Jun氨基末端激酶（JNK）、磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K）等多種信號通路調(diào)控心肌細(xì)胞凋亡[11,12]。本研究發(fā)現(xiàn)，用過氧化氫處理后的心肌細(xì)胞中CaSR水平升高，而用CaSR抑制劑（NPS2300）處理后能夠成功降低心肌細(xì)胞中CaSR水平，本研究結(jié)果同之前的研究報(bào)道一致，說明CaSR參與心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激過程。

正常情況下，機(jī)體處于氧化平衡狀態(tài)，當(dāng)機(jī)體內(nèi)受到炎癥因子、內(nèi)毒素等刺激后會(huì)引起細(xì)胞內(nèi)的氧自由基大量聚集，導(dǎo)致存在于細(xì)胞膜上的脂質(zhì)發(fā)生過程氧化，使細(xì)胞膜通透性發(fā)生改變，原來存在于細(xì)胞內(nèi)的LDH外漏，MDA是不飽和脂肪酸過氧化的產(chǎn)物，其在細(xì)胞氧化損傷中表達(dá)上調(diào)[13,14]。SOD在維持細(xì)胞內(nèi)氧化平衡狀態(tài)中具有重要作用，能夠清除細(xì)胞內(nèi)的超氧陰離子，保護(hù)細(xì)胞免受氧化損傷[15]。本結(jié)果顯示，過氧化氫處理后的心肌細(xì)胞中MDA水平升高，細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH水平也升高，而細(xì)胞中的SOD水平下降，說明過氧化氫能夠誘導(dǎo)心肌細(xì)胞氧化損傷，而CaSR抑制劑（NPS2300）處理可緩解心肌細(xì)胞氧化損傷，抑制CaSR可降低心肌細(xì)胞氧化損傷。

氧化應(yīng)激會(huì)引起細(xì)胞凋亡的發(fā)生，并且與細(xì)胞內(nèi)多種信號通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)。Caspase級聯(lián)反應(yīng)激活后促進(jìn)細(xì)胞凋亡的發(fā)生，而Caspase-3作為Caspase蛋白家族成員之一，其活化后可以生成Cleaved Caspase-3，發(fā)揮凋亡執(zhí)行的作用[16,17]。STAT3信號通路在生物機(jī)體內(nèi)廣泛表達(dá)，其磷酸化水平升高后標(biāo)志著STAT3信號通路激活，發(fā)揮凋亡抑制的作用[18]。研究表明，CaSR參與心肌細(xì)胞凋亡的發(fā)生與細(xì)胞內(nèi)Caspase級聯(lián)反應(yīng)和STAT3信號通路有關(guān)[19,20]。本研究結(jié)果顯示，過氧化氫作用后的心肌細(xì)胞中Cleaved Caspase-3水平升高，細(xì)胞凋亡增多，細(xì)胞活性降低，STAT3磷酸化水平也降低，而用CaSR抑制劑（NPS2300）處理后細(xì)胞中Cleaved Caspase-3部分降低，細(xì)胞凋亡減少，STAT3磷酸化水平有所升高，CaSR可能通過促進(jìn)STAT3信號通路激活從而調(diào)控心肌細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激，而對于其具體的作用機(jī)制仍需要進(jìn)一步驗(yàn)證。

綜上，過氧化氫誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡，降低細(xì)胞增殖活性，誘導(dǎo)細(xì)胞氧化損傷，而抑制CaSR可以減弱心肌細(xì)胞凋亡，增加細(xì)胞增殖活性，降低細(xì)胞氧化損傷，其作用機(jī)制可能與STAT3信號通路的激活有關(guān)。本研究只在體外細(xì)胞試驗(yàn)中進(jìn)行了初步探討，在后續(xù)試驗(yàn)中會(huì)繼續(xù)探討CaSR在體內(nèi)心肌組織細(xì)胞凋亡中的作用，對于其與信號通路的關(guān)系需繼續(xù)驗(yàn)證，本研究明確了CaSR參與心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激，與心肌細(xì)胞凋亡有關(guān)，為后續(xù)探討CaSR在心血管疾病中的作用奠定基礎(chǔ)。

參 考 文 獻(xiàn)

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