張玉星，張 響，2，陳文杰，張麗果

（鄭州大學：1力學與工程科學學院，2國家級微納成型技術國際聯合研究中心，河南 鄭州450001；3鄭州大學醫(yī)藥科學研究院，河南 鄭州 450052）

0 引言

作為一種納米級的膜性囊泡，外泌體（exosomes）在1983年首次被Johnstone等［1］在羊的網織紅細胞培養(yǎng)液上清中發(fā)現并于1989年正式命名［2］。在這之后三十年間，外泌體研究進展較為緩慢。一直到2013年，諾貝爾生理學或醫(yī)學獎授予美國科學家James E.Rothman、Randy W.Schekman和德國科學家Thomas C.Südhof，以表彰他們發(fā)現細胞內部囊泡運輸調控機制。從此，外泌體研究領域進入全新的、高速的發(fā)展階段，相關論文發(fā)表量相較于2013年以前有了大幅度提升（圖1）。

圖1 近20年外泌體相關領域論文發(fā)表增長曲線

外泌體是細胞外囊泡大家庭中的一員。細胞外囊泡一般包括外泌體（30～150 nm）、微泡（100～350 nm）及凋亡小體（500 ～ 1000 nm）［3－5］。 外泌體來源于晚期胞內體（又稱多泡體，multivesicular bodys，MVBs），電鏡下觀察形狀呈杯狀結構，直徑為30～150 nm［5］。外泌體可以由體內或體外培養(yǎng)的細胞分泌，如小膠質細胞、淋巴細胞等，同時也存在于精液、尿液、腹水、乳汁、血清［6－9］等人體體液中。作為一個納米級的膜性小囊泡，外泌體具有獨立且完整的磷脂雙分子層結構，并借此封裝了母細胞的一部分，包括蛋白質、microRNA等。研究發(fā)現，部分外泌體甚至含有來源細胞的絕大多數蛋白質種類，更有學者報道當疾病發(fā)生時外泌體的組成會發(fā)生變化，例如卵巢癌患者分泌的外泌體中，Claudin4等腫瘤標志物含量上升，并且隨著腫瘤的發(fā)展而逐漸增加［10］。因此通過分析患者體液中的外泌體成分與變化可以進行有效的醫(yī)療診斷、預測。近年來，外泌體被認為是潛在的新興的臨床診療的生物標志物，可以揭示來源細胞的生理信息，為臨床診斷提供新方法?；诖?，研究開發(fā)一種能夠獲得高濃度、高純度的外泌體分離方法顯得尤為重要。

2 外泌體的臨床應用

早期人們認為外泌體是細胞內的“清道夫”，負責搬運細胞產生的廢物［6］。后來，人們逐漸了解到外泌體還具有其他的生物學功能，如細胞通訊、運輸載體等。反映到不同的細胞上，外泌體具有相應的特異性功能，如抗原呈遞，抑制腫瘤細胞增殖，促進免疫反應等。

外泌體是生命科學的一個前沿領域，已有越來越多的學者關注外泌體的臨床研究。例如，外泌體可以促進血管生成，抗凋亡，增進有絲分裂，促進生長因子釋放，能夠誘導修復心肌，減少心臟損傷范圍［11］。并且外泌體被認為是腫瘤臨床診療的生物標志物，比如食管癌［12］、結腸癌［13］、膠質母細胞瘤［14］的潛在標志物均來自從血液中分離的外泌體。研究［15］證實，外泌體在胰腺癌診斷中也具有非常重要的標志性價值。Taylor等［16］首先提出可以通過檢測血液外泌體miR?NA來診斷卵巢癌，并且該研究團隊表示：從血清中分離出的腫瘤來源外泌體中的miRNA與卵巢癌組織中提取出的miRNA具有很好的相關性。外泌體不僅可以改善腫瘤細胞生存環(huán)境［17］，并且外泌體中的RNA進入靶細胞后還可以調控腫瘤的發(fā)展［18］?？梢哉f，外泌體與腫瘤診療有著極其密切的關系，早期發(fā)現對提高癌癥患者的存活率至關重要。外泌體不僅在腫瘤醫(yī)療領域具有廣闊的前景，在新型藥物投遞策略領域中被認為是一種天然的藥物運輸載體［19］。此外，間充質干細胞外泌體（MSC?Exosomes）被一部分學者認為是未來生物療法的理想載體［19－20］。

3 外泌體的分離方法

外泌體分離方法一般基于外泌體的物理化學特性，如尺寸、密度、質量、表面蛋白等。本研究認為高效的外泌體分離方法是利用外泌體在醫(yī)療診斷、預測及制藥領域能否有實質性突破的前提。下面，本文將綜述幾種常見的外泌體分離方法，并重點討論基于微流控技術的外泌體分離方法。

3.1 超速離心法 超速離心法分離外泌體是目前最普遍的一種方法。據估計，采用超速離心法的研究者占所有外泌體分離方法的56%［21］。超速離心法的步驟［22］如圖2所示。最后用PBS洗滌，獲得外泌體。

該法不需要對外泌體進行標記或者使用其他分離試劑，不易被污染，適用于大劑量樣品分離。但是在分離過程中，由于超高速離心，外泌體的結構、功能很容易遭到破壞，并且易聚集成塊，下游分析不利。此外，

該法較為耗時且需要專門的技術人員。

圖2 超速離心法分離外泌體步驟示意圖

3.2 蔗糖密度梯度離心法 蔗糖密度梯度離心法是基于超速離心法的一種外泌體分離方法，是對超速離心法的改進與優(yōu)化。這種方法是在超速離心力的作用下，使蔗糖溶液從低到高形成連續(xù)分布的密度梯度層，通過形成的不同區(qū)域的條帶對外泌體進行分離，外泌體將在 1.13～1.19 g/mL 的密度區(qū)域富集［23］。

3.3 商品化試劑盒沉淀法 商品化試劑盒沉淀法具有操作簡便、不需要特殊設備等優(yōu)點。然而，市面上的商品化試劑盒，往往價格較為昂貴，不利于大批量地提取外泌體。黃依瑤等［24］對超速離心法、EXO?Quick試劑盒、TEI試劑盒三種方法針對分離獲得的外泌體標志物特異性表達情況進行比較。實驗結果發(fā)現，差速離心法所獲得的外泌體對 CD9、CD63、TSG101均表達，而試劑盒法提取到的外泌體僅表達TSG101。目前，用于外泌體分離的比較常用的商品化試劑盒有 EXOQuick（美國 System Biosciences公司）、TEI（美國 Invitrogen 公司）。

3.4 聚合物沉淀法 聚合物沉淀法是一種利用外泌體膜（磷脂雙分子層膜）疏水的特性對外泌體進行沉淀富集的方法。渠香云等［25］建立了一種采用PEG8000對血清中的外泌體進行富集、分離的方法，并與超速離心法、商品化EXOQuick試劑盒進行比較。實驗結果顯示PEG8000沉淀法相較于前兩種方法，所獲得的外泌體粒徑較小，粒徑在30～150 nm的比例更高。這一結果證明PEG8000沉淀法所獲得的外泌體純度較高，夾雜的大囊泡結構較少。聚合物沉淀法具有不需要大型昂貴儀器設備，可大劑量樣品處理的優(yōu)點。但是，會受到共沉淀的其他物質的污染，影響下游分析。

3.5 超濾法 超濾法是一種依靠超濾膜兩側的壓力差作為動力來分離外泌體的方法。由于超濾過程是在常溫下進行的且不需添加化學試劑，所以對外泌體基本無成分破壞，也不會造成化學污染，因此分離出的外泌體純度較高。林韓翡等［26］利用液壓透析濾過法首次對健康成人24 h尿液中所有外泌體進行分離、富集并分析。該研究團隊表示此方法對分離健康成人24 h尿液（1～3 L）具有高效（需 20 h）、簡單等特點。胡國文等［27］研發(fā)出的旋轉超濾法為以后的外泌體基礎實驗研究和臨床實驗提供了一種新型的外泌體獲取方法。據報道，該方法可以快速、大量地從骨髓間充質干細胞中獲取外泌體。

3.6 免疫磁珠法 免疫磁珠法分選具有特異性強、純度較高、不影響外泌體結構形態(tài)的特點，但是效率低，且磁珠較為昂貴，難以普及。免疫磁珠分選步驟如圖3所示。董寧［28］利用修飾了Glypican?1抗體的免疫磁珠來分離胰腺癌細胞培養(yǎng)上清液中的外泌體。據該報道，這種免疫磁珠分選法能夠特異性的識別胰腺癌外泌體，且操作簡便，樣品消耗較少。雖然免疫磁珠法具有、特異性強、純度高的優(yōu)勢，但Batrakova等［29］指出腫瘤的異質性可能對特異性識別造成不利影響，并且抗原表位可以被阻斷或掩蔽，同樣不利于特異性識別。

圖3 免疫磁珠法步驟

3.7 微流控芯片法 傳統(tǒng)的外泌體分離方法消耗的樣品量較大，不利于稀缺樣品量的分離，且樣品的分離與檢測是分開進行的。從外泌體的分離純化到最后經過形態(tài)學和分子生物學鑒定，要經過多道程序。一種快速簡便集成分離和檢測的方法是必不可少的，因此，近年來利用微流控芯片來分離外泌體得到眾多學者的關注［30－31］。 近日，美國杜克大學 Wu 等［32］研發(fā)了一種聲波?微流控技術，該技術利用聲壓節(jié)點使不同大小的顆粒或細胞偏離中心，從而使在通道末端不同大小的顆?；蚣毎环珠_。這種技術可在不到25 min的時間里處理100 μL未稀釋的血液樣本，且樣本回收率及純度分別可達到82.4%和98.4%。此外，該研究團隊利用納米粒子追蹤分析技術（NTA），得出分離前后直徑小于140 nm的顆粒分別占總顆粒數目的23.6%和23.3%的結論，證明了該技術在分離過程中外泌體損失極少。美國斯坦福大學的Liu等［33］研發(fā)出了一種外泌體全分離芯片（以下簡稱EXOTic）。為研究細胞外囊泡（以下簡稱EVs）尺寸對蛋白質表達譜的影響，研究人員采用兩種不同孔徑濾膜的芯片分離前列腺癌細胞系的EVs，并與超速離心法對比。研究結果表明，EXOTic相較于超速離心法分離出的EVs含有更多種類的蛋白質。與此同時，韓國一研究團隊在ACS Nano公布了一種基于尺寸的臺式離心微流體系統(tǒng)（以下簡稱Exodisc）［34］，該技術通過兩個集成的納米級濾膜，可在30 min內全自動富集20～600 nm的EVs。該研究團隊將Exodisc富集細胞外囊泡的效率同超速離心法對比（表1）。顯然，相較于超速離心法，Exodisc分離、富集EVs的效率更高。

表1 Exodisc與超速離心法富集效率對比

最近，中科院Liu等［35］研發(fā)了一種基于微流體粘彈性流動的無外場外泌體分離技術，該技術可以獲得高純度（＞90%）、高回收率（＞80%）的外泌體。該技術的特點是僅需極少量的（0.1%）PEO（聚環(huán)氧乙烷）就可在無外場的情況下實現外泌體分離。PEO的加入使得流體產生了較高的粘彈性，因此，在泊肅葉流中懸浮的納米顆粒上產生了可控制粒子橫向位置的彈性升力。此外，外泌體通過微流道的時間小于0.1 s，大大地減少了分離過程中對外泌體造成的物理破壞。

與傳統(tǒng)方法相比，微流控技術具有顯著的潛力與廣闊的前景。一方面，微流控技術能夠分離小體積樣品中的外泌體，有助于臨床前腫瘤小動物模型試驗的研究。Kong等［36］建立了一種研究腫瘤轉移的仿生微流控模型，相較于傳統(tǒng)的小動物腫瘤轉移模型，該模型為動物模型試驗提供了一種低成本、省時、快速的替代方法。另一方面，就臨床潛力來講，微流體技術自動化程度高，所需樣品量小，相較于超速離心法更適合臨床應用。

表2 各類外泌體分離方法優(yōu)缺點比較

4 外泌體的鑒定及定量方法

4.1 外泌體表面蛋白鑒定

4.1.1 Western blotting 法 Western blotting 法又稱蛋白質印跡法，是一種非常有用的鑒定蛋白質的方法。由于外泌體膜表面存在特異蛋白“四跨膜家族”，因此利用WB法可以很好地鑒定外泌體。

4.1.2 BCA 蛋白檢測法 Bicinchoninic acid （BCA）法是近來廣泛應用的蛋白定量方法之一。與外泌體分離方法一樣，蛋白質定量方法至今還沒有出現一種廣泛適用于任何需求的方法，現在的各種蛋白質定量法都各有各的長處與不足。因此，在定量蛋白質時往往采取不只一種方法來排除不相干因素的影響。本文介紹的BCA法靈敏度高，操作簡易，受干擾物質的影響小。BCA法的顯著優(yōu)點是不受去垢劑的影響。

4.2 外泌體尺寸特征鑒定

4.2.1 透射電子顯微鏡 1933年，德國科學家Ruska和Knoll研制出了世界上第一臺透射電鏡（transmis?sion electron microscope，TEM），其分辨能力是光學顯微鏡的20倍。到現在，透射電子顯微鏡已經誕生了80多年，其分辨能力也比1933年時提高了超過100倍，目前TEM的分辨力可達0.2 nm。研究者可以利用TEM觀測納米顆粒的直徑、形狀、結構等，如外泌體、病毒、抗體疫苗等顆粒。但是，由于透射電鏡視野的局限性，TEM無法為研究者提供可靠、相對準確的外泌體濃度。

4.2.2 納米粒子追蹤分析法 納米粒子追蹤分析技術（nanoparticle tracking analysis，NTA）是近年來納米級別測量領域的一顆冉冉升起的新星，它是一種能夠表征納米顆粒分布的動態(tài)光散射技術。納米粒子追蹤分析法獨特的測量技術可以為研究者提供可靠的外泌體實時濃度信息，可以對外泌體進行定量檢測。電子顯微鏡的樣本在使用前通常需要經過干燥、固定等有可能損壞外泌體的結構與功能。與此不同，納米顆粒追蹤分析儀具備的溶液狀態(tài)可以使外泌體在被測量時更接近其原始狀態(tài)，不僅能夠保證其結構與功能的完好性，而且使研究結果更加真實有效。

4.2.3 原子力顯微鏡 原子力顯微鏡（automic force microscopy，AFM）具有非常廣泛的適用性，并且具有諸多優(yōu)點。與電子顯微鏡不同，AFM能夠提供真正的三維表面圖。其次，AFM不需要對樣品進行預處理。此外，AFM對工作環(huán)境、樣品制備的要求比電鏡低得多，因此得到了廣泛的應用［37］。

5 結論與展望

越來越多的研究已經證實外泌體對疾病體外診斷具有重要的標志性價值，因此外泌體的分離和富集技術的可靠性尤為重要。外泌體分離技術種類較多，每一種分離方法都是基于外泌體某一獨特的性質，如尺寸、密度、可壓縮率，表面蛋白等。但是，這些分離技術尚存在回收率低、純度低、可能會受到污染等問題，嚴重影響下游結果的分析?？傮w來說，外泌體分離還沒有形成一種高效的、大家共同認可的技術方法。

微流控技術在微觀領域良好的性能在外泌體分離上得到了發(fā)揮，已有學者在微流控芯片上對外泌體進行分離、檢測和量化，甚至對外泌體表面多種標志物進行檢測。利用微流控技術分離方法和傳統(tǒng)方法相比，分離和富集效率更高，對外泌體造成的物理損害大大減小，并且分離速度更快。雖然該方法還不是特別完善，尚未得到大家統(tǒng)一共識，但是其良好的性能已經在目前的研究中得到了驗證。因此，還需要學者們對微流控技術分離外泌體方法的可靠性進行大量的驗證。只有研究開發(fā)出高效可靠的外泌體分離和檢測方法，外泌體在醫(yī)療診斷、檢測上的獨特性能才能得到有效的發(fā)揮。體外檢測技術在疾病診斷中的應用也將因此達到新的高度。

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