牛小豆 李子健 張永珍

100191 北京大學第三醫(yī)院心內(nèi)科，血管醫(yī)學研究所，衛(wèi)生部心血管分子生物學與調(diào)節(jié)肽重點實驗室，分子心血管學教育部重點實驗室，心血管受體研究北京市重點實驗室

循證醫(yī)學證據(jù)表明，冠心病、高血壓、心肌病和心力衰竭等多種心血管疾病在流行病學、臨床表現(xiàn)等方面均存在明顯的性別差異[1]，女性心血管疾病的臨床表現(xiàn)、病理生理和預后與男性不同[2]，這種性別的不同可能部分源于心臟功能強弱的差異[3]。但對單個心肌細胞，較少有研究評價其功能是否也存在性別差異。

收縮力是心肌細胞最具代表性的功能，主要反映心肌細胞發(fā)生縮短的內(nèi)在動力，因其能夠?qū)?nèi)外源刺激做出反應，可作為預示健康和疾病心肌的重要指標[4-5]。由于單個心肌細胞的收縮與整體心臟功能具有良好的相關性，故對單個心肌細胞施加刺激因素，應用電生理、鈣離子成像、細胞力學、免疫組織化學、細胞生物化學等方法對心肌細胞進行觀察及定量分析，即可獲取對心臟功能的深入了解[4，6]。

Ca2+是連接細胞膜表面動作電位與心肌細胞收縮的重要介質(zhì)，在興奮-耦聯(lián)過程中起關鍵作用，其濃度變化調(diào)節(jié)心肌細胞收縮和舒張[7]。在心肌細胞的一個收縮周期中，去極化刺激引起細胞膜L型鈣通道開放，少量Ca2+由胞外進入心肌細胞內(nèi)，觸發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣庫釋放大量的Ca2+，進而引起心肌收縮，這種由心肌細胞膜去極化誘發(fā)的細胞內(nèi)Ca2+濃度瞬時性增高，稱為鈣瞬變。檢測鈣瞬變的變化有助于深入了解心肌細胞電活動狀態(tài)。

在本研究中，我們采用主動脈逆行灌流和膠原酶Ⅱ消化的方法分離成年小鼠心肌細胞，旨在測定并比較不同性別成年小鼠心肌細胞收縮力和鈣瞬變，評價性別對成年小鼠心肌細胞功能的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

8～12周齡C57BL/6小鼠來源于北京大學醫(yī)學部實驗動物中心[實驗動物使用許可證號：SYXK(京)2016-0041；實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(京)2016-0010]，體重24～27g，飼養(yǎng)溫度(25±2)℃，12 h/12 h明暗交替，所有動物實驗遵守北京大學生物醫(yī)學研究倫理要求。

2，3-丁二酮一肟(BDM)購自Sigma-Aldrich公司；Ⅱ型膠原酶及Fura-2，AM購自Invitrogen公司；細胞收縮及離子濃度同步測量系統(tǒng)購自IonOptix公司。

1.2 方法

1.2.1 小鼠心肌細胞的分離 小鼠稱重，腹腔內(nèi)注射肝素(250 U/50 g體重)，20 min后腹腔內(nèi)注射0.1%戊巴比妥鈉(5 ml/kg)進行麻醉。迅速開胸取心臟，將主動脈根部掛于Langendorff 裝置，調(diào)節(jié)灌流液流速至3 ml/min，用含15 mM BDM的臺式液灌流3 min，換酶液灌流消化25 min，保持灌流液的溫度為37 ℃。待心臟軟化后，剪下心室部分，于酶液中剪碎，鈍口玻璃吸管輕柔吹打，經(jīng)80目細胞濾網(wǎng)過濾，除去較大的組織塊，500 r/min離心5 min，棄去上清液。按照液體Ca2+濃度0.6 mM-1.2 mM-1.8 mM順序梯度復鈣，即：(1)加入B液，輕柔吹勻后，自然沉降10 min，棄去上清；(2)加入B液、C液等體積預先混勻的液體，輕柔吹勻后，自然沉降10 min，棄去上清；(3)加入C液，輕柔吹勻后，自然沉降10 min。

1.2.2 液體配制 臺式液：NaCl(137 mM)、KCl(5.4 mM)、HEPES(20 mM)、MgCl2(1.2 mM)、NaH2PO4·2H2O(1.2 mM)、Glucose(10 mM)、Taurine(10 mM)，用濃度為2 M的NaOH 調(diào)節(jié)pH值至7.35～7.45，經(jīng)95%O2、5%CO2氧飽和30 min。酶液：18 mgⅡ型膠原酶(260 IU/mg)，15 mg BSA，22.5 mg BDM，用臺式液定容至15 ml。B液：15 mg BSA，用臺式液定容至15 ml，加入濃度為1 M的CaCl2母液9 μL，使Ca2+終濃度為 0.6 mM。C液：15 mg BSA，用臺式液定容至15 ml，加入濃度為1 M的CaCl2母液27 μL，使Ca2+終濃度為1.8 mM。以上所有液體，均經(jīng)0.22 μm孔徑的濾器過濾后使用。

1.2.3 心肌細胞收縮力和鈣瞬變的檢測 心肌細胞負載熒光染料 Fura-2，AM，負載濃度為1 μM ，室溫避光孵育20 min。向臺式液中加入1 M的CaCl2母液使Ca2+終濃度為1.8 mM。棄去上清，加入含1.8 mM Ca2+的臺式液輕柔吹打洗滌，室溫沉降10 min，棄去上清液，目的是去除殘余染料。取一滴細胞懸液上機檢測，細胞沉降5 min后，給予10 V、0.5 HZ電場刺激，同時以含1.8 mM Ca2+的臺式液灌流，以便及時補充細胞收縮及代謝所需能量和電解質(zhì)，并去除代謝產(chǎn)物，防止對細胞產(chǎn)生毒性。使心肌細胞穩(wěn)定至少2 min后，記錄心肌細胞肌節(jié)長度變化及鈣瞬變幅度變化。實驗數(shù)據(jù)用IonWizard 6.2軟件分析。

1.3 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 兩組小鼠心肌細胞形態(tài)比較

光學顯微鏡下觀察，桿狀細胞約70%～80%，細胞邊緣銳利、橫紋清晰、折光性好，且復鈣后約60～70%的細胞呈靜息狀態(tài)，無自發(fā)收縮，提示細胞狀態(tài)良好。用激光共聚焦顯微鏡觀察并記錄細胞形態(tài)，比較不同性別成年小鼠心肌細胞，發(fā)現(xiàn)其形態(tài)外觀無明顯差別 (圖1)。

A：成年雄性C57BL/6小鼠心肌細胞形態(tài)；B：成年雌性C57BL/6小鼠心肌細胞形態(tài)圖1 不同性別C57BL/6成年小鼠心肌細胞形態(tài)比較

2.2 兩組小鼠心肌細胞收縮力比較

在同樣的電場刺激條件下，檢測兩組小鼠的心肌細胞收縮力，發(fā)現(xiàn)成年雄性C57BL/6小鼠心肌細胞肌節(jié)縮短幅度[(0.14±0.02)μm比(0.08±0.01)μm，t=2.796，P=0.008](圖2)、肌節(jié)縮短率(7.47%±0.93% 比 4.60%±0.59%，t=2.608，P=0.0128)均明顯高于雌性小鼠。進一步分析發(fā)現(xiàn)，給予電刺激后，雄性小鼠心肌細胞最大收縮速度[(-3.25±0.37) μm/s比(-2.11±0.38) μm/s，t=2.163，P=0.0364]及最大舒張速度[(2.45±0.29)μm/s比(1.57±0.31)μm/s，t=2.096，P=0.0421]均高于雌性小鼠心肌細胞。

A：成年雄性小鼠；B：成年雌性小鼠圖2 不同性別C57BL/6成年小鼠心肌細胞收縮力比較

2.3 兩組小鼠心肌細胞鈣瞬變比較

在相同電場刺激條件下，檢測不同性別成年C57BL/6小鼠心肌細胞鈣信號變化，發(fā)現(xiàn)雄性小鼠心肌細胞鈣瞬變的峰值[(0.94±0.06)F340/F380值 比(0.77±0.03)F340/F380值，t=2.843，P=0.010]及鈣瞬變幅度[(0.25±0.04)F340/F380值 比(0.16±0.03)F340/F380值，t=2.218，P=0.040]均明顯高于雌性小鼠(圖3)。進一步分析發(fā)現(xiàn)，雄性小鼠舒張期鈣離子消除時間常數(shù)明顯小于雌性小鼠[(122.40±22.99)ms比(189.20±19.54)ms，t=2.112，P=0.049]，提示雄性成年小鼠心肌細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)回攝Ca2+的速率大于雌性成年小鼠心肌細胞。

A：成年雄性小鼠；B：成年雌性小鼠圖3 兩組小鼠心肌細胞鈣瞬變比較

3 討論

性別影響心臟損傷的表現(xiàn)和預后。在給予短時程、大劑量異丙腎上腺素引起的心肌損傷模型中，對于相同的應激損傷刺激，雄性小鼠比雌性小鼠更易發(fā)生心肌細胞破裂和心臟肥厚[8]。在臨床中，絕經(jīng)前女性罹患心血管疾病的風險亦顯著低于同年齡男性，其臨床表現(xiàn)、藥物治療及預后等也不盡相同[9-10]，因此心臟功能有明顯的性別差異。然而，目前關于離體單個細胞的功能是否存在差異的報道較少，因此有必要探討細胞水平的功能是否存在性別差異。本研究比較了不同性別C57BL/6成年小鼠心肌細胞收縮力和鈣瞬變，發(fā)現(xiàn)成年雄性小鼠心肌細胞收縮力和鈣瞬變均高于同年齡的成年雌性小鼠心肌細胞。因此，在基礎研究中，不區(qū)分小鼠性別將會增大細胞間的差異，需要選用同一性別的小鼠或者選取匹配只數(shù)和性別的小鼠分離的心肌細胞。

研究表明，雌激素可通過多種機制影響心肌細胞的電-機械活動。Kravtsov等[11]研究表明，與對照組相比，卵巢切除術后成年大鼠的心肌細胞肌質(zhì)網(wǎng)蘭尼丁受體及鈉-鈣交換通道活性增加，收縮和舒張能力均增強，而給予雌激素則能夠逆轉(zhuǎn)這種改變，表明雌激素能夠抑制心肌細胞收縮力，這與本研究結果一致。關于其機制，既往研究顯示，雌激素可以下調(diào)β1腎上腺素受體(β1AR)的表達并抑制細胞蛋白激酶A的活性，進而抑制下游鈣通道的激活，減少Ca2+內(nèi)流，最終抑制心臟功能[11-12]；此外，心肌細胞收縮力還受肌絲蛋白的轉(zhuǎn)錄后修飾、肌絲蛋白對Ca2+的敏感性等多種因素影響[12]。因此，成年雄鼠心肌細胞收縮力高于雌鼠的具體機制仍需進一步研究。此外，Ca2+是心肌細胞最重要的第二信使，在調(diào)節(jié)心肌收縮、電信號傳導及心臟節(jié)律中具有重要作用[13]。Fares等[14]研究證實，卵巢切除術后成年C57BL/6小鼠的心肌細胞Ca2+釋放幅度較假手術組明顯增加；同時，研究發(fā)現(xiàn)雌激素能夠抑制心肌細胞肌絲對Ca2+的敏感性，表明雌激素能夠負調(diào)控細胞內(nèi)鈣離子水平[15]，這與本研究中成年雌鼠心肌細胞鈣瞬變低于雄鼠的發(fā)現(xiàn)類似。Ca2+調(diào)節(jié)蛋白或離子通道，如受磷蛋白、鈣離子-鈣調(diào)蛋白依賴的蛋白激酶Ⅱ(CaMKⅡ)、NCX、Ryr、肌漿網(wǎng)鈣離子ATP酶等均能對鈣瞬變的幅度或者時程進行調(diào)控，因此需要進一步探索Ca2+相關調(diào)控蛋白及離子通道是否參與調(diào)控。

綜上所述，本文發(fā)現(xiàn)成年雄性C57BL/6小鼠心肌細胞收縮力和鈣瞬變高于雌性小鼠。因此，研究中應考慮到性別對成年小鼠心肌細胞功能的影響。

利益沖突：無

參 考 文 獻

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