杜 楠，王 璐，白 鴿，張明星，肖婭萍,張 坤，王 攀，王筱冰，劉全宏1,

(1藥用植物資源與天然藥物化學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西 西安 710062;2西北瀕危藥材資源開(kāi)發(fā)國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室，陜西 西安 710062;3陜西師范大學(xué) 生命科學(xué)院，陜西 西安 710062)

絞股藍(lán)(Gynostemmapentaphyllum(Thunb.)Makino)為葫蘆科(Cucurbitaceae)絞股藍(lán)屬多年生草質(zhì)藤本植物，又名五葉參、七葉參等。絞股藍(lán)是除五加科人參屬植物以外唯一含有人參皂苷的植物，且較人參更易栽培，優(yōu)良品種中人參皂苷的含量甚至高于人參，因此獲得了“南方人參”的美譽(yù)[1]。絞股藍(lán)屬于雌雄異株，自然條件下結(jié)種量較小，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，絞股藍(lán)主要依靠根狀莖來(lái)繁殖。而對(duì)于絞股藍(lán)種子，一方面尚未引起人們的充分重視而研究甚少；另一方面其通常只用于有性繁殖，或廢棄而未得到充分利用。絞股藍(lán)籽油是從藥用植物絞股藍(lán)種子中提取獲得的天然植物油脂，其中含有超過(guò)80%的多不飽和脂肪酸及多種植物甾醇，具有作為食品添加劑、保健食品及藥品原料的開(kāi)發(fā)潛力[2]。Wang等[2-3]通過(guò)超臨界CO2法萃取絞股藍(lán)籽油，并對(duì)絞股藍(lán)籽油的油脂成分進(jìn)行了分析和抗氧化研究，但絞股藍(lán)籽油要開(kāi)發(fā)為一種新的食品資源，尚必須進(jìn)行食品安全毒理學(xué)評(píng)價(jià)，而相關(guān)研究尚未見(jiàn)報(bào)道。

衰老又稱老化，是機(jī)體退化時(shí)期生理紊亂及功能下降的一個(gè)不可逆的過(guò)程，也是一種自然而復(fù)雜的生物學(xué)過(guò)程。進(jìn)入21世紀(jì)后，全球開(kāi)始跨入一個(gè)人口老齡化社會(huì)。隨著2025年人口老齡化高峰期的到來(lái)，研究衰老及抗衰老已刻不容緩。D-半乳糖致小鼠衰老模型，主要原理是通過(guò)在一定時(shí)間內(nèi)連續(xù)注射D-半乳糖，增高機(jī)體細(xì)胞的半乳糖濃度，并在醛糖還原酶催化作用下將D-半乳糖還原成半乳糖醇，由于機(jī)體不能正常代謝該物質(zhì)，于是這一物質(zhì)便堆積在細(xì)胞中使細(xì)胞的正常滲透壓受到影響，導(dǎo)致細(xì)胞腫脹、代謝紊亂和功能障礙，最終導(dǎo)致機(jī)體衰老[4-10]。

本研究以急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)、小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核試驗(yàn)、小鼠精子畸形試驗(yàn)來(lái)評(píng)價(jià)絞股藍(lán)籽油的食品安全性，并通過(guò)頸背部皮下注射D-半乳糖建立小鼠衰老模型，檢測(cè)血清和組織中的生理生化指標(biāo)，觀察小鼠肝組織切片，研究絞股藍(lán)籽油的抗衰老作用，以期為絞股藍(lán)籽油的生物學(xué)功能研究及其新資源的開(kāi)發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

絞股藍(lán)籽油經(jīng)超臨界CO2萃取制備。試驗(yàn)動(dòng)物為健康昆明種小鼠，購(gòu)買于安徽醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。

1.2 試劑與儀器

主要試劑有：注射用環(huán)磷酰胺，江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司；Giemsa染色液，北京雷根生物技術(shù)有限公司；D-半乳糖，美國(guó)Sigma公司；無(wú)水乙醇、石蠟、二甲苯、氯化鈉、鹽酸、蘇木精、伊紅、多聚甲醛、中性樹(shù)膠、抗壞血酸(VC)，均購(gòu)自天津市天力化學(xué)試劑有限公司；超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒、丙二醛(MDA)試劑盒、總抗氧化能力(T-AOC)試劑盒、過(guò)氧化氫酶(CAT)試劑盒，均購(gòu)自南京建成生物工程研究所；總膽固醇(TC)試劑盒、甘油三酯(TG)試劑盒、低密度脂蛋白(LDL)試劑盒、高密度脂蛋白(HDL)試劑盒，均購(gòu)自吉林長(zhǎng)春匯力生物技術(shù)有限公司。

主要儀器設(shè)備有：可拍照光學(xué)顯微鏡(P95-C MOTIC2506)，德國(guó)Zeiss公司；HH-6B型數(shù)顯恒溫水浴鍋，江蘇常州國(guó)華電器有限公司；SL202型藥物電子天平，上海明橋精密科學(xué)儀器有限公司；H-1型漩渦混勻器，上?？岛坦怆妰x器有限公司；JB-3型磁力攪拌器，杭州儀表機(jī)電有限公司；TGL-20bR型高速冷凍離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠；KD-1508A型輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)，浙江金華儀器有限公司；Nikon E2000型光學(xué)顯微鏡，Nikon公司；Epoch超微量微孔板分光光度計(jì)，美國(guó)BioTek公司；動(dòng)物手術(shù)器械，廣東醫(yī)療器械廠。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 小鼠急性經(jīng)口毒性試驗(yàn) 選用健康昆明種小鼠40只，體質(zhì)量18～22 g，適應(yīng)性喂養(yǎng)2～3 d后隨機(jī)分為空白對(duì)照組和高、中、低劑量組，每組10只，雌雄各半，在相同條件下分籠飼養(yǎng)。灌胃絞股藍(lán)籽油前禁食16 h左右，空白對(duì)照組灌胃生理鹽水，劑量為10.0 g/kg;絞股藍(lán)籽油高(GPSO-H)、中(GPSO-M)、低(GPSO-L)劑量組灌胃劑量分別設(shè)置為4.6，10.0及21.5 g/kg，經(jīng)口進(jìn)行一次性灌胃后，連續(xù)觀察14 d，記錄小鼠的飲食、運(yùn)動(dòng)、排泄、中毒表現(xiàn)及死亡情況。測(cè)定經(jīng)口半數(shù)致死劑量(LD50)，若劑量超過(guò)10.0 g/kg仍不能引起動(dòng)物死亡，初步認(rèn)定受試樣品無(wú)毒或低毒。

1.3.2 小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核試驗(yàn) 選用健康昆明種小鼠50只，體質(zhì)量18～22 g，隨機(jī)分為空白對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組和高、中、低劑量組，每組10只，雌雄各半。空白對(duì)照組灌胃生理鹽水，劑量為10.0 g/kg;陽(yáng)性對(duì)照組用環(huán)磷酰胺(CTX，40 mg/kg)進(jìn)行腹腔注射，每天1次，連續(xù)5 d;絞股藍(lán)籽油高(GPSO-H)、中(GPSO-M)、低(GPSO-L)劑量組以2.5，5.0及10.0 g/kg的灌胃劑量連續(xù)灌胃絞股藍(lán)籽油5 d，每天1次，最后1次灌胃后24 h處死小鼠，取股骨骨髓，制作骨髓細(xì)胞涂片，甲醇固定15 min，Giemsa染色10～15 min，雙盲法鏡檢，每只小鼠計(jì)數(shù)1 000個(gè)嗜多染紅細(xì)胞(Polychromatic erythrocyte，PCE)中含微核的PCE數(shù)，并計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞中PCE與正染紅細(xì)胞(Normochromatic erythrocyte，NCE)的比值，微核發(fā)生率以千分率(‰)表示[11-12]。

1.3.3 小鼠精子畸形試驗(yàn) 選用體質(zhì)量30～35 g的性成熟昆明種雄性小鼠25 只，隨機(jī)分為空白對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組和絞股藍(lán)籽油高、中、低劑量組，每組5只，以腹腔注射40 mg/kg的環(huán)磷酰胺為陽(yáng)性對(duì)照，每天1次，連續(xù)5 d，絞股藍(lán)籽油低、中、高組以2.5,5.0及10.0 g/kg的灌胃劑量連續(xù)灌胃絞股藍(lán)籽油5 d，最后1次灌胃7，14，21，28，35 d后分別處死小鼠，取兩側(cè)附睪剪碎，制備精子涂片，甲醇固定，質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%伊紅染色10 min，油鏡下觀察，每只小鼠計(jì)數(shù)1000個(gè)結(jié)構(gòu)完整的精子細(xì)胞，依據(jù)精子畸變分型，統(tǒng)計(jì)每1 000個(gè)結(jié)構(gòu)完整的精子細(xì)胞中畸變精子的數(shù)量，計(jì)算精子畸形率，以千分率(‰)表示[13]。

1.3.4 抗衰老研究 將雌性昆明小鼠飼養(yǎng)在通風(fēng)良好、濕度和溫度均適宜的環(huán)境中，自由攝食和飲水，期間觀察小鼠狀態(tài)，適應(yīng)性飼養(yǎng)2～3 d后進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。將每只小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)后稱質(zhì)量,隨機(jī)分成6組，即空白對(duì)照組、衰老模型組、陽(yáng)性對(duì)照組和絞股藍(lán)籽油低(GPSO-L)、中(GPSO-M)、(GPSO-H)劑量組，每組10只。其中空白對(duì)照組每天頸背部皮下注射400 mg/kg生理鹽水，其余各組每天頸背部皮下注射D-半乳糖400 mg/kg。衰老模型組和空白對(duì)照組每天灌胃4 mL/kg的生理鹽水，陽(yáng)性對(duì)照組每天灌胃100 mg/kg的抗壞血酸(VC)，絞股藍(lán)籽油低、中、高劑量組分別按2.0，3.0和4.0 mL/kg劑量每天灌胃絞股藍(lán)籽油，連續(xù)給藥60 d。在試驗(yàn)過(guò)程中小鼠正常飼養(yǎng)，每7 d稱量記錄體質(zhì)量1次，并觀察小鼠狀態(tài)。在末次給藥后，所有小鼠禁食不禁水12 h后頸椎脫臼法處死，試劑盒測(cè)定血清總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白(LDL)、高密度脂蛋白(HDL)濃度及肝、腦組織超氧化物歧化酶(SOD)、總抗氧化能力(T-AOC)、過(guò)氧化氫酶(CAT)活性及丙二醛(MDA)含量等各項(xiàng)生理生化指標(biāo)[9]。

1.3.5 臟器指數(shù) 將所有小鼠稱質(zhì)量后處死，取出胸腺、肝臟、脾臟、腎臟以及腦組織分別稱質(zhì)量，計(jì)算各臟器指數(shù)。計(jì)算公式如下：

臟器指數(shù)=臟器質(zhì)量/體質(zhì)量。

1.3.6 測(cè)試樣品的制備 (1)血清。各組小鼠末次給藥禁食12 h后，眼眶取血，將采集的血液在3 000 r/min下低溫離心10 min，取上層血清保存于-20 ℃冰箱中待測(cè)。(2)組織勻漿的制備。取出各組小鼠腦和肝組織后，冰浴生理鹽水沖洗干凈，濾紙吸干，稱取1.0 g組織置于研缽中，在低溫條件下加入冰浴生理鹽水9 mL研磨成體積分?jǐn)?shù)10%的組織勻漿液，在3 000 r/min下低溫離心10 min，取上清液保存于-20 ℃冰箱中待測(cè)。

1.3.7 肝臟組織病理學(xué)石蠟切片的制作 每組隨機(jī)取3塊肝臟，在肝小葉部分剪取5 mm×5 mm的方塊，用于石蠟切片的制作。制作流程如下：固定(體積分?jǐn)?shù)10%福爾馬林)→脫水(體積分?jǐn)?shù)50%～100%乙醇梯度脫水)→透明(二甲苯)→包埋(軟蠟，硬蠟)→切片→脫蠟(二甲苯)→染色(H&E)→封片(中性樹(shù)脂)→鏡檢。

(1)透明。取出在福爾林固定液中固定24 h的小鼠肝臟組織塊，流水沖洗，用體積分?jǐn)?shù)50%～100%的乙醇梯度洗脫，逐漸脫去組織中的水分，然后用二甲苯逐步透明。以上每步均進(jìn)行30 min。

(2)石蠟包埋。將已透明的肝臟組織塊，按組別分別轉(zhuǎn)置于盛有已熬好軟蠟的蠟杯中，放入60 ℃保溫箱內(nèi)，待石蠟完全浸入組織塊后，用硬蠟進(jìn)行包埋。

(3)切片。將包埋好組織的蠟塊修好后，用切片機(jī)連續(xù)切片，其厚度為6 μm，附于用固定液處理好的載玻片上進(jìn)行貼片，40 ℃恒溫烘干。

(4)H&E染色。二甲苯脫去切片中的石蠟，體積分?jǐn)?shù)100%～50%乙醇梯度脫水，蒸餾水水洗，以上每步均進(jìn)行5 min。然后蘇木精染色4 min，自來(lái)水沖洗至泛藍(lán)色，鹽酸酒精分色2～5 s，體積分?jǐn)?shù)50%～90%乙醇梯度脫水，伊紅染色4 min，二甲苯透明，中性樹(shù)脂封片成永久切片。

(5)鏡檢。在光學(xué)顯微鏡下觀察各組小鼠肝臟組織病理學(xué)變化，拍攝并保存照片。

1.3.8 血清及腦、肝組織生理生化指標(biāo)的檢測(cè) 按照試劑盒使用說(shuō)明書(shū)測(cè)定血清總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白(LDL)、高密度脂蛋白(HDL)濃度及肝、腦組織超氧化物歧化酶(SOD)、總抗氧化能力(T-AOC)、過(guò)氧化氫酶(CAT)活性及丙二醛(MDA)含量等指標(biāo)。每個(gè)樣品均重復(fù)3次，以降低誤差確保試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用SPAA20.0分析軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行t檢驗(yàn)方差分析及多重比較，差異顯著性用P<0.05或P<0.01表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 小鼠急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)

急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)結(jié)果表明，在空腹灌胃4.6，10 .0和21.5 g/kg絞股藍(lán)籽油4 h后，各劑量組小鼠均未見(jiàn)明顯的中毒癥狀，常規(guī)飼養(yǎng)14 d內(nèi)小鼠生長(zhǎng)發(fā)育正常，毛色光澤良好，飲食、運(yùn)動(dòng)、排泄均未見(jiàn)異?，F(xiàn)象，無(wú)小鼠死亡。試驗(yàn)期間受試動(dòng)物均未見(jiàn)明顯中毒反應(yīng)且無(wú)動(dòng)物死亡，表明絞股藍(lán)籽油對(duì)雌雄小鼠急性經(jīng)口LD50值均大于10.0 g/kg，依據(jù)急性毒性劑量分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)屬于實(shí)際無(wú)毒物質(zhì)，可進(jìn)入下一階段毒理學(xué)試驗(yàn)。

2.2 小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核試驗(yàn)

空白對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組及絞股藍(lán)籽油低、中、高劑量組小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞的統(tǒng)計(jì)結(jié)果如表1所示。

表1 小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核試驗(yàn)結(jié)果Table 1 Effect of GPSO on microkernel rate of polychromatic erythrocytes in mice

注：**表示與空白對(duì)照組相比差異極顯著(P<0.01)。表2同。

Note：** means highly significant difference compared with control group(P<0.01).The same for Table 2.

表1結(jié)果表明，絞股藍(lán)籽油低、中、高3個(gè)劑量組雌雄小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核發(fā)生率為2.0‰～3.8‰，與空白對(duì)照組相比均無(wú)顯著性差異(P>0.05)，亦無(wú)劑量依賴效應(yīng)；但陽(yáng)性對(duì)照組雌、雄小鼠骨髓嗜多染細(xì)胞的微核發(fā)生率達(dá)到31.2‰和39.4‰，與其他組相比均有極顯著差異(P<0.01)。說(shuō)明在本試驗(yàn)劑量范圍內(nèi)，絞股藍(lán)籽油不會(huì)對(duì)小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核數(shù)造成顯著影響，即受試樣品的微核試驗(yàn)結(jié)果為陰性。

2.3 精子畸形試驗(yàn)

絞股藍(lán)籽油對(duì)小鼠精子畸形率的影響如表2所示。與骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn)結(jié)果相似，陽(yáng)性藥物處理后，小鼠精子的畸形率為6.52‰，極顯著高于空白對(duì)照組及其他各劑量組(P<0.01)，而絞股藍(lán)籽油低、中、高劑量組小鼠精子畸形率分別為2.24‰，1.82‰和2.02‰，與空白對(duì)照組相比無(wú)顯著差異(P>0.05)，表明絞股藍(lán)籽油對(duì)小鼠精子無(wú)致畸變作用，試驗(yàn)結(jié)果為陰性。

表2 小鼠精子畸形試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Effect of GPSO on sperm abnormality rate in mice

2.4 絞股藍(lán)籽油對(duì)D-半乳糖致衰老小鼠體質(zhì)量的影響

絞股藍(lán)籽油對(duì)各試驗(yàn)組小鼠體質(zhì)量的影響如表3所示。由表3可知，在試驗(yàn)開(kāi)始后的49 d內(nèi)，各試驗(yàn)組小鼠體質(zhì)量總體上呈持續(xù)增長(zhǎng)趨勢(shì)，但增長(zhǎng)幅度整體較小?？傮w上看，衰老模型組小鼠體質(zhì)量增長(zhǎng)最為緩慢，在42 d后其體質(zhì)量一直呈下降趨勢(shì)，試驗(yàn)結(jié)束時(shí)該組小鼠體質(zhì)量最低。在56 d時(shí)，所有小鼠體質(zhì)量都有所下降，可能是處死之前斷食所致。

表3 絞股藍(lán)籽油對(duì)D-半乳糖致衰老小鼠體質(zhì)量的影響Table 3 Effect of GPSO on body weight of aging g

注：與空白組相比，*表示差異顯著(P<0.05)，**表示差異極顯著(P<0.01)；與衰老模型組相比, #表示差異顯著(P<0.05)，##表示差異極顯著(P<0.01)。下表同。

Note：*means significant difference compared with control group (P<0.05),**means highly significant difference compared with control group(P<0.01)；#means significant difference compared with aging model group(P<0.05),##means highly significant difference compared with aging model group(P<0.01).The same below.

與空白對(duì)照組相比，衰老模型組小鼠在試驗(yàn)第42天時(shí)體質(zhì)量顯著降低(P<0.05)，在第21，49，56天時(shí)體質(zhì)量極顯著降低(P<0.01)。而絞股藍(lán)籽油低、中、高劑量組中，除絞股藍(lán)籽油中劑量組在21和49 d表現(xiàn)出顯著性差異外，其余各組均無(wú)明顯差異(P>0.05)。絞股藍(lán)籽油低、中、高劑量組與衰老模型組相比，除高劑量組在56 d時(shí)無(wú)顯著差異外，低、中劑量組在49,56 d均表現(xiàn)出極顯著差異(P<0.01)，并且絞股藍(lán)籽油低劑量組在14～28 d時(shí)有顯著差異，高劑量組在第21天有顯著差異。與衰老模型組相比，陽(yáng)性對(duì)照組在第35天開(kāi)始呈現(xiàn)顯著性差異，在最后1周時(shí)呈現(xiàn)極顯著差異。

表3結(jié)果說(shuō)明，D-半乳糖對(duì)小鼠食欲及吸食能力有一定影響，使其體質(zhì)量增加緩慢，而絞股藍(lán)籽油低、中、高劑量組緩解了這一癥狀，即絞股藍(lán)籽油可以改善D-半乳糖致衰老小鼠食欲及吸食能力的不斷下降，具有一定的抗衰老活性。

2.5 絞股藍(lán)籽油對(duì)D-半乳糖致衰老小鼠臟器指數(shù)的影響

D-半乳糖致衰老小鼠處死后，其肝臟指數(shù)、脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)、腎臟指數(shù)的計(jì)算結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 絞股藍(lán)籽油對(duì)D-半乳糖致衰老小鼠臟器指數(shù)的影響Table 4 Effect of GPSO on spleen index of aging

由表4可知，與空白對(duì)照組相比，衰老模型組小鼠肝臟指數(shù)極顯著減低(P<0.01)，脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)均顯著降低(P<0.05)；與衰老模型組相比，陽(yáng)性對(duì)照組小鼠肝臟指數(shù)和脾臟指數(shù)有顯著差異(P<0.05)，絞股藍(lán)籽油低、中、高劑量組小鼠的肝臟指數(shù)均有顯著差異(P<0.05)，中劑量組脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)也有顯著差異(P<0.05)。

臟器指數(shù)可反映動(dòng)物的健康狀況。對(duì)于脾臟指數(shù)而言，絞股藍(lán)籽油低、中、高劑量組小鼠與衰老模型組小鼠相比均呈升高趨勢(shì)，說(shuō)明灌胃絞股藍(lán)籽油可使小鼠脾臟趨于正常，增強(qiáng)小鼠免疫功能。對(duì)于胸腺指數(shù)而言，絞股藍(lán)籽油低、中、高劑量組小鼠與衰老模型組小鼠相比均呈現(xiàn)升高趨勢(shì)，說(shuō)明灌胃不同劑量絞股藍(lán)籽油均能提高小鼠胸腺的生理機(jī)能，從而達(dá)到增強(qiáng)小鼠免疫功能的目的。對(duì)于腎臟指數(shù)而言，各組小鼠均無(wú)明顯差異(P>0.05)，說(shuō)明陽(yáng)性對(duì)照組和灌胃絞股藍(lán)籽油對(duì)小鼠腎臟無(wú)明顯影響。

2.6 絞股藍(lán)籽油對(duì)D-半乳糖致衰老小鼠血清生化指標(biāo)的影響

對(duì)D-半乳糖致衰老小鼠血清中總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白(LDL)、高密度脂蛋白(HDL)濃度進(jìn)行測(cè)定，其結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 絞股藍(lán)籽油對(duì)D-半乳糖致衰老小鼠血清生化指標(biāo)的影響Table 5 Effect of GPSO on biochemical indexes in serum of aging mmol/mL

由表5所知，與空白對(duì)照組相比，衰老模型組小鼠血清TC、TG和LDL濃度顯著升高，HDL濃度顯著降低(P<0.05)。與衰老模型組相比，絞股藍(lán)籽油低、中、高劑量組小鼠TC濃度極顯著降低(P<0.01)，但灌胃絞股藍(lán)籽油各劑量組之間差異不明顯；與衰老模型組相比，灌胃絞股藍(lán)籽油中劑量組小鼠的TG濃度極顯著降低(P<0.01)，低、高劑量組小鼠TG濃度也有所降低，且差異達(dá)顯著水平(P<0.05)。與衰老模型組相比，絞股藍(lán)籽油低、中、高劑量組小鼠LDL濃度顯著降低，HDL濃度顯著上升，但3個(gè)劑量組間并無(wú)明顯差異。

2.7 絞股藍(lán)籽油對(duì)D-半乳糖致衰老小鼠肝臟組織生化指標(biāo)的影響

對(duì)D-半乳糖致衰老小鼠肝臟組織中超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、總抗氧化能力(T-AOC)、過(guò)氧化氫酶(CAT)等指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)，其結(jié)果見(jiàn)表6。

表6 絞股藍(lán)籽油對(duì)D-半乳糖致衰老小鼠肝臟組織生化指標(biāo)的影響Table 6 Effect of GPSO on biochemical indexes in liver of aging

由表6可知，與空白對(duì)照組相比，衰老模型組小鼠肝臟組織中的SOD活性和總抗氧化能力(T-AOC)極顯著降低，MDA含量和CAT活性極顯著升高,說(shuō)明衰老模型組小鼠肝臟總抗氧化能力下降，清除自由基的能力減弱，脂質(zhì)過(guò)氧化程度加深，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞損傷、機(jī)體衰老，說(shuō)明長(zhǎng)期注射D-半乳糖致小鼠衰老造模成功。

表6顯示，與衰老模型組相比，陽(yáng)性對(duì)照組和灌胃絞股藍(lán)籽油各劑量組小鼠的SOD活性均有所提高，其中陽(yáng)性對(duì)照組小鼠肝臟SOD水平的提高具有顯著性差異(P<0.05)，低劑量組和中劑量組小鼠SOD水平的提高具有極顯著差異(P<0.01)。說(shuō)明灌胃絞股藍(lán)籽油能在一定程度上增加小鼠肝臟的SOD活性。針對(duì)MDA而言，與衰老模型組相比，灌胃絞股藍(lán)籽油的各劑量小鼠的MDA含量均呈顯著下降趨勢(shì)，說(shuō)明灌胃絞股藍(lán)籽油能降低小鼠肝臟的MDA含量。針對(duì)總抗氧化能力(T-AOC)而言，與衰老模型組相比，灌胃絞股藍(lán)籽油的各劑量組小鼠的T-AOC活性顯著或極顯著提高，說(shuō)明灌胃絞股藍(lán)籽油可提高小鼠的總抗氧化能力。就CAT而言，與衰老模型組相比，灌胃絞股藍(lán)籽油低、中劑量小鼠的CAT活性均極顯著降低，高劑量組和陽(yáng)性對(duì)照組顯著降低，說(shuō)明灌胃絞股藍(lán)籽油可降低小鼠的過(guò)氧化程度，但是灌胃絞股藍(lán)籽油各劑量組小鼠的抗衰老能力并不會(huì)隨著劑量的增加而增大，因此絞股藍(lán)籽油對(duì)D-半乳糖致衰老小鼠抗衰老能力的提高不構(gòu)成劑量依賴關(guān)系。

2.8 絞股藍(lán)籽油對(duì)D-半乳糖致衰老小鼠腦組織生化指標(biāo)的影響

對(duì)D-半乳糖致衰老小鼠腦組織中超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、總抗氧化能力(T-AOC)指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定，其結(jié)果見(jiàn)表7。由表7可知，與空白對(duì)照組相比，衰老模型組小鼠腦組織中的SOD活性和總抗氧化能力(T-AOC)降低，MDA含量升高，且均達(dá)極顯著差異水平(P<0.01)，說(shuō)明衰老模型組小鼠腦組織總抗氧化能力下降，清除自由基能力降低，脂質(zhì)過(guò)氧化程度加深，亦證實(shí)了長(zhǎng)期注射D-半乳糖致小鼠衰老造模成功。

表7絞股藍(lán)籽油對(duì)D-半乳糖致衰老小鼠腦組織生化指標(biāo)的影響Table 7 Effect of GPSO on biochemical indexes in cerebrum of aging

與衰老模型組相比，除陽(yáng)性對(duì)照組小鼠T-AOC活性顯著升高外(P<0.05)，其余各組SOD、T-AOC活性和MDA含量均極顯著升高或降低(P<0.01)。說(shuō)明灌胃絞股藍(lán)籽油可降低小鼠腦組織脂質(zhì)過(guò)氧化程度，提高總抗氧化能力，提高自由基清除能力，但是不同劑量組氧化能力并不會(huì)隨著劑量的增加而增大，因此絞股藍(lán)籽油對(duì)D-半乳糖致衰老小鼠不構(gòu)成劑量依賴關(guān)系。

以上結(jié)果表明，絞股藍(lán)籽油抗衰老機(jī)理之一可能與其具有的抗氧化能力有關(guān)，其可以通過(guò)增強(qiáng)機(jī)體的總抗氧化能力并有效清除自由基，降低機(jī)體細(xì)胞損傷程度，間接保護(hù)正常細(xì)胞，從而起到抗衰老的作用。

2.9 絞股藍(lán)籽油對(duì)D-半乳糖致衰老小鼠肝臟組織病理變化的影響

對(duì)空白對(duì)照組、衰老模型組及絞股藍(lán)籽油低、中、高劑量組小鼠肝臟組織進(jìn)行病理學(xué)鏡檢，結(jié)果如圖1所示。

A.空白對(duì)照組；B.衰老模型組；C.陽(yáng)性對(duì)照組；D.絞股藍(lán)籽油低劑量組；E.絞股藍(lán)籽油中劑量組；F.絞股藍(lán)籽油高劑量組A.Control group;B.Aging-model group;C.Positive control group;D.GPSO-L;E.GPSO-M;F.GPSO-H圖1 各組小鼠肝臟組織HE染色病理切片的顯微鏡檢(×40)Fig.1 HE staining of mice liver tissues in experimental groups (×40)

由圖1可知，空白對(duì)照組小鼠肝顏色紅潤(rùn)富有彈性，表面光滑有光澤度，光學(xué)顯微鏡檢結(jié)果顯示，肝細(xì)胞間連接緊密，核質(zhì)比大，胞漿豐富，以中央靜脈腔為中心呈輻射狀，細(xì)胞完整且很規(guī)則，細(xì)胞結(jié)構(gòu)與間隙清晰，細(xì)胞核圓形位于中央，核質(zhì)分布均勻(圖1-A)；衰老模型組小鼠肝臟明顯腫大，顏色黃白有點(diǎn)狀灰白色，表面粗糙且質(zhì)地稍脆無(wú)光澤，光學(xué)顯微鏡鏡檢結(jié)果顯示細(xì)胞間隙擴(kuò)大，排列紊亂，壞死細(xì)胞較多，細(xì)胞輪廓模糊，細(xì)胞核多皺縮且胞漿疏松、淡染，出現(xiàn)裂解現(xiàn)象，胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)脂滴空泡，并伴隨胞質(zhì)丟失現(xiàn)象(圖1-B)；陽(yáng)性對(duì)照組小鼠肝細(xì)胞排列較紊亂且間隙大，腔靜脈周圍都有少部分壞死細(xì)胞，細(xì)胞界限模糊但病變有所緩解(圖1-C)；絞股藍(lán)籽油低劑量組小鼠肝胞排列較整齊而間隙較大，胞質(zhì)內(nèi)有脂滴空泡，胞漿疏松、淡染呈輕度脂肪變性(圖1-D)；絞股藍(lán)籽油中劑量組小鼠肝細(xì)胞邊緣清晰結(jié)構(gòu)完整，少數(shù)胞質(zhì)內(nèi)有脂滴空泡，病變較小(圖1-E)；絞股藍(lán)籽油高劑量組小鼠肝細(xì)胞呈輻射狀排列且細(xì)胞間隙小，核圓清晰完整，幾乎無(wú)壞死細(xì)胞，損傷較輕(圖1-F)，說(shuō)明絞股藍(lán)籽油可以有效緩解衰老小鼠的肝損傷情況。

3 討 論

在絞股藍(lán)籽油的相關(guān)報(bào)道中，劉世彪等[14]對(duì)石油醚提取的絞股藍(lán)籽油進(jìn)行了小鼠急性毒性試驗(yàn)的初步評(píng)價(jià)，該試驗(yàn)中選用的最大劑量為一次性經(jīng)口灌胃65 mL/kg，試驗(yàn)結(jié)果表明，14 d內(nèi)小鼠活動(dòng)正常，體質(zhì)量增加均衡，無(wú)明顯中毒癥狀，亦無(wú)死亡現(xiàn)象發(fā)生；同時(shí)對(duì)小鼠進(jìn)行解剖鏡檢，各主要臟器也未發(fā)現(xiàn)可見(jiàn)的異常變化，故按照保健食品檢驗(yàn)與評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范的急性毒性分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，初步認(rèn)定絞股藍(lán)籽油為無(wú)毒級(jí)，且富含多不飽和脂肪酸[2]，可作為營(yíng)養(yǎng)保健植物食用油使用。本試驗(yàn)采用超臨界CO2萃取絞股藍(lán)籽油，避免了溶劑殘留的影響，并通過(guò)急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)及2項(xiàng)遺傳毒性試驗(yàn)結(jié)合的方法，進(jìn)一步驗(yàn)證了絞股藍(lán)籽油的食用安全性。但考慮到絞股藍(lán)籽油含有大量α-桐酸，且油脂的脂肪酸組成結(jié)構(gòu)與桐油極為相似，α-桐酸的含量也幾乎相當(dāng)，而誤食桐油發(fā)生中毒的事件時(shí)有報(bào)道[15-17]，普遍的觀點(diǎn)認(rèn)為桐油的毒性來(lái)源于α-桐酸，因此，僅通過(guò)急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)及遺傳毒性試驗(yàn)檢測(cè)評(píng)價(jià)絞股藍(lán)籽油的食用安全性，尚是遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠的，還需要經(jīng)過(guò)慢性毒性試驗(yàn)等大量檢測(cè)進(jìn)行進(jìn)一步考察。此外，也有文獻(xiàn)報(bào)道，同樣含有大量α-桐酸的苦瓜籽油和栝樓籽油均可作為食用油脂用于日常飲食，平均壽命最長(zhǎng)的日本人也有長(zhǎng)期食用苦瓜的習(xí)慣[18-20]，這些事例似乎又證明，這些含有大量α-桐酸的植物油甚至α-桐酸本身可能都是無(wú)毒的。推測(cè)桐油的毒性來(lái)源一方面是桐油籽中含有的有毒皂素等物質(zhì)，一方面是以α-桐酸為主構(gòu)成的甘油三酯因組成或結(jié)構(gòu)不同而產(chǎn)生有毒或無(wú)毒的植物油脂[21-22]。此外，桐油的急性中毒也可能與攝入量密切相關(guān)，而α-桐酸具有的抗癌、減肥、降血脂等有益的生理功效，也不會(huì)因?yàn)橥┯偷亩拘远谎谏w[23]。因此，在充分驗(yàn)證絞股藍(lán)籽油無(wú)毒的基礎(chǔ)上，有望將其開(kāi)發(fā)成富含α-桐酸的可食用天然植物油，以取代桐油成為更加安全的α-桐酸的天然來(lái)源。

本試驗(yàn)以絞股藍(lán)籽油為對(duì)象，采用皮下注射D-半乳糖的方法構(gòu)建小鼠衰老模型，初步研究其抗衰老作用。隨著灌胃和注射時(shí)間的延長(zhǎng)，小鼠出現(xiàn)飲食量下降，皮毛光澤度變差，行動(dòng)緩慢，體質(zhì)量增加緩慢甚至下降的癥狀，說(shuō)明長(zhǎng)期注射D-半乳糖會(huì)導(dǎo)致小鼠食欲及吸食能力不斷下降，而絞股藍(lán)籽油可以緩解這一癥狀。肝臟指數(shù)分析表明，絞股藍(lán)籽油對(duì)小鼠肝臟可以起到保護(hù)作用。脾臟和胸腺指數(shù)是評(píng)價(jià)機(jī)體免疫功能的主要生化指標(biāo)，灌胃絞股藍(lán)籽油各劑量組小鼠脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)均較衰老模型線小鼠有所提高，說(shuō)明絞股藍(lán)籽油可通過(guò)提高小鼠脾臟和胸腺的生理機(jī)能從而達(dá)到增強(qiáng)小鼠免疫功能的目的。本研究顯示，供試小鼠的腎臟指數(shù)未出現(xiàn)異常，說(shuō)明絞股藍(lán)籽油對(duì)小鼠腎臟功能影響不大。血清生化指標(biāo)測(cè)定結(jié)果表明，長(zhǎng)期食用絞股藍(lán)籽油不會(huì)增加血清中的TC和TG濃度，反而可明顯降低衰老小鼠血清的LDL濃度，增加HDL濃度，說(shuō)明絞股藍(lán)籽油可能通過(guò)調(diào)節(jié)血清血脂TC、TG、LDL、HDL濃度，改善血脂代謝進(jìn)而起到抗衰老作用[24]。肝臟組織和腦組織生化指標(biāo)的測(cè)定結(jié)果說(shuō)明，絞股藍(lán)籽油在一定程度上能顯著輔助和增強(qiáng)SOD活性，降低MDA含量，提高總抗氧化能力，表明絞股藍(lán)籽油抗衰老機(jī)理之一可能與其抗氧化能力有關(guān)，其可能通過(guò)增強(qiáng)機(jī)體的總抗氧化能力并有效清除自由基，降低機(jī)體細(xì)胞損傷程度，間接保護(hù)正常細(xì)胞，從而起到抗衰老作用[25-26]。小鼠肝臟組織石蠟切片顯示，灌胃不同劑量絞股藍(lán)籽油均可有效緩解衰老小鼠肝臟內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化和自由基攻擊等造成的氧化損傷，降低肝細(xì)胞腫脹甚至壞死的程度，調(diào)節(jié)細(xì)胞恢復(fù)生理功能和正常代謝，表明絞股藍(lán)籽油有一定的抗衰老活性。

4 結(jié) 論

絞股藍(lán)籽油食品安全性毒理學(xué)評(píng)價(jià)初步認(rèn)定，絞股藍(lán)籽油屬實(shí)際無(wú)毒物質(zhì)，小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核試驗(yàn)和精子畸形試驗(yàn)也表明，絞股藍(lán)籽油不會(huì)對(duì)小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核數(shù)造成顯著影響，對(duì)小鼠精子無(wú)致畸變作用。另外，絞股藍(lán)籽油有一定的抗衰老作用，且其抗衰老機(jī)理可能與其所具有的抗氧化能力有關(guān)。

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