孫 紅，韓 旭，王冠杰，邱麗麗，李 燦，容 蓉

(山東中醫(yī)藥大學(xué)，山東 濟(jì)南 250355 )

麻黃細(xì)辛附子湯具有悠久歷史，張仲景在傷寒論中寫(xiě)道“少陰病，反發(fā)熱，脈沉者，麻黃細(xì)辛附子湯主之?！庇纱丝梢?jiàn)，該方主要用于治療體質(zhì)陽(yáng)虛，外感風(fēng)寒者，可溫經(jīng)解表。方中藥材正如其名，以麻黃為君藥，加以臣藥附子佐藥細(xì)辛配伍，具有宣上溫下開(kāi)竅啟閉之功?，F(xiàn)代臨床多用于抗炎，抑制哮喘病發(fā)作，免疫調(diào)節(jié)[1]等。本方由麻黃(HerbaEphedrae)，細(xì)辛(RadixEtRhizomaAsari)附子(RadixAconitiLateralisPraeparata)三味中藥組成[2]。其中附子有不同炮制規(guī)格且因地而異，因此使用不同炮制規(guī)格的附子對(duì)制成的麻黃附子細(xì)辛湯制劑的質(zhì)量控制研究具有重要意義，因此研究不同炮制規(guī)格附子對(duì)麻辛附湯溶出度的影響具有重大意義。本文運(yùn)用高效液相色譜制作分別含有白附片，淡附片，黑順片，炮附子四種附子麻黃附子細(xì)辛湯的指紋圖譜，以炮附子指紋圖譜為參照?qǐng)D譜，通過(guò)指紋圖譜的對(duì)比分析，進(jìn)一步研究不同炮制規(guī)格的附子對(duì)麻黃附子細(xì)辛湯的質(zhì)量影響。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1260型高效液相色譜儀；十萬(wàn)分之一電子分析天平(上海精密儀器有限公司)；臺(tái)式高速離心機(jī)(TGL-16G,上海醫(yī)用分析儀器廠)；電熱恒溫水文箱(北京醫(yī)療設(shè)備廠)。

1.2 試藥

麻黃為麻黃科植物草麻黃( Ephedra sinica Stapf．)的干燥草質(zhì)莖(產(chǎn)地內(nèi)蒙古)，炮附子、黑順片、淡附片、白附片為毛茛科植物烏頭(Aconitum carmichaeli Debx．)子根的加工品(產(chǎn)地四川)，細(xì)辛為馬兜鈴科植物北細(xì)辛(Asarum heterotropoldes Fr．Schmidt var．Mandshuricum ( Maxim．) Kitag．)的干燥根及根莖(產(chǎn)地吉林)，以上藥材經(jīng)山東中醫(yī)藥大學(xué)李峰教授鑒定，均符合《中國(guó)藥典》2015 年版標(biāo)準(zhǔn)。甲醇(色譜純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)，水(娃哈哈純凈水)，磷酸(天津科密歐化學(xué)試劑有限公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 麻黃細(xì)辛附子湯指紋圖譜的建立

2.1.1 色譜條件

色譜柱：Eclipse XDB-C18(4.6×250 mm,5μm，美國(guó)安捷倫公司)；流動(dòng)相：甲醇(A)-0.2%磷酸水溶液(B)；流速：1.0 mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)：254nm；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：20μL；采用梯度洗脫，梯度變化條件見(jiàn)表1。

表1 HPLC梯度變化條件

2.1.2 麻黃細(xì)辛附子湯的制備

分別取炮附子、黑順片、淡附片、白附片按傳統(tǒng)處方比例麻黃∶細(xì)辛∶附子=2∶1∶3[3]，即取麻黃6 g，細(xì)辛3 g，附子9 g，用水浸泡30min，加16倍水回流提取兩次，每次1 h，提取液水浴濃縮，濃縮液離心15min(4000 r/min)，定容至50 mL，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.1.3 供試品溶液的制備

分別取炮附子、黑順片、淡附片、白附片的樣品液各3mL，加無(wú)水乙醇定容至10 mL，靜置過(guò)夜。過(guò)濾，取續(xù)濾液5 mL于蒸發(fā)皿中，水浴濃縮至干，加蒸餾水溶解，分別轉(zhuǎn)移至5mL容量瓶中，定容至刻度，得供試品溶液。

2.1.4 麻黃細(xì)辛附子湯指紋圖譜

分別吸取2.1.3項(xiàng)下炮附子、黑順片、淡附片、白附片的供試品溶液，以2.1.1項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)樣，記錄4種附子炮制品的HPLC指紋圖譜。將所得的指紋圖譜以AIA的形式保存，導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)”(2004A 版)，分析處理后共得到7個(gè)共有指紋峰。結(jié)果如圖1。

S1-白附片；S2-淡附片；S3-黑順片；S4-炮附子

圖1 附子不同炮制品麻黃細(xì)辛附子湯指紋圖譜

2.1.5 方法學(xué)考察

2.1.5.1 精密度試驗(yàn)

取同一份供試品溶液以2.1.1項(xiàng)下的色譜條件，在一定時(shí)間內(nèi)連續(xù)進(jìn)樣五次，記錄下它們的指紋圖譜。采用“中藥指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)”(2004A 版)對(duì)指紋圖譜中7個(gè)共有指紋峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)保留峰面積進(jìn)行計(jì)算，相對(duì)保留時(shí)間的RSD%范圍在0.005%～0.089%，相對(duì)保留峰面積的RSD%范圍在1.024%～2.072%。表明儀器的精密性良好。具體數(shù)值見(jiàn)表2。

2.1.5.2 重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)

取同一供試品溶液5份以2.1.1項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)樣，記錄下它們的指紋圖譜。將所得的指紋圖譜的數(shù)據(jù)采用2.1.5項(xiàng)下(1)中的軟件對(duì)指紋圖譜中7個(gè)共有指紋峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)保留峰面積進(jìn)行計(jì)算，相對(duì)保留時(shí)間的RSD%范圍在0.012%～0.093%，相對(duì)保留峰面積的RSD%范圍在1.022%～1.912%。表明實(shí)驗(yàn)的重現(xiàn)性良好。具體數(shù)值見(jiàn)表2。。

2.1.5.3 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

取同一供試品溶液分別在放置0,2,4,8,12,24 h后以2.1.1項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)樣，記錄下它們的指紋圖譜。將所得的指紋圖譜的數(shù)據(jù)采用2.1.5項(xiàng)下(1)中的軟件對(duì)指紋圖譜中7個(gè)共有指紋峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)保留峰面積進(jìn)行計(jì)算，相對(duì)保留時(shí)間的RSD%范圍在0.057%～0.163%，相對(duì)保留峰面積的RSD%范圍在1.254%～2.192%。表明實(shí)驗(yàn)的穩(wěn)定性良好。具體數(shù)值見(jiàn)表2。

表2 方法學(xué)考察中各主要峰的相對(duì)保留時(shí)間(Rt)和相對(duì)保留面積(Ra)

2.2 附子不同炮制品對(duì)麻黃細(xì)辛附子湯指紋圖譜的影響

2.2.1 指紋圖譜的相似度計(jì)算

表3 附子不同炮制品相似度計(jì)算結(jié)果

將4種附子炮制品的麻黃細(xì)辛附子湯指紋圖譜導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)”(2004 A版)，參照?qǐng)D譜使用炮附子的麻黃細(xì)辛附子湯的指紋圖譜，對(duì)附子不同炮制品的麻黃細(xì)辛附子湯指紋圖譜進(jìn)行相似度分析，對(duì)7個(gè)共有指紋峰進(jìn)行匹配，再通過(guò)平均數(shù)計(jì)算的方法，進(jìn)一步得出附子不同炮制品麻黃細(xì)辛附子湯指紋圖譜的共有模式，并以次為規(guī)范，進(jìn)行相似度的整體評(píng)價(jià)。相似度計(jì)算結(jié)果見(jiàn)表3。

從表3可以看出，附子不同炮制品的麻黃細(xì)辛附子湯指紋圖譜相似度均大于0.90，說(shuō)明附子不同炮制品的麻黃細(xì)辛附子湯色譜模式相似，其化學(xué)成分一致性較好。但仍存在差異，三種炮制附子與炮附子麻黃細(xì)辛附子湯指紋圖譜相似度相比有明顯差別，同時(shí)不同炮制品之間的相似度也存在差異。其中，白附片與炮附子的相似度最高，達(dá)到98.3%，淡附片與炮附子的相似度最低，為90.5%。

2.2.2 附子不同炮制品對(duì)麻黃細(xì)辛附子湯指紋圖譜的影響分析

在共有指紋峰中，以4號(hào)峰為參照峰，計(jì)算各峰的相對(duì)保留峰面積，用炮附子的麻黃細(xì)辛附子湯指紋圖譜為參照?qǐng)D譜。結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 附子不同炮制品的相對(duì)峰面積

分析結(jié)果表明，附子不同炮制品對(duì)麻黃細(xì)辛附子湯指紋圖譜的影響具有一定的差異性。以臨床常用的炮附子指紋圖譜為參照?qǐng)D譜，其中，白附片、淡附片、黑順片麻黃細(xì)辛附子湯指紋圖譜的2、3號(hào)峰面積均稍小于炮附子，5、7號(hào)峰面積均顯著大于炮附子；而在1號(hào)峰峰面積比較中，白附片及黑順片峰面積都小于炮附子，僅淡附片峰面積大于炮附子；在6號(hào)峰峰面積比較中，淡附片及黑順片峰面積都大于炮附子，且淡附片峰面積顯著增大，而白附片峰面積小于炮附子。

3 討論

中藥指紋圖譜可整體地反映出復(fù)方中各化學(xué)成分的變化狀況，從而進(jìn)一步反映出各種藥材之間的相互作用關(guān)系。在中藥材質(zhì)量評(píng)價(jià)方面的作用和地位得到了社會(huì)廣泛的認(rèn)可。

本研究以炮附子麻黃細(xì)辛附子湯指紋圖譜為參照?qǐng)D譜，研究白附片、淡附片、黑順片對(duì)麻黃細(xì)辛附子湯指紋圖譜的影響。通過(guò)相似度計(jì)算可知，白順片與炮附子指紋圖譜最為相似，化學(xué)成分較相似，則其麻黃細(xì)辛附子湯臨床藥效也將最為相近。而淡附片、黑順片與炮附子相似度則較差，說(shuō)明二者炮制方法較大地改變了化學(xué)成分。

附子不同炮制品的麻黃細(xì)辛附子湯指紋圖譜存在較多數(shù)共有指紋峰，且大多數(shù)共有指紋峰的峰面積比較大，說(shuō)明附子不同炮制品對(duì)麻黃細(xì)辛附子湯化學(xué)成分的影響處在較穩(wěn)定的范圍，這為麻黃細(xì)辛附子湯不同炮制品的臨床應(yīng)用的療效奠定了一定的基礎(chǔ)。而藥材經(jīng)過(guò)炮制造成麻黃細(xì)辛附子湯化學(xué)成分之間有所差異，因此表現(xiàn)在圖譜上是同一保留時(shí)間上的峰面積不同，進(jìn)而表現(xiàn)出臨床療效將有所差別。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)附子不同炮制品麻黃細(xì)辛附子湯指紋圖譜存在差異，與炮附子相比，白附片、淡附片、黑順片的共有峰峰面積均發(fā)生變化，這些共有峰是哪一種成分未知，為進(jìn)一步的研究提供了依據(jù)。

參考文獻(xiàn)

[1]王艷宏,包 蕾,劉振強(qiáng),等. 麻黃附子細(xì)辛湯藥理作用研究進(jìn)展[J]. 時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥,2010,21(1):216-217.

[2]張俊斐,趙浩如. RP-HPLC法測(cè)定麻黃附子細(xì)辛湯水煎液中麻黃堿的含量[J]. 海峽藥學(xué),2009,21(3):41-43.

[3]王小平.麻黃細(xì)辛附子湯抗病毒活性部位及其血清指紋圖譜研究[D].濟(jì)南：山東中醫(yī)藥大學(xué),2010:46.