魏煒 宋蘊(yùn)韜 徐國輝 肖康 石琦

100142北京大學(xué)腫瘤醫(yī)院暨北京市腫瘤防治研究所頭頸外科惡性腫瘤發(fā)病機(jī)制及轉(zhuǎn)化研究教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(魏煒、宋蘊(yùn)韜、徐國輝)；102206北京,中國疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所傳染病預(yù)防控制國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(肖康、石琦)

頭頸部腫瘤(head and neck cancer,HNC)是世界上最常見的第六大腫瘤,每年大約有600 000例新確診病例。90%以上HNC為鱗狀細(xì)胞癌,主要包括唇、口腔、鼻咽、口咽、下咽和喉癌。傳統(tǒng)觀念認(rèn)為HNC發(fā)病與吸煙及飲酒有關(guān)。最近研究發(fā)現(xiàn)人乳頭狀瘤病毒(human papillomavirus,HPV)感染與HNC發(fā)病密切相關(guān)[1]。下咽鱗狀細(xì)胞癌(hypopharynx squamous cell carcinoma),是原發(fā)于下咽部的惡性腫瘤,其以鱗狀細(xì)胞癌為主(95%以上),易發(fā)部位從高到低依次為梨狀窩、環(huán)后區(qū)、咽后壁[2]。下咽癌發(fā)病率較低,雖然各國存在較大差異,但總體年發(fā)病率僅約為0.17～0.80/10萬,占頭頸部惡性腫瘤的1.4%～5.0%,占全身惡性腫瘤的0.2%～0.3%。雖然其發(fā)病率并不高,但早期發(fā)病往往沒有明顯癥狀,待癥狀明顯時(shí)往往已經(jīng)進(jìn)入中晚期,且浸潤(rùn)性較強(qiáng),惡性程度較高,半數(shù)下咽癌確診時(shí)已有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移,是頭頸外科中預(yù)后差的惡性腫瘤之一。而且下咽癌死亡率較高,5年生存率僅有30% ～50%[3]。本研究采用Luminex及PCR雜交技術(shù)以及免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)下咽部鱗狀細(xì)胞癌組織中的HPV的感染率以及類型,同時(shí)檢測(cè)p53蛋白表達(dá)及突變的情況,為進(jìn)一步闡明下咽癌的發(fā)病機(jī)制提供依據(jù)。

1 材料方法

1.1 資料來源15例病例均來自北京腫瘤醫(yī)院頭頸外科2008—2011年收集的下咽癌患者標(biāo)本。

1.2 樣本DNA提取參照文獻(xiàn)從腫瘤組織的石蠟包埋標(biāo)本中切取5片10μm厚的切片,放入管中加入1 ml的二甲苯,室溫振蕩浸泡2 h。之后將溶解的樣品放入帶有濾膜的離心管中,離心后再加入1 ml的乙醇震蕩混勻洗去雜質(zhì),離心后按照試劑盒(德國Qiagen公司)的操作說明進(jìn)行樣本DNA的提取,最終將樣品DNA溶解于50μl的體積中,-20℃?zhèn)溆肹4]。

1.3 HPV DNA Luminex檢測(cè)應(yīng)用HPV DNA分型測(cè)定試劑盒(TellgenplexTMHPV DNA檢測(cè)試劑盒)檢測(cè)樣本組織中提取的DNA是否存在HPV的感染。此試劑盒應(yīng)用Luminex技術(shù),可以檢測(cè)樣本中19 種高危型 HPV 類型(HPV-16、18、26、31、33、35、39、45、51、52、53、55、56、58、59、66、68、82 及 83)及7 種低危型 HPV 類型(HPV-6、11、40、42、44、61及73)的存在。具體步驟如下,取2μg提取的DNA進(jìn)行PCR雜交反應(yīng),條件為95℃ 30 s,58℃ 30 s及72℃ 30 s進(jìn)行最初的5個(gè)循環(huán),之后95℃ 30 s,55℃ 30 s及72℃ 30 s進(jìn)行第二輪的35個(gè)循環(huán)。以此PCR產(chǎn)物進(jìn)行快速雜交反應(yīng)后應(yīng)用Bio-Plex200系統(tǒng)進(jìn)行Lunimex結(jié)果的檢測(cè),對(duì)HPV的感染類型進(jìn)行檢測(cè),并且應(yīng)用TellgenplexTM公司相應(yīng)的試劑盒數(shù)據(jù)分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析[5]。

1.4 高危型HPV16/18 PCR檢測(cè)以及p53基因檢測(cè)及測(cè)序分析以樣本提取的DNA為模板對(duì)HPV16、18型進(jìn)行兩輪PCR檢測(cè)。引物序列分別為HPV16-1(5’-GCAAGCAACAGTTACTGCGA-3’)及P16-2 (5 ’-CAACAAGACATACATCGACC-3 ’)；HPV18-1(5’-CACTTCACTGCAAGACATAGA-3’)及P18-2(5’-GTTGTGAAATCGTCGTTTTTCA-3’)。 第一輪PCR條件：1.0μg DNA作為模板,1μmol/L的上下游引物及1.25 U Pfu DNA聚合酶,共25μl體系；反應(yīng)條件：94℃ 60 s,57℃ 60 s及72℃ 60 s,共30個(gè)循環(huán),之后72℃ 延伸10 min。第二輪PCR條件：第一輪產(chǎn)物取5μl作為模板,10μmol/L的上下游引物及1.25 U Pfu DNA聚合酶,共25μl體系；反應(yīng)條件：94℃ 60 s,52℃ 60 s,72℃ 60 s,共40個(gè)循環(huán),之后72℃ 延伸10 min。PCR反應(yīng)嚴(yán)格在PCR實(shí)驗(yàn)室分區(qū)操作,以240 bp大小的actin作為參照。HPV DNA的PCR產(chǎn)物以2%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行分析并且用凝膠回收試劑盒對(duì)目的片段進(jìn)行回收。以相同的引物,應(yīng)用ABI PRISMTM3730XL大型DNA測(cè)序儀進(jìn)行序列測(cè)定分析。

p53的5-8外顯子應(yīng)用傳統(tǒng)的PCR方法進(jìn)行擴(kuò)增。在50μl擴(kuò)增體系中包括1μl的DNA模板、20pmol的上下游引物、25μl的PCR Mix以及21μl無RNA酶的水。PCR的反應(yīng)條件如下：95℃ 30 s,65℃ 退火45 s,之后每循環(huán)降低1℃,55℃進(jìn)行35個(gè)循環(huán),最后72℃延伸45 s。所有的PCR實(shí)驗(yàn)都在專用的PCR實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行,避免DNA的污染[6]。

1.5 HPV16/18E6蛋白及p53蛋白免疫組織化學(xué)檢測(cè)石蠟包埋的病變部位組織塊切成5μm厚的切片,按下列步驟處理：切片在二甲苯中脫蠟5 min并逐漸進(jìn)行水化,3%H2O2-甲醇處理15 min以除去內(nèi)源性過氧化物酶。在酶消化進(jìn)行抗原暴露和修復(fù)后切片用1%正常羊血清封閉20 min,然后將HPV16/18E6單克隆抗體(Abcam公司)或者p53非磷酸化單克隆抗體(Novus公司)按1∶500稀釋在4℃作用過夜,然后與1∶1000稀釋的辣根過氧化物酶結(jié)合的羊抗鼠二抗室溫作用1 h,DAB顯色。切片用蘇木素復(fù)染、脫水以及用封片劑進(jìn)行封片觀察。

2 結(jié)果

2.1 患者HPV DNA的檢測(cè)結(jié)果經(jīng)過26種型別HPV基因Luminex檢測(cè),發(fā)現(xiàn)2例同時(shí)出現(xiàn)HPV16/18感染陽性的病例,未發(fā)現(xiàn)低危型HPV病毒的感染。通過二輪PCR的檢測(cè),1例病例出現(xiàn)HPV18感染陽性,3例病例出現(xiàn)HPV16感染陽性,經(jīng)測(cè)序比對(duì)分析序列正確,基因檢測(cè)的陽性率為40.0%(6/15)。

2.2 患者HPV蛋白表達(dá)的檢測(cè)結(jié)果經(jīng)HPV16/18E6蛋白抗體進(jìn)行免疫組織化學(xué)檢測(cè),在15例病例中發(fā)現(xiàn)2例HPV感染陽性,檢測(cè)陽性率為13.3%(2/15)。在免疫組織化學(xué)的檢測(cè)中可以觀察到病變組織的鱗狀上皮中有棕色的陽性顆粒出現(xiàn),為表達(dá)的HPV16/18E6蛋白(見圖1)。綜合HPV基因及蛋白檢測(cè)結(jié)果,15例下咽癌患者中HPV基因及蛋白檢測(cè)總陽性率達(dá)到46.7%(7/15)。

圖1 下咽部鱗狀細(xì)胞癌組織HPV16/18E6抗原蛋白的免疫組織化學(xué)染色(×20/×40/×100)Fig.1 Immunohistochemistry assays of HPV16/18E6 proteins in the tissues from patients with hypopharynx squamous cell carcinoma(×20/×40/×100)

2.3 患者病理分級(jí)及HPV感染陽性率在15例下咽癌病例中,高分化的病例有4例,其中2例為HPV陽性,陽性率50.0%；中分化的病例有7例,其中5例為HPV陽性,陽性率71.4%；低分化的病例有4例,未發(fā)現(xiàn)HPV檢測(cè)陽性病例。

2.4 患者臨床分級(jí)及HPV感染陽性率在15例下咽癌病例中,1例為臨床分級(jí)I級(jí),為HPV感染陽性病例；7例為臨床分級(jí)II級(jí),其中3例為HPV感染陽性,占到42.9%；6例為臨床分級(jí)III級(jí),其中2例為HPV感染陽性,占到33.3%；1例為臨床分級(jí)IV級(jí),為HPV感染陽性病例。

2.5 患者的性別、年齡分布,是否吸煙、喝酒及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況在15例下咽癌病例全部都是男性,其中HPV陽性患者及全部病例的年齡中位數(shù)分別為58歲/60歲；在7例HPV陽性的下咽癌患者中,全部具有吸煙史,占到100%(7/7)；5例具有飲酒史,占到71.4%(5/7)；3例具有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移,4例沒有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。

2.6 患者p53蛋白表達(dá)及其基因突變情況p53蛋白在腫瘤組織中的表達(dá)通過免疫組織化學(xué)的方法來檢測(cè),棕色的陽性顆粒主要分布在惡性細(xì)胞的細(xì)胞核(見圖2)。在下咽癌的15份標(biāo)本中,6份為陽性標(biāo)本,占到病例數(shù)的40.0%(6/15)。另外,在15例下咽癌患者中通過PCR的方法發(fā)現(xiàn)9例患者存在p53基因突變,占到60.0%(9/15),其中在外顯子5出現(xiàn)突變的有2例病例,在外顯子6出現(xiàn)突變的有1例病例,在外顯子7出現(xiàn)突變的有2例病例,在外顯子8出現(xiàn)突變的有3例病例,另外有1例病例在外顯子6和7同時(shí)出現(xiàn)突變。

圖2 下咽部鱗狀細(xì)胞癌組織p53蛋白的免疫組織化學(xué)染色(×20/×40/×100)Fig.2 Immunohistochemical assays of p53 suppressor proteins in the tissues from patients with hypopharynx squamous cell carcinoma(× 20/×40/×100)

3 討論

HPV是一種具有高度組織親嗜性,主要侵犯人類皮膚及黏膜鱗狀上皮的病毒,迄今共發(fā)現(xiàn)有200多種病毒亞型,根據(jù)致病力劃分為低危型和高危型兩大類。其中高危型HPV能使鱗狀細(xì)胞無限增殖進(jìn)而癌變,所致腫瘤有宮頸癌、外陰癌、頭頸部腫瘤等,代表亞型有 HPV16、18、31、33 等[7]。 目前還沒有一種被認(rèn)為是HPV檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)方法,但PCR方法是應(yīng)用最多的HPV檢測(cè)方法,它是通過擴(kuò)增標(biāo)本中的HPV DNA片段來達(dá)到檢測(cè)目的,具有非常高的靈敏性,最少能檢測(cè)到1拷貝HPV DNA細(xì)胞水平,然而一般PCR不能判斷HPV DNA是來自標(biāo)本中的腫瘤組織還是腫瘤周圍的間質(zhì)組織,也不能判斷HPV DNA在宿主細(xì)胞中的部位和狀態(tài),由于PCR對(duì)HPV DNA部位和狀態(tài)判斷的低特異性以及假陽性限制了PCR為HPV檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)方法[8]。因此在本研究中,同時(shí)應(yīng)用PCR方法對(duì)HPV基因以及免疫組織化學(xué)方法對(duì)HPV表達(dá)的蛋白進(jìn)行檢測(cè),提高HPV病毒檢出率。

p53基因,一種腫瘤抑制基因,在細(xì)胞面對(duì)各種外界刺激包括凋亡、周期變化、衰老、DNA修復(fù)、細(xì)胞代謝及自噬過程中都起著重要的作用。p53功能的喪失及突變?cè)诤芏嗄[瘤的發(fā)生中都導(dǎo)致了p53活性及增殖活性的下降以及無限制的生長(zhǎng)。人類腫瘤中大多數(shù)p53的突變都是錯(cuò)義突變,并且集中在5～8外顯子上。在很多病例中,這些突變可以引起抑癌功能的喪失或者引起癌基因功能的獲得。本課題組之前對(duì)喉癌病例的研究中發(fā)現(xiàn)了p53蛋白的過表達(dá),因此,在本研究中也通過PCR的方法對(duì)p53的突變進(jìn)行了檢測(cè),同時(shí)應(yīng)用免疫組化的方法對(duì)p53蛋白的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)[9],出現(xiàn)了40%的蛋白陽性率以及60%的基因突變率。

在頭頸部腫瘤中,HPV不同的暴露機(jī)會(huì)可能會(huì)導(dǎo)致感染率的不同。HPV通過口腔黏膜進(jìn)行傳播的確切機(jī)制還不清楚,但是皮膚與皮膚之間的直接接觸被認(rèn)為是必須的條件[10]。同時(shí),頭頸部腫瘤發(fā)生的部位和HPV的感染率可能也有一定的關(guān)系[11]。國外學(xué)者報(bào)告下咽鱗狀細(xì)胞癌中也有一定的HPV檢出率,但研究不多,結(jié)果差異大,目前缺乏統(tǒng)一的結(jié)論,且有效病例較少[12]。而我國人群的大樣本量報(bào)道很少,報(bào)道病例研究資料不足。在協(xié)和醫(yī)院對(duì)14例下咽癌患者HPV檢測(cè)結(jié)果中,HPV的感染率為57.1%[12-13],與本研究組的結(jié)果相近。在本研究的15例下咽癌病例中,HPV感染陽性率為46.7%,陽性率較高,與本實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用了3種方法對(duì)HPV的感染進(jìn)行檢測(cè)有關(guān),不同的方法敏感性不同,對(duì)HPV病毒的基因和表達(dá)蛋白同時(shí)檢測(cè)提高了檢測(cè)的靈敏性。但由于樣本量較少,也未發(fā)現(xiàn)HPV的感染與是否具有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。在應(yīng)用PCR方法以及Luminex方法對(duì)HPV感染的類型進(jìn)行檢測(cè)的結(jié)果發(fā)現(xiàn),HPV感染的類型均為高危型的HPV16或者HPV18,有2例病例同時(shí)出現(xiàn)了HPV16及HPV18的感染,與近期的報(bào)道結(jié)果相一致。在本研究中,未發(fā)現(xiàn)下咽癌的發(fā)生與患者的臨床分級(jí)、病理分級(jí)、是否吸煙飲酒以及是否具有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移具有相關(guān)性。有待于在下一步的研究中,繼續(xù)擴(kuò)大樣本量,進(jìn)一步研究HPV感染與非感染的下咽癌患者之間的生存率的差異。

利益沖突無