范華華，孫厚杰，韓建華，蔡小軍

(遵義市第一人民醫(yī)院·遵義醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院，貴州遵義563000)

脊柱結(jié)核致殘率高，嚴(yán)重威脅人類健康，目前病灶清除植骨融合內(nèi)固定術(shù)已成為脊柱結(jié)核外科治療的經(jīng)典術(shù)式[1]。相關(guān)植骨材料的研究發(fā)現(xiàn)也成為人們關(guān)注的熱門課題，自體骨因供骨量不足，異體骨宿主反應(yīng)甚至疾病傳播，使其應(yīng)用受到一定限制。目前常用鈦網(wǎng)進行植骨支撐融合，但鈦網(wǎng)植骨無法了解植骨融合情況,且鈦網(wǎng)易移位及下降,導(dǎo)致融合失敗、再發(fā)畸形等并發(fā)癥。納米羥基磷灰石/聚酰胺66(n-HA/PA66)復(fù)合生物材料因其具有良好生物相容性、骨傳導(dǎo)性、成骨活性及生物力學(xué)特性，已被應(yīng)用于創(chuàng)傷脊柱外科[2～4]。然而由于脊柱結(jié)核屬感染性病灶，結(jié)核分枝桿菌對n-HA/PA66復(fù)合材料是否能像鈦網(wǎng)等金屬材料一樣產(chǎn)生惰性，是否會黏附材料表面或聚集在材料內(nèi)，國內(nèi)外文獻(xiàn)暫未見相關(guān)報道。2015年1月～2017年3月,本研究通過建立兔脊柱結(jié)核動物模型，然后在病灶內(nèi)植入n-HA/PA66復(fù)合材料人工椎體，觀察植骨融合及結(jié)核治療情況，為臨床應(yīng)用提供可靠的實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 清潔級健康新西蘭白兔60只，由遵義醫(yī)學(xué)院動物實驗中心提供，雌雄不限，體質(zhì)量2.0～3.0 kg，結(jié)核菌素試驗陰性。飼養(yǎng)條件：動物房嚴(yán)格消毒，溫度23 ℃，相對濕度70%，標(biāo)準(zhǔn)兔高壓飼料飼養(yǎng)。人型結(jié)核分枝桿菌H37Rv標(biāo)準(zhǔn)菌株混懸液(1×107cfu/mL)購自新疆畜牧科學(xué)院獸醫(yī)研究所，4 ℃冷藏保存。弗氏完全佐劑購自美國Sigma公司。實驗植骨材料：n-HA/PA66復(fù)合生物材料人工椎體購自四川國納科技有限公司提供；鈦網(wǎng)及內(nèi)固定材料購自山東威高醫(yī)療器械有限公司。

1.2 模型制備 新西蘭白兔背側(cè)頸跟部皮內(nèi)注射弗氏完全佐劑0.1 mL，其中3只于注射后3周腹瀉死亡，剩余57只新西蘭白兔于致敏后1個月頸部皮膚發(fā)現(xiàn)直徑0.9～1.8 cm硬結(jié)，皮膚無破潰。取致敏的57只新西蘭白兔，將其腰背部脫毛(直徑約12 cm)，取左側(cè)臥位，將其固定在兔專用板上。采用氯胺酮、安定、阿托品(比例:2 mL∶2 mL∶1 mL，用生理鹽水稀釋1倍)進行聯(lián)合麻醉，經(jīng)耳緣靜脈緩慢注入(2.5 mL/kg)。麻醉后，沿右側(cè)第12肋末向下至髂嵴作一縱行切口(長約6 cm)，將腰4、5椎體顯露；于腰5椎體上部近椎間盤處，從右前方向左后方(與椎體遠(yuǎn)端呈30°)進入，鉆骨孔(深約0.5 cm、孔徑約0.25 cm)，止血后填入醫(yī)用明膠海綿。然后用注射器緩慢將結(jié)核菌懸液(0.1 mL)注于明膠海綿上。最后用1-0絲線間斷關(guān)閉切口、關(guān)閉深筋膜，于皮下涂灑30萬U/只注射用青霉素粉劑，無菌紗布覆蓋并固定。術(shù)后觀察動物一般情況，包括動物進食、活動、精神狀態(tài)、切口情況。如動物切口出現(xiàn)感染，立即淘汰。術(shù)后1～2個月內(nèi)觀察癥狀，術(shù)后2個月行X線片、CT、MRI檢查，觀察膿腫和死骨形成、病灶數(shù)目、病變范圍、骨質(zhì)破壞程度、脊髓受壓、椎間盤異常情況，并進行解剖學(xué)及組織病理學(xué)變化觀察以驗證模型是否成功建立。57只新西蘭白兔，造模術(shù)后20 d因進食不良死亡2只，造模后47 d，結(jié)核全身播散死亡2只，切口感染死亡1只，實際存活52只。成功率為86.67%(52/60)。

1.3 分組及處理 造模后2個月，隨機選取36只造模成功新西蘭兔分為兩組，鈦網(wǎng)植骨組和n-HA/PA66植骨組，每組18只。植骨融合內(nèi)固定術(shù)：麻醉及顯露同建模術(shù)，清理周圍膿液，制備植骨床，取自體髂骨松質(zhì)骨顆粒填充至鈦網(wǎng)中,將植骨材料鈦網(wǎng)及n-HA/PA66分別植入鈦網(wǎng)植骨組和n-HA/PA66植骨組植骨床內(nèi)，微型指鈦鋼板固定牢固，術(shù)后采用異煙肼5 μg/(kg·d)、利福平1.25 mg/(kg·d)抗結(jié)核治療。

1.4 觀察指標(biāo)及其評價或檢測方法 分別于術(shù)后1 d、1個月、2個月、3個月兩組各取6只實驗兔行X線檢查，術(shù)后3個月采用Lane-Sandhu法[5]根據(jù)X線檢查結(jié)果對骨形成、骨連接及骨塑型情況進行評分。骨形成情況：無骨形成為0分，骨形成占缺損15%～25%為1分，骨形成占缺損26%～50%為2分，骨形成占缺損51%～75%為3分，骨形成占缺損76%至充滿缺損區(qū)為4分；骨連接情況：骨折線清晰為0分，骨折線部分存在為1分，骨折線消失為2分；骨塑型情況：未見塑型為0分，髓腔形成為2分，皮質(zhì)骨塑型為4分。骨形成、骨連接及骨塑型三項評分相加取平均值。ESR、血清CRP：分別于術(shù)前、術(shù)后1、3個月經(jīng)實驗兔耳緣靜脈采集靜脈血1.5 mL，采用血沉檢測儀檢測ESR。離心機以3 000 r/min離心5 min,取血清。采用ELISA法檢測血清CRP。結(jié)核分枝桿菌對植骨材料的黏附能力：術(shù)后1 d，兩組各取6只實驗兔，用異戊巴比妥鈉麻醉后將其處死，原切口進入術(shù)區(qū)，將植入材料取出，用PBS溶液清洗3次，沖掉未黏附的細(xì)菌，置于3%戊二醛于4 ℃下固定過夜，用PBS溶液清洗3次，梯度乙醇脫水，零界點干燥過夜，表面噴金，用掃描電鏡觀察，隨機選取10個視野(×5 000)計數(shù)黏附的結(jié)核分枝桿菌數(shù)目，取平均值。

2 結(jié)果

2.1 兩組骨形成、骨連接及骨塑型情況 術(shù)后1 d兔子飲食差、活動少，手術(shù)切口無明顯紅腫、滲液。術(shù)后1個月，n-HA/PA66植骨組材料兩端可見骨痂形成，且材料與自體骨界限不清；鈦網(wǎng)植骨組未見明顯骨痂形成，材料與自體骨間隙仍較清楚。術(shù)后2個月，n-HA/PA66植骨組材料周圍大量骨痂形成，材料與自體骨界面模糊；鈦網(wǎng)植骨組材料兩端有骨痂形成，但明顯較n-HA/PA66植骨組少；術(shù)后3個月兩組材料均與自體骨結(jié)合，對位對線好，材料與自體骨界面模糊，有大量新生骨痂包裹材料，n-HA/PA66植骨組骨痂明顯多于鈦網(wǎng)植骨組。術(shù)后3個月，n-HA/PA66植骨組Lane-Sandhu評分為(6.92±2.05)分，鈦網(wǎng)植骨組為(4.10±1.14)分，n-HA/PA66植骨組Lane-Sandhu評分高于鈦網(wǎng)植骨組(P<0.05)。

2.2 兩組手術(shù)前后ESR、血清CRP水平比較 術(shù)前兩組ESR、血清CRP水平比較，P均>0.05;術(shù)后1、3個月兩組ESR、血清CRP水平均較術(shù)前降低(P均<0.05)；術(shù)后1個月，n-HA/PA66植骨組ESR、血清CRP水平均低于鈦網(wǎng)植骨組(P<0.05)；術(shù)后3個月兩組ESR、血清CRP水平比較，P均>0.05。見表1。

2.3 結(jié)核分枝桿菌對植骨材料的黏附能力比較 n-HA/PA66植骨組光滑表面黏附的結(jié)核分枝桿菌數(shù)目為(3.47±1.15)個/視野，粗糙表面黏附的結(jié)核分枝桿菌數(shù)目為(15.04±6.40)個/視野；鈦網(wǎng)植骨組光滑表面黏附的結(jié)核分枝桿菌數(shù)目為(30.20±7.15)個/視野，粗糙表面黏附的結(jié)核分枝桿菌數(shù)目為(49.32±10.24)個/視野。兩組比較,P均<0.05。

表1 兩組手術(shù)前后ESR、血清CRP水平比較

3 討論

脊柱結(jié)核屬特異感染性疾病，過去一直認(rèn)為在感染病灶中植入內(nèi)植物會導(dǎo)致結(jié)核分枝桿菌在其表面黏附聚集，且抗生素難以到達(dá)內(nèi)植物表面，有使感染經(jīng)久不愈甚至擴散的風(fēng)險[5]。Oga等[6]從細(xì)菌黏附的角度研究表明，與金葡菌比較，結(jié)核分枝桿菌不易黏附金屬異物表面。Ha等[7]研究也發(fā)現(xiàn)，結(jié)核分枝桿菌對鈦合金異物的親和力、黏附性較小，增殖力弱，產(chǎn)生小又薄生物膜，為結(jié)核病灶中植入內(nèi)植物的安全可行性提供了理論依據(jù)。由于鈦金屬組織相容性好，取材方便，支撐固定可靠，克服自體骨取骨量大、異體骨易發(fā)生宿主反應(yīng)，甚至引起疾病傳播等缺點，鈦網(wǎng)作為一種植骨支撐材料目前已被多數(shù)專家學(xué)者所接受并普遍應(yīng)用于脊柱結(jié)核病灶清除后植骨融合環(huán)節(jié)。有研究[8,9]表明，應(yīng)用鈦網(wǎng)植骨2年以上，前柱高度有不同程度的丟失，一般術(shù)后丟失4°～6°；另外，X射線遮擋效應(yīng)不利于觀察椎體間融合情況，鈦網(wǎng)價格昂貴。

n-HA/PA66復(fù)合生物材料中的羥基磷灰石作為骨修復(fù)替代材料具有良好的生物相容性[10],聚酰胺具有骨膠原類似的結(jié)構(gòu)，生物相容性良好。將n-HA/PA66材料用于修復(fù)兔橈骨缺損，顯示出該材料具有良好的成骨能力[11]。臨床觀察中，n-HA/PA66復(fù)合生物活性材料具有良好的生物相容性和安全性，未發(fā)現(xiàn)該材料的不良反應(yīng)[12,13]。通過國內(nèi)許多實驗研究和臨床觀察已初步發(fā)現(xiàn)，n-HA/PA66復(fù)合材料作為良好的植骨填充材料，應(yīng)用于修復(fù)非感染性骨缺損安全有效。然而該復(fù)合材料應(yīng)用在感染性骨缺損中的動物實驗和臨床研究國內(nèi)鮮見有報道。四川達(dá)州市人民醫(yī)院報道臨床應(yīng)用該復(fù)合生物材料治療脊柱結(jié)核“效果滿意”[14]，我們認(rèn)為該新生材料在沒有大量動物實驗研究結(jié)果支持下盲目應(yīng)用于臨床脊柱結(jié)核患者是一種冒險且有悖于倫理道德的行為；報道中“效果滿意”缺乏評價標(biāo)準(zhǔn)，缺乏影像學(xué)資料證實及長期隨訪觀察。

本課題擬對兔腰5椎體實施H37Rv結(jié)核菌懸液攻毒建模后，分別植入n-HA/PA66和鈦網(wǎng)，比較兩種植骨材料在脊柱結(jié)核中的應(yīng)用效果。術(shù)后1～3個月兩組植入的材料逐漸被新生骨痂包裹，且逐漸與自體骨融合，但n-HA/PA66植骨組術(shù)后1個月即有大量骨痂生成，且與自體骨融合。術(shù)后3個月，n-HA/PA66植骨組Lane-Sandhu評分高于鈦網(wǎng)植骨組。提示與鈦合金比較，n-HA/PA66復(fù)合材料能更快地促進骨痂生成及骨融合，說明HA/PA66復(fù)合材料的相容性更好。

ESR、CRP是臨床監(jiān)測早期感染、病情進展的重要指標(biāo)，二者水平變化可反映炎癥反應(yīng)和組織損傷程度[15]。術(shù)后1、3個月兩組ESR、血清CRP水平均較術(shù)前降低，術(shù)后1個月n-HA/PA66植骨組ESR、血清CRP水平較鈦網(wǎng)植骨組低。說明n-HA/PA66材料能降低脊柱結(jié)核兔模型炎癥指標(biāo)水平，從而減輕實驗動物的炎癥狀態(tài)。探討細(xì)菌對生物材料的黏附能力，可為該材料臨床應(yīng)用的安全性進行評價。結(jié)核分枝桿菌對n-HA/PA66復(fù)合材料的黏附能力弱于鈦網(wǎng)。本研究中n-HA/PA66植骨組光滑表面與粗糙表面黏附的結(jié)核分枝桿菌數(shù)均少于鈦網(wǎng)植骨組，與文獻(xiàn)報道一致。說明n-HA/PA66復(fù)合材料用于臨床比較安全。

綜上所述，n-HA/PA66復(fù)合材料植入可促進脊柱結(jié)核兔模型骨融合進展及骨痂生長，降低ESR、血清CRP水平，且材料表面黏附的結(jié)核分枝桿菌少，效果優(yōu)于鈦網(wǎng)植入。但本研究時間短，未對比鈦網(wǎng)與n-HA/PA66復(fù)合材料植骨融合在治愈率、融合率、復(fù)發(fā)率及不良事件等方面的差異，后期研究中將對以上問題進行探討。

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