新型人腺病毒55型在中國(guó)10年的持續(xù)流行及其基因進(jìn)化分析

毛乃穎 朱貞 雷振強(qiáng) 李巖 黃芳 尹潔 陳萌 向星宇 李紅 唐瀏英 崔愛利李忠 劉倜 許文波

102206 北京，中國(guó)疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所(毛乃穎、朱貞、雷振強(qiáng)、李紅、唐瀏英、崔愛利、許文波)；050021 石家莊, 河北省疾病預(yù)防控制中心(李巖)；100013 北京市疾病預(yù)防控制中心(黃芳、陳萌)；650022 昆明, 云南省疾病預(yù)防控制中心(尹潔)；410005 長(zhǎng)沙, 湖南省疾病預(yù)防控制中心(向星宇)；250014 濟(jì)南, 山東省疾病預(yù)防控制中心(李忠、劉倜)

人腺病毒(human adenovirus, HAdV)為無(wú)包膜、二十面體對(duì)稱的雙鏈DNA病毒，基因組大小約36 kb，屬于人腺病毒科(Adenoviridae)哺乳動(dòng)物腺病毒屬[1]。HAdV最主要的結(jié)構(gòu)蛋白包括六鄰體(hexon)和五鄰體(penton)，其中hexon是HAdV的主要抗原蛋白，既具有共同的群特異性抗原，也具有型特異性抗原，對(duì)免疫選擇壓力最為敏感；每個(gè)penton由一個(gè)基座(penton base)和纖維(fiber)組成，其中fiber具有血凝特性和型特異性抗原決定位點(diǎn)[2]。根據(jù)HAdV生物學(xué)特性和全基因組序列及其生物信息學(xué)分析等，至今已鑒定了83種HAdV型別(http://hadvwg.gmu.edu)。

HAdV-55是中國(guó)首次鑒定的重要的呼吸道感染病原體，從2006年一起陜西省歧山縣中學(xué)暴發(fā)的呼吸道感染疫情中分離到，之前該病毒一直被誤認(rèn)為是HAdV-11a或HAdV-11-14型[3]。通過(guò)對(duì)HAdV-55病毒全基因組序列生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)該病毒是在HAdV-14的基因組骨架上與HAdV-11進(jìn)行了部分Hexon基因的重組互換[4]。

HAdV-55主要引起急性呼吸道感染，臨床表現(xiàn)為發(fā)熱、咳嗽、喉嚨痛等上呼吸道癥狀，嚴(yán)重會(huì)導(dǎo)致肺炎甚至死亡，尤其是在免疫缺陷患者中[5-6]。由HAdV-55引起的暴發(fā)流行時(shí)有報(bào)道，2004年在土耳其國(guó)際軍事訓(xùn)練營(yíng)發(fā)生數(shù)百人感染疫情，2005年在新加坡發(fā)生200多名入伍軍人感染疫情，2012年和2016年分別在中國(guó)河北、西藏、云南和四川省軍營(yíng)引起數(shù)百名士兵感染疫情[7-10]。同時(shí)，近幾年不斷有HAdV-55引起的成人散發(fā)重癥肺炎疫情報(bào)道，因此HAdV-55已成為全世界范圍內(nèi)引起公共衛(wèi)生問(wèn)題的重要病原體之一[11-12]。

本研究對(duì)2011—2014年從北京、河北、山東、云南和湖南5個(gè)省市的發(fā)熱呼吸道患者標(biāo)本中分離到的HAdV-55病毒株進(jìn)行了penton base、hexon和fiber三個(gè)基因的序列測(cè)定，并與從GenBank上下載的中國(guó)其他省市HAdV-55分離株序列和以及其他國(guó)家和地區(qū)HAdV-55基因序列進(jìn)行比較，并對(duì)HAdV-55在中國(guó)的流行和基因進(jìn)化特征進(jìn)行了初步分析。

1 材料與方法

1.1毒株信息2011—2014年，分別從北京、河北、山東、云南和湖南省等5個(gè)省市的發(fā)熱呼吸道癥候群患者標(biāo)本中用hep-2細(xì)胞系分離到HAdV-55病毒9株(表1)。

表1 2011—2014年中國(guó)5省市分離到的HAdV-55毒株基本信息

Tab.1 Information of HAdV-55 isolates from 5 Provinces during 2011-2014 in China

1.2聚合酶鏈反應(yīng)(polymerasechainreaction,PCR)擴(kuò)增腺病毒pentonbase、hexon和fiber目的基因和序列測(cè)定取200 μl病毒懸液采用商品化核酸提取試劑(QIAamp DNA Mini Kit，Qiagen，德國(guó))提取病毒，具體步驟詳見說(shuō)明書。5 μl病毒DNA提取液入到終體積50 μl的 PCR kit(金牌Mix green， 擎科，北京)反應(yīng)體系中，加入終濃度0.2 μmol/L的上下游引物擴(kuò)增目的基因penton base、hexon和fiber基因片段，引物詳見參考文獻(xiàn)[6]。PCR產(chǎn)物送北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司進(jìn)行序列測(cè)定，測(cè)序結(jié)果用Sequencher 5.0軟件進(jìn)行核苷酸序列拼接整理。

1.3序列比對(duì)和數(shù)據(jù)庫(kù)建立序列測(cè)定及基因進(jìn)化分析從GenBank上下載19株中國(guó)HAdV-55病毒hexon全長(zhǎng)基因序列，分別來(lái)自2006—2016年間云南、廣東、山西、江蘇、陜西、河北、重慶、四川、西藏、遼寧、天津11個(gè)省市、自治區(qū)和直轄市；以及其他12株基因序列，分別來(lái)自美國(guó)、西班牙、韓國(guó)和中國(guó)，時(shí)間從1969年至2016年，再加入本研究的9株分離株序列，共計(jì)獲得40株HAdV-55病毒的hexon基因全長(zhǎng)序列，建立hexon基因數(shù)據(jù)庫(kù)。從GenBank下載全球不同時(shí)期流行的HAdV-55病毒流行株fiber基因全長(zhǎng)序列59株，再加入本研究的9株分離株序列，共計(jì)獲得68株HAdV-55病毒的fiber基因全長(zhǎng)序列，分別來(lái)自中國(guó)、美國(guó)、韓國(guó)、西班牙，建立fiber基因數(shù)據(jù)庫(kù)。從GenBank下載全球不同時(shí)期流行的HAdV-55病毒流行株penton base基因全長(zhǎng)序列25株，再加入本研究的9株分離株序列，共計(jì)獲得34株HAdV-55病毒的penton base基因全長(zhǎng)序列，建立penton base基因數(shù)據(jù)庫(kù)。用MEGA7.0軟件[13]對(duì)HAdV-55毒株的hexon、fiber和penton base序列進(jìn)行比對(duì)，同時(shí)加入HAdV-3(GenBank序列號(hào)：DQ099432)、HAdV-7(GenBank序列號(hào)：JX423383)、HAdV-11p(GenBank序列號(hào)：AY163756)、HAdV-14(GenBank序列號(hào)：AY803294)、HAdV-16(GenBank序列號(hào)：JN860680)、HAdV-34(GenBank序列號(hào)：AY737797)、HAdV-35(GenBank序列號(hào)：AC_000019)、HAdV-50(GenBank序列號(hào)：AY737798)原型株序列作為外部組建立核苷酸的序列比對(duì)文件。

1.4系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建和進(jìn)化分析用MEGA7.0軟件中鄰接法(Neighbor-jioning method，NJ)和最大似然法(Maximum Likelihood method, ML)建立系統(tǒng)進(jìn)化樹，進(jìn)化樹可靠性估計(jì)Bootstrap值設(shè)定為1 000。使用BEAST1.8.4軟件構(gòu)建HAdV-55的hexon和fiber基因全長(zhǎng)的進(jìn)化樹和推測(cè)病毒的核苷酸進(jìn)化速率，計(jì)算方法基于用貝葉斯馬爾科夫鏈蒙特卡洛(MCMC)分析，貝葉斯分析中使用SRD06作為核苷酸替換模式。

2 結(jié)果

2.1hexon、pentonbase和fiber基因同源性分析本研究獲得的9株HAdV-55病毒株的hexon基因全長(zhǎng)的同源性分別為99.9%～100%，與HAdV-55原型株(QS-DLL株分離于2006年，GenBank序列號(hào)：FJ643676)的核苷酸序列同源性為99.9%～100%，與最古老西班牙株(273株，于1969年分離，GenBank序列號(hào)：FJ841900)的同源性為99.8%，與HAdV-B11p的同源性為98.2%～98.3%。北京Beijing2011-031株在Hexon基因第1 629位核苷酸有T→C的無(wú)義突變。云南2株病毒在Hexon基因第1 694位核苷酸共享A→G替代，導(dǎo)致氨基酸發(fā)生從N→S轉(zhuǎn)換，在第2 539位核苷酸共享A→T替代，導(dǎo)致氨基酸發(fā)生從T→S轉(zhuǎn)換。本研究9株分離株的fiber基因同源性分別為99.9%～100%，與HAdV-55原型株(QS-DLL株)的同源性為99.9%～100%，與最古老西班牙273株的同源性為99.8%～99.9%，與HAdV-B14的同源性為99.4%～99.5%；云南2株病毒在585位置共享G→A無(wú)義突變，河北Hebei2012-3和Hebei2012-0045毒株在619位置共享A→C替代，導(dǎo)致氨基酸發(fā)生從T→P轉(zhuǎn)換，北京Beijing2012-115和山東Shandong2013-7 577株在955位置核苷酸共享T→C替代，導(dǎo)致氨基酸發(fā)生從Y→H轉(zhuǎn)換。9株病毒的penton base基因序列極為保守，僅僅在云南Yunnan2014-9705和Yunnan2014-9 754株中發(fā)現(xiàn)在1 506位置核苷酸共享C→T的無(wú)義突變，而與其他毒株包括HAdV-55原型株(QS-DLL株)核苷酸序列均為100%一致，所有毒株與HAdV-B14的核苷酸序列同源性為高達(dá)99.8%。

圖1 腺病毒55型分離株與其代表株的hexon、fiber和penton base基因全長(zhǎng)進(jìn)化樹Fig.1 Phylogenetic analysis of the HAdV-55 based on hexon, fiber and penton base gene

2.2進(jìn)化樹的構(gòu)建基于HAdV-55病毒分離株hexon(2 841 bp)、fiber(978 bp)和penton base(1 674 bp)全長(zhǎng)基因，分別利用NJ 法和ML 法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，結(jié)果顯示拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)基本一致，本文僅顯示ML法構(gòu)建結(jié)果(圖1)。Hexon基因進(jìn)化樹顯示，HAdV-55和HAdV-11p的聚集在一個(gè)分支中，而fiber和penton base基因進(jìn)化樹均顯示HAdV-55病毒株和HAdV-14原型株聚集在同一個(gè)分支中，說(shuō)明其共同的重組進(jìn)化來(lái)源。1969年分離到的西班牙HAdV-55病毒株位于一個(gè)獨(dú)立的進(jìn)化分支，說(shuō)明其與其他年代的毒株遺傳距離較大。本研究獲得的9株HAdV-55和從GenBank下載的國(guó)內(nèi)外HAdV-55毒株在hexon基因進(jìn)化樹上均位于同一分支，說(shuō)明HAdV-55的Hexon基因高度保守。同樣，本研究的9株病毒和其他時(shí)間和地點(diǎn)流行株的Fiber和penton基因在進(jìn)化上是高度保守的，均位于一個(gè)進(jìn)化分支。然而hexon基因的MCMC進(jìn)化樹結(jié)果顯示(圖2)，HAdV-55的hexon基因在進(jìn)化樹具有明顯的時(shí)間聚集性，1969年的西班牙273株形成一個(gè)獨(dú)立分支， 1997年的美國(guó)株和2005年新加坡株形成一個(gè)獨(dú)立進(jìn)化分支，2001年和2002年分離到的臺(tái)灣株形成一個(gè)獨(dú)立分支，而2006年我國(guó)陜西省岐山縣分離到的HAdV-55原型株(QS-DLL株)形成一個(gè)獨(dú)立進(jìn)化分支，而其他2010年以后流行的HAdV-55株與之形成一個(gè)共同進(jìn)化分支。

圖2 腺病毒55型分離株與其代表株的hexon基因貝葉斯進(jìn)化樹Fig.2 Bayesian phylogenetic tree of the HAdV-55 based on hexon gene were conducted in beast 1.8.4. Coloured branches represent different collection years of HAdV-55 viruses.)

2.3進(jìn)化率和最新的共同祖先(tMRCA)分析基于hexon基因貝葉斯分析發(fā)現(xiàn)，非相關(guān)對(duì)數(shù)正態(tài)松弛(Uncorrelated lognormal relaxed clock model)分子鐘模型最適合作為HAdV-55的hexon基因進(jìn)化率計(jì)算的模型參數(shù)。根據(jù)選定的模型計(jì)算結(jié)果顯示，HAdV-55毒株Hexon基因的估計(jì)核苷酸替換率約為5.228×10-5substitutions/site/year(95%可信區(qū)間為0.05～1.09×10-4)，fiber基因的估計(jì)核苷酸替換率約為1.238×10-4substitutions/site/year(95%可信區(qū)間為0.32～2.33×10-4)。HAdV-55株hexon基因起源的tMRCA可追溯到1963年(95%可信區(qū)間為1915.5～2062.0)。

3 討論

自2006年HAdV-55首次被鑒定以來(lái)，由其導(dǎo)致的急性呼吸道感染公共衛(wèi)生事件在中國(guó)及全世界范圍內(nèi)時(shí)有報(bào)道，尤其常見于兵營(yíng)。同時(shí)，HAdV-55還可引發(fā)成人重癥肺炎。本研究對(duì)5個(gè)省市發(fā)熱呼吸道癥候群患者標(biāo)本中分離到HAdV-55毒株進(jìn)行了hexon、fiber和penton base三個(gè)基因的序列測(cè)定，同時(shí)與2006—2016年在12個(gè)省(市、自治區(qū)和直轄市)流行的HAdV-55病毒株進(jìn)行了比對(duì)，并利用多種序列分析軟件進(jìn)行了同源性和基因進(jìn)化分析。結(jié)果顯示，HAdV-55自2006年首次發(fā)現(xiàn)至今的10年間在我國(guó)形成了廣泛傳播和持續(xù)流行態(tài)勢(shì)，并且已成為我國(guó)重要的呼吸道感染以及肺炎病原體之一。

基因重組是HAdV進(jìn)化和免疫逃逸的一個(gè)重要特征，HAdV-55就是由HAdV-11和HAdV-14通過(guò)同源重組形成[1,14]?；仡櫺匝芯堪l(fā)現(xiàn)，以前劃分為HAdV-11a的病毒分離株實(shí)際上就是HAdV-55病毒株，因此，GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中最早的HAdV-55可以追溯到1969年的西班牙273株。基因進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)，HAdV-55病毒株的hexon、fiber和penton base三個(gè)基因均高度保守，所有毒株三個(gè)基因的核苷酸和氨基酸序列同源性均>99%，在penton base和fiber基因ML進(jìn)化樹上，HAdV-55和HAdV-14位于同一個(gè)進(jìn)化分支，而hexon基因的ML進(jìn)化樹顯示，HAdV-55和HAdV-11位于同一個(gè)進(jìn)化分支。然而，與HAdV-55原型株(QS-DLL)比較，2011年北京和2014年云南分離的毒株hexon基因均有獨(dú)特的核苷酸替代，但由于基因同源性較高，在ML進(jìn)化樹中分支并不明顯，進(jìn)一步構(gòu)建MCMC進(jìn)化樹，結(jié)果中較為清晰的顯示了基于hexon基因的進(jìn)化時(shí)間聚集特征，不同時(shí)間來(lái)源的分離株聚集在不同的進(jìn)化分支中，提示HAdV-55在進(jìn)化上有一定的時(shí)間聚集進(jìn)化趨勢(shì)。

本研究發(fā)現(xiàn)， HAdV-55病毒 hexon和fiber基因的核苷酸進(jìn)化率分別為5.228×10-5和1.238×10-4substitutions/site/year，要遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于其他B屬HAdV，如HAdV-3和HAdV-7病毒 Hexon和fiber基因的核苷酸進(jìn)化率(分別為0.234×10-3和1.085×10-3、0.132×10-3和1.107×10-3、substitutions/site/year)[15]，結(jié)果提示HAdV-55可能在進(jìn)化上更加保守穩(wěn)定。但考慮到本研究涉及的hexon基因毒株多數(shù)來(lái)自近10年，且70%以上的毒株來(lái)自中國(guó)，其他毒株僅僅來(lái)自韓國(guó)、美國(guó)和西班牙3個(gè)國(guó)家，因此有可能會(huì)低估了HAdV-55的進(jìn)化速率。目前，隨著腺病毒全基因組測(cè)序技術(shù)的發(fā)展和成熟，來(lái)自世界不同國(guó)家地區(qū)和不同年代HAdV-55基因數(shù)據(jù)的不斷積累，將會(huì)更加準(zhǔn)確的預(yù)測(cè)HAdV-55進(jìn)化速率和時(shí)間地理進(jìn)化趨勢(shì)，為HAdV-55疫苗的相關(guān)研究和預(yù)防控制提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和科學(xué)基礎(chǔ)。

綜上所述，本研究通過(guò)基于hexon、fiber和penton base基因的生物信息學(xué)分析，對(duì)過(guò)去10年間我國(guó)HAdV-55病毒株進(jìn)行了流行和基因進(jìn)化特征分析，報(bào)道了HAdV-55的進(jìn)化趨勢(shì)和進(jìn)化速率；盡管本研究結(jié)果顯示HAdV-55的三個(gè)主要的結(jié)構(gòu)蛋白在進(jìn)化上極為穩(wěn)定，但仍然在選擇壓力下緩慢進(jìn)化，具有一定的時(shí)間進(jìn)化趨勢(shì)。為了更好應(yīng)對(duì)由HAdV-55導(dǎo)致的呼吸道感染暴發(fā)或者散發(fā)公共衛(wèi)生事件，必須建立連續(xù)有效的監(jiān)測(cè)體系，掌握其在我國(guó)的進(jìn)化及流行動(dòng)態(tài)。同時(shí)，考慮到HAdV-55暴發(fā)流行感染人群的特殊性，對(duì)研制HAdV-55疫情應(yīng)急疫苗相關(guān)研究也應(yīng)獲得重視。

利益沖突無(wú)

參考文獻(xiàn)

[1] Davison AJ, Benko M, Harrach B. Genetic content and evolution of adenoviruses[J]. J Gen Virol， 2003, 84(Pt 11): 2895-2908. DOI: 10.1099/vir.0.19497-0.

[2] Chroboczek J, Ruigrok RW, Cusack S. Adenovirus fiber[J]. Curr Top Microbiol Immunol， 1995, 199(Pt1):163-200.

[3] Yang Z, Zhu Z, Tang L, et al. Genomic analyses of recombinant adenovirus type 11a in China[J]. J Clin Microbiol, 2009,47(10):3082-3090. DOI: 10.1128/JCM.00282-09.

[4] Seto, D, Jones MS, Dyer DW, et al. Characterizing, typing, and naming human adenovirus type 55 in the era of whole genome data[J]. J Clin Virol, 2013, 58(4): 741-742. DOI: 10.1016/j.jcv.2013.09.025.

[5] Sun B, He HY, Wang Z, et al. Emergent severe acute respiratory distress syndrome caused by adenovirus type 55 in immunocompetent adults in 2013: a prospective observational study[J]. Crit Care, 2014, 18(4): 456. DOI: 10.1186/s13054-014-0456-6.

[6] Chen M, Zhu Z, Huang F, et al. Adenoviruses associated with acute respiratory diseases reported in Beijing from 2011 to 2013[J]. PLoS One, 2015, 10(3): e0121375. DOI: 10.1371/journal.pone.0121375.

[7] Chmielewicz B, Benzler BJ, Pauli G, et al. Respiratory disease caused by a species B2 adenovirus in a military camp in Turkey[J]. J Med Virol, 2005, 77(2): 232-237. DOI: 10.1002/jmv.20441.

[8] Kajon, AE, Dickson LM, Metzgar D, et al. Outbreak of febrile respiratory illness associated with adenovirus 11a infection in a Singapore military training cAMP[J]. J Clin Microbiol, 2010, 48(4): 1438-1441. DOI: 10.1128/JCM.01928-09.

[9] Salama M, Amitai Z, Amir N, et al. Outbreak of adenovirus type 55 infection in Israel[J]. J Clin Virol, 2016, 78: 31-35. DOI: 10.1016/j.jcv.2016.03.002.

[10] Wang W, Liu Y, Zhou Y, et al. Whole-genome analyses of human adenovirus type 55 emerged in Tibet, Sichuan and Yunnan in China, in 2016[J]. PLoS One, 2017, 12(12): e0189625. DOI: 10.1371/journal.pone.0189625.

[11] Chen Y, Liu FH, Wang CB, et al. Molecular Identification and Epidemiological Features of Human Adenoviruses Associated with Acute Respiratory Infections in Hospitalized Children in Southern China, 2012-2013[J]. PLoS One, 2016, 11(5): e0155412. DOI: 10.1371/journal.pone.0155412.

[12] Tan DY, Zhu HD, Fu YY, et al. Severe Community-Acquired Pneumonia Caused by Human Adenovirus in Immunocompetent Adults: A Multicenter Case Series[J]. PLoS One, 2016, 11(3): e0151199. DOI: 10.1371/journal.pone.0151199.

[13] Kumar S, Stecher G, Tamura K. MEGA7: Molecular evolutionary genetics analysis version 7.0 for bigger datasets[J]. Mol Biol Evol, 2016, 33(7):1870-1874. DOI: 10.1093/molbev/msw054.

[14] Walsh, MP, Seto J, Jones MS, et al. Computational analysis identifies human adenovirus type 55 as a re-emergent acute respiratory disease pathogen[J]. J Clin Microbiol, 2010, 48(3): 991-993. DOI: 10.1128/JCM.01694-09.

[15] Lin YC, Lu PL, Lin KH, et al.Molecular epidemiology and phylogentic analysis of human adenovirus caused an outbreak in Taiwan during 2011[J].PloS One,2015,10(5):e0127337.DOI:10.1371/journal. pone. 0. 127377.