高克，孫昭，曹凱航，楊玉曉，喬秀文*，李紅玲，齊譽，葉邦策

（石河子大學化學化工學院/新疆兵團化工綠色過程重點實驗室/省部共建國家重點實驗室培育基地/材料化工新疆維吾爾自治區(qū)重點實驗室，新疆 石河子 832003）

血清甲胎蛋白（AFP）作為一種功能性的癌胚糖蛋白[1]，是目前唯一廣泛應用于篩查和診斷原發(fā)性肝癌的腫瘤標志物[2]。在健康人血清中AFP濃度低于25 ng/mL，而在肝癌患者中會明顯增加，因此，血清中AFP的檢測在診斷中起著重要的作用，廣泛用于肝癌患者的早期診斷[3]。免疫傳感器由于其靈敏度高、特異性強的優(yōu)點得到人們的廣泛關(guān)注[4]。電化學免疫分析法和其它免疫分析方法[5,6]如酶聯(lián)免疫吸附測定[7]和單徑向免疫擴散測定法相比，因為它的便攜性，低成本和高靈敏度的測量技術(shù)[8]諸多優(yōu)點可以作為一種理想的檢測分析方法。

多孔碳材料具有高比表面積、高孔隙率、良好的導電性、可控的孔徑和表面性能在鋰電池、催化劑載體等方面有很多潛在應用。氮摻雜能改變碳材料的電學性質(zhì)，使多孔碳材料在很多方面的應用得到提高[9-11]。聚鄰苯二胺是聚苯胺[12-13]的衍生物，它比聚苯胺所具有的氨基及亞氨基更多，可以提供更多的再生基團[14]，在實際應用中功能性更強，是一種應用性前景較為廣闊的一種聚合物材料。

本研究先將NC-CS[15]滴涂在電極表面，后通過電化學聚合鄰苯二胺，從而制備了基于PoPD/NC-CS構(gòu)建的甲胎蛋白免疫傳感器。NC-CS的使用提高了聚鄰苯二胺的電化學性質(zhì)，使其呈現(xiàn)出較好的電化學活性。且利用殼聚糖[16]將NC固定在電極表面使其不易脫落，并且可以牢固的連接聚鄰苯二胺，使其電活性很好的保持。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

鄰苯二胺購于 Sigma，乙二胺（C2H8N2）、乙酸、葡萄糖及殼聚糖（CS）購于國藥集團（中國上海），磷酸二氫鈉（NaH2PO4）、磷酸氫二鈉（Na2HPO4）購于光復科技有限公司（中國天津），甲胎蛋白（AFP）購于賽博生物（中國鄭州），牛血清白蛋白購于阿法埃莎（中國天津），鐵氰化鉀（K3[Fe(CN)6]）、亞鐵氰化鉀（K4Fe(CN)6]）、氯化鉀（KCL）等均購于國藥集團（中國上海）；試驗用水為去離子水，試劑均為分析純。

化學實驗采用三電極系統(tǒng)。工作電極為玻碳電極，對電極為鉑絲電極，參比電極為飽和甘汞電極。

測試儀器主要采用Potentiontat/Galvanostst Model 283分析儀（Mattson，美國）、OTF-1200X開啟式管式爐（合肥科晶）、TG 16G臺式高速離心機（湖南凱達）、水熱反應釜（上海鵬弈）、超聲波清洗儀（昆山超聲儀器）、PHS-3B 數(shù)字PH計（上海宏伊）、BSA224S分析天平（德國賽多利斯）、GZX-9140MBE型電熱鼓風干燥箱（上海景洪）等。

1.2 NC-CS的制備

在38 mL去離子水中溶解16 g葡萄糖，隨后滴入乙二胺2 mL并攪拌；將攪拌配置好的溶液置于高壓反應釜內(nèi)，180℃下水熱6 h；反應結(jié)束后自然冷卻至室溫，將反應得到的產(chǎn)物離心水洗，分別利用去離子水以及無水乙醇洗滌至澄清，再將離心得到的產(chǎn)物烘干（80℃，過夜）后，在管式爐中活化（400℃，2 h），得到氮摻雜的多孔碳材料（NC）。

取1 mg純化的NC超聲分散到10mL含有CS（0.5%，wt）的乙酸溶液（1%，wt）中，得到 NC-CS 分散懸浮液。

1.3 免疫傳感器的組裝

先將金電極（GE）依次利用0.5 μm和0.05 μm的Al2O3懸濁液拋光至鏡面，然后分別在無水乙醇及去離子水中超聲清洗，晾干備用。將10 μL NC-CS滴在電極表面晾干；再將電極置于含0.01 mol/L鄰苯二胺及0.1 mol/L硫酸的溶液中，利用電聚合法在電極表面聚合一層聚鄰苯二胺，其中聚合條件為電位區(qū)間為0.3-1.3 V，掃描速率為50mV/s，掃描圈數(shù)30圈；在4℃下，電極依次在anti-AFP和BSA中浸泡12 h及2 h，得到GE/NCCS/PoPD/antiAFP電極；在不同濃度的AFP溶液中孵育30min后，存放于4℃下保存。

免疫傳感器組裝過程如圖1所示。

圖1 免疫傳感器的組裝過程Fig.1 The fabrication progress of immunosensor

1.4 檢測方法

本實驗CV測試條件為：在含有0.1 mol/L KCl測的PBS溶液（pH=7.0）中測試，掃描電位區(qū)間為-0.9--0.1 V，掃描速率為50mV/s，孵育溫度為30℃。

EIS測試條件為：pH7.0含 5.0mmol/L Fe(CN)6]3-/4-PBS緩沖液，頻率為0.001 Hz-100 kHz。

2 結(jié)果與討論

2.1 免疫傳感器過程中的循環(huán)伏安表征

圖2中，a是在裸電極表面聚合鄰苯二胺所對應的循環(huán)伏安曲線，b是在電極表面修飾一層NC-CS后，再聚合一層聚鄰苯二胺所對應的循環(huán)伏安曲線。

由圖2可以看到：修飾NC-CS后再聚合聚鄰苯二胺的峰電流值明顯高于不修飾NC-CS的峰電流。這表明NC-CS的修飾可以提高聚鄰苯二胺的電活性。

圖2 多孔碳修飾對比Fig.2 Comparison of modified porous carbon

圖3 是不同材料修飾電極表面后在0.1 mol/L PBS緩沖液中的循環(huán)伏安曲線。

由圖3可知：

（1）GE電極的循環(huán)伏安曲線中無氧化還原峰出現(xiàn)（圖 3a）。

（2）當NC-CS/PoPD修飾在電極表面后，出現(xiàn)了一對氧化還原峰（圖3b）。這是由于電子媒介體被成功修飾到電極上。

（3）電極在不良導體anti-AFP及BSA溶液中浸泡后，峰電流出現(xiàn)明顯降低（圖3c、3d）。這是由于其不良導電能力阻礙了電子傳遞，致使電流值降低。

圖3 電極修飾過程的循環(huán)伏安曲線Fig.3 CV of the different modified electrodes in 0.1 mol/L PBS solution（pH=7.0）

2.2 免疫傳感器組裝過程中的交流阻抗表征

圖4是不同修飾電極的EIS。圖4顯示：

（1）裸電極出現(xiàn)高頻率區(qū)明顯小半圓及低頻率區(qū)直線（圖 4a）。

（2）當NC-CS修飾于電極表面后，出現(xiàn)了更小的半圓。這表明NC-CS表現(xiàn)出了良好的電子傳導能力，并加速電子轉(zhuǎn)移。

（3）當PoPD修飾于電極表面后，電阻明顯增加（圖 4c）。

（4）電極在anti-AFP及 BSA溶液中孵育后，高頻區(qū)半圓依次增加（圖4d、4e）。這是由于anti-AFP及BSA為不良導體能夠阻礙電子轉(zhuǎn)移。

（5）不同修飾電極的CV曲線及EIS表明，每一層材料成功被修飾于電極表面，完成免疫傳感器的組裝。

圖4 電極修飾過程的交流阻抗譜圖Fig.4 EIS of the different modified electrodes in 5.0mmol/L Fe(CN)63-/4-（pH=7.0）

2.3 免疫傳感器的掃速

通過實驗分析免疫傳感器的掃描速率圖，探討該免疫傳感器的電化學特性。圖5是不同掃描速率對免疫傳感器的影響，其中從內(nèi)至外的掃描速率依次為 10、20、30、50、60、80、120、150、180mV/s。由圖5可以看出：當掃描速率的平方根越大時，所對應的氧化還原峰電流值也會得到相應的增大，并呈現(xiàn)出良好的線性關(guān)系，如內(nèi)插圖所示。這表明該免疫傳感器在測試底液中的氧化還原反應受擴散控制。

圖5 PANI/PDA/anti-AFP修飾電極的循環(huán)伏安掃速圖Fig.5 CVs of the proposed electrodes at different Scan rates

3 性能測試實驗

3.1 實驗條件的優(yōu)化

檢測液的pH值對抗體、抗原活性以及電活性物質(zhì)有很大的影響。測試實驗考察pH 5.0-8.0范圍內(nèi)PBS緩沖液中免疫傳感器響應電流變化（圖6a），發(fā)現(xiàn)所制備的免疫傳感器在pH 7.0的緩沖液中時所對應的響應電流值最大。故將免疫傳感器的檢測液pH值選定7.0。

免疫結(jié)合反應完全的程度與抗原抗體孵育時間有很大關(guān)系（圖6b）。在本實驗中，NC-CS/PoPD/anti-AFP/BSA制備的免疫傳感器，隨著孵育時間的增加相對應的峰電流相應增加，30min后，峰電流趨于穩(wěn)定，表面anti-AFP和AFP的免疫反應趨于平衡。最佳孵育時間選定為30min。

孵育溫度對抗原抗體的充分結(jié)合影響明顯（圖6c），孵育溫度為30℃時，峰電流值達到最大。

綜上所述，優(yōu)化實驗條件選定為：pH 7.0，孵育時間30min，孵育溫度30℃。

圖6 免疫傳感器的條件優(yōu)化Fig.6 The optimization of detection conditions:pH of detection solution(a),incubation time(b),and incubation temperature(c)on the peak current of CVs.above detections in 0.1 mol/L PBS containing 0.1 mol/L KCl,Scan rate:50mV/s

3.2 免疫傳感器的線性范圍和檢測限

基于NC-CS/PoPD/anti-AFP/BSA構(gòu)建的電化學免疫傳感器在含0.1 mol/L KCl的0.1 mol/L PBS溶液（pH=6.5）中進行CV測定，AFP濃度從外向內(nèi)為0.01-80 ng/mL，結(jié)果如圖7所示。由于抗原抗體發(fā)生特異性結(jié)合反應，阻礙電子傳遞，所對應的峰電流濃度隨著抗原濃度增加而降低（圖7）?？梢缘玫酱嗣庖邆鞲衅鞯木€性范圍為0.005-100 ng/mL，線性方程為y=8.703logCAFP+21.93，R2=0.9921，檢測限為0.0006 ng/mL。

圖7 不同濃度下免疫傳感器的循環(huán)伏安譜圖Fig.7 CVs of different concentration of AFP in PBS solution（pH=7.0）

3.3 免疫傳感器的重現(xiàn)性、穩(wěn)定性和選擇性

本實驗分別探討該免疫傳感器的重現(xiàn)性、穩(wěn)定性及選擇性。

先在最優(yōu)條件下對相同濃度的溶液進行檢測，響應電流值的相對標準偏差小于3.8%（n=5）；再制備好免疫傳感器之后，對免疫傳感器進行連續(xù)掃描90圈于pH為6.5的緩沖液中，與初始電流相比，峰電流僅下降2%；最后把制備的電化學免疫傳感器保存在緩沖液的上方，保存條件為pH7.0、溫度4℃，每隔3天對同一傳感器進行測定，30天后免疫傳感器的響應電流值下降了5%。上述結(jié)果（圖8）表明該免疫傳感器具有較好的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性。

免疫傳感器的選擇性是衡量其抗干擾能力和特異性的重要指標。本實驗中，將制備好的免疫傳感器放入濃度為1 ng/mL的AFP抗原溶液和含干擾物質(zhì)的80 ng/mL的AFP抗原溶液中，孵育20min，采用循環(huán)伏安法檢測并記錄峰電流。加入溶液中的干擾物質(zhì)有牛血清白蛋白（BSA）及癌胚抗原（CEA）、多巴胺（DA）。

結(jié)果（圖8）表明：兩者的響應電流值無明顯差異，測量誤差小于3.2%。說明該免疫傳感器具有較好的選擇性。

4 結(jié)論

（1）成功構(gòu)建了基于氮摻雜多孔碳及PoPD構(gòu)建的的無標記電流型AFP免疫傳感器。

（2）氮摻雜多孔碳具備良好的生物相容性，提高了PoPD的電化學活性。

（3）聚鄰苯二胺的氨基及亞氨基可以固載更多的anti-AFP，從而提高電化學免疫傳感器的性能。

[1]Wang H,He L,Zhang Y,et al.Label-free immunosensor based on Pd nanoplates for amperometric immunoassay of alpha-fetoprotein[J].Biosensors& Bioelectronics,2013,53C(6):305-309.

[2]Zhou H,Gan N,Li T,et al.The sandwich-type electrochemiluminescence immunosensor for α-fetoprotein based on enrichmentby Fe3O4-Au magnetic nano probes and signal amplification by CdS-Au composite nanoparticles labeled anti-AFP[J].Analytica chimica acta,2012,746:107-113.

[3]王知.甲胎蛋白生物傳感器的制備和研究[D].蘇州：蘇州大學,2009.

[4]And E C,C J C.A Novel Self-Assembled Nanoparticulate Film for Covalent Attachment of Antibodies to Plastic[J].Langmuir,2003,19(10):4509-4511.

[5]Lin J,Ju H.Electrochemical and chemiluminescent immunosensors for tumor markers[J].Biosensors&Bioelectronics,2005,20(8):1461-1470.

[6]Bahadr E B,Sezgintürk M K.Applications of electrochemical immunosensors for early clinical diagnostics[J].Talanta,2015,132:162-174.

[7]Loomans E E M G,Roelen A J M,Van Damme H S,et al.Assessment of the functional affinity constant of monoclonal antibodies using an improved enzyme-linked immunosorbent assay[J].Journal of Immunological Methods,1995,184(2):207-217.

[8]Li Q,Zeng L,Wang J,et al.Magnetic Mesoporous Organic Inorganic NiCo2O4Hybrid Nanomaterials for Electrochemical Immunosensors[J].Acs Appl mater interfaces,2011,3(4):1366-1373.

[9]Kroto H W,Heath J R,O'Brien S C,et al.C60:Buckminsterfullerene[J].Nature,1985,318(6042):162-163.

[10]Orikasa H,Akahane T,Okada M,Tong Y,Ozaki J-i,Kyotani T.Electrochemical Behavior of Carbon Nanorod Arrays Having Different Graphene Orientations and Crystallinity[J].J Mater Chem,2009,19(26):4615-4621.

[11]Sun X,Li Y.Colloidal Carbon Spheres and Their Core/Shell Structures with Noble-Metal Nanoparticles[J].Angew Chem Int Ed,2004,43:597-601.

[12]黃維垣.高技術(shù)有機高分子材料進展[M].北京：化學工業(yè)出版社,1994.

[13]Qiu J D,Huang H,Liang R P.Biocompatible and label-free amperometric immunosensor for hepatitis B surface antigen using a sensing film composed of poly(allylamine)-branched ferrocene and gold nanoparticles[J].Microchimica Acta,2011,174(1-2):97-105.

[14]Xiao S,Zheng C,Liang L,et al.One-Pot Synthesis and Catalyst Support Application of Mesoporous N-Doped Carbonaceous Materias[J].J Mater Chem,2012,22(24):12149-12154.

[15]Zhen Y L,Guo X Z,Zhi Y L,et al.One-Step Scalable Preparation of N-doped Nanoporous Carbon as High-Performance Electrocatalysts for Oxygen Reduction Reaction[J].Nano Res,2013,6(4):293-301.

[16]Ghalkhani M,Shahrokhian S.Application of carbon nanoparticle/chitosan modified electrode for the square-wave adsorptive anodic striping voltammetric determination of Niclosamide[J].Electrochemistry Communications,2010,12(1):66-69.