三亞地區(qū)神經癥狀患者萊姆病血清篩查分析*

李 沙，陳 婷，李 歡，俞書義，陳 海，朱 雄

(海南省三亞市人民醫(yī)院檢驗科 572000)

萊姆病是一種由蜱叮咬傳播的人獸共患病，其致病病原體為伯氏疏螺旋體。病原體進入機體后早期表現為皮膚游走性紅斑、流感樣癥狀、關節(jié)痛、肌肉痛、胸痛等癥狀，晚期可表現為面神經炎、腦膜炎、面神經麻痹、肢體麻木等神經系統(tǒng)受損[1-2]。萊姆病已在全球70多個國家報道，分布廣泛。我國萊姆病主要集中在東北林區(qū)，但南方許多省份也有報道。有學者已證實海南存在萊姆病病原體感染[3]。三亞作為海南省國際旅游島的中心城市，人口聚集日益上升。海南省大部分1級或2級醫(yī)院臨床醫(yī)師對萊姆病不了解甚至不知道?，F探討三亞地區(qū)萊姆病感染情況，為臨床診斷提供參考。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集2013年3―8月該院因神經系統(tǒng)癥狀就診患者的外周靜脈血5 mL，分別編號和登記，離心分離血清置―20 ℃低溫冰箱保存待檢。

1.2儀器與試劑 羊抗人免疫球蛋白M(IgM)和免疫球蛋白G(IgG)熒光抗體、辣根過氧化物酶(HRP)標記的羊抗人IgM和SPA，均購自美國Sigma公司。PD91菌免疫兔血清、萊姆病抗原片和蛋白免疫印跡法(Western blot)膜條由中國疾病預防控制中心傳染病預防控制所萊姆病室提供。

1.3萊姆病抗體檢測

1.3.1間接免疫熒光試驗(IFA) 采用PD91菌株常規(guī)制備抗原片，將血清用磷酸鹽緩沖液(PBS)(0.01 mmol/L，pH 7.2)從1∶16開始倍比稀釋。在熒光顯微鏡40×10視野下，50%以上螺旋體染上明亮熒光，抗體效價達到IgM≥1∶64或IgG≥1∶128者為陽性。同時做陰性和陽性對照。陰性對照為PBS，陽性對照為PD91菌免疫兔血清。

1.3.2Western blot 將IFA法初篩的陽性標本，進一步使用Western blot檢測。應用PBS-T以1∶25稀釋血清并浸泡抗原條，震蕩4 h，洗脫5次，每次至少10 min，將抗原條分別加入2抗IgG或IgM，過夜。再經過洗脫5次，每次至少10 min，加入顯色劑顯色30 min。顯色結束用純水終止反應。陰性對照為PBS-T，陽性對照為PD91菌免疫兔血清。Western blot結果根據《中國萊姆病WB診斷標準》進行判定。

2 結 果

2.1IFA法檢測實驗結果 采用IFA方法對251例神經系統(tǒng)癥狀患者的血清萊姆病抗體進行檢測，熒光顯微高倍鏡下50%視野顯示明亮菌體熒光為陽性，其中IgG抗體陽性31例，IgM抗體陽性14例，IgG和IgM抗體同時陽性3例，陽性率16.73%。見圖1和表1。

注：箭頭所指為高倍鏡視野下PD91伯氏疏螺旋體顯示綠色熒光，50%視野顯示菌體熒光為陽性

圖1 IFA法檢測血清萊姆病抗體菌陽性(40×10)

2.2Western blot復檢實驗結果 251例患者通過IFA法檢出陽性42例，對42例陽性標本進行Western blot復檢，結果顯示IgG抗體陽性7例，IgM抗體陽性5例，IgG和IgM抗體同時陽性2例，感染率為3.98%。見表2。

表1 251例神經癥狀患者血清萊姆病IFA實驗結果

表2 42例IFA陽性患者的Western blot復檢結果

2.3251例患者的神經系統(tǒng)臨床表現 Western blot復檢10例萊姆病患者中，面神經炎1例，面神經麻痹2例，腦實質損害5例，肢體麻木2例等感覺異常表現。見表3。

表3 251例神經系統(tǒng)癥狀患者不同的臨床表現

3 討 論

萊姆病是由伯氏疏螺旋體引起的一種蜱媒螺旋體病，傳播媒介主要是幾種近緣硬蜱，通過蜱叮咬將病原體傳播人群而發(fā)病[4-5]。該病是一種多系統(tǒng)受損的綜合征，除表現皮膚慢性游走紅斑，心臟受損，關節(jié)癥狀外，還可出現復雜的神經系統(tǒng)癥狀[6]。神經系統(tǒng)損害是萊姆病最嚴重的臨床表現之一，伯氏疏螺旋體具有高度的嗜神經性，不僅可引起神經系統(tǒng)癥狀，還可長期潛伏中樞神經系統(tǒng)，在不同階段表現出不同的神經螺旋體病，嚴重影響患者的生活質量。調查神經系統(tǒng)癥狀患者的萊姆病情況，可為臨床提供一個警示和參考。

自1975年發(fā)現萊姆病以來，至今世界上已有四大洲、70多個國家有該病報道[7]。我國于1986年首次在黑龍江省海林縣林區(qū)發(fā)現萊姆病[8]。近年來調查表明，我國存在較廣泛的萊姆病自然疫源地?；疾÷瘦^高的地方主要集中在東北三省、內蒙古大興安嶺林區(qū)、新疆天山、長江中上游山林地區(qū)。南方地區(qū)如湖南、湖北、福建等地都報道了該病的存在。海南省作為中國最南端的省份，在2011年就有學者報道了蜱感染疾病[9]。2015年也有學者對海南省關節(jié)炎和神經癥狀患者進行血清萊姆病伯氏疏螺旋體抗體篩查，采用IFA法篩查，進一步使用Western blot確證，然后對陽性患者血清提取DNA和PCR，產物進行基因測序分析，確證海南省存在萊姆病[3]。本研究調查三亞地區(qū)251例神經系統(tǒng)癥狀患者的萊姆病情況，結果顯示IFA法初篩陽性率為16.73%，Western blot確證感染萊姆病10例，感染率3.98%，表明三亞地區(qū)存在神經系統(tǒng)癥狀的萊姆病患者，提示臨床對該類患者應考慮是否患萊姆病。

本研究結果表明，IFA法檢測251例血清萊姆病抗體，初篩陽性率為16.93%，而Western blot檢測陽性率為3.98%，IFA法陽性率高于Western blot的原因是，IFA法與鉤端螺旋體、梅毒螺旋體有交叉反應，而Western blot抗原膜片為伯氏疏螺旋體的特異性抗原。有學者通過IFA法和酶聯免疫吸附試驗法分析827例疑似萊姆病患者的血清伯氏疏螺旋體抗體發(fā)現，陽性135例，陽性率16.32%，其中神經系統(tǒng)癥狀患者344例，陽性88例，陽性率為25.6%[10]。如果通過Western blot檢測患者血清存在伯氏疏螺旋體抗體，再結合臨床癥狀和蜱叮咬史，基本可以確診患有萊姆病。

本研究認為三亞地區(qū)存在萊姆病，可為臨床提供參考。據三亞市國土環(huán)境資源局的統(tǒng)計數據顯示，2015年三亞的森林覆蓋率達68%，當地存在大量林區(qū)工人和護林人員，林區(qū)作業(yè)者是萊姆病易感人群，感染源為含有伯氏疏螺旋體的蜱，通過叮咬傳播。本研究下一步目標將根據患者的住所和作業(yè)環(huán)境溯源，捕捉當地的蜱，進行病原學培養(yǎng)。若能成功培養(yǎng)伯氏疏螺旋體，將成為該地區(qū)是萊姆病自然疫源地的直接證據。

參考文獻

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