朱 雄，侯學(xué)霞，于 莉，張 琳，陳運(yùn)優(yōu)，苗廣青，陳 婷，郝 琴，何呂芬

萊姆病(Lyme disease)是由伯氏疏螺旋體(Borreliaburgdorferi, BB) 感染引起的，一種由媒介蜱傳播的自然疫源性人獸共患病。1982年，Burgdorferi W等[1]首次從肩突硬蜱體內(nèi)成功分離出螺旋體，螺旋體感染通常是開(kāi)始于肩突硬蜱幼蟲(chóng)階段，主要以哺乳動(dòng)物為宿主，積聚于宿主中腸。病原體進(jìn)入機(jī)體后早期表現(xiàn)為皮膚游走性紅斑、流感樣癥狀、關(guān)節(jié)痛、肌肉痛、胸痛等癥狀，晚期可表現(xiàn)為面神經(jīng)炎、腦膜炎、面神經(jīng)麻痹、肢體麻木等神經(jīng)系統(tǒng)受損[2-3]。萊姆病在美國(guó)稱為第二“艾滋病”,被列為世界性公共衛(wèi)生問(wèn)題[4]。目前，萊姆病在亞洲、歐洲、美洲、大洋洲、非洲等 70多個(gè)國(guó)家均有報(bào)道，分布廣泛[5]。萊姆病在我國(guó)30個(gè)省、市、自治區(qū)都有過(guò)相關(guān)報(bào)道，主要集中在東北林區(qū)，南方許多省份也有報(bào)道[6]。有學(xué)者已證實(shí)海南三亞存在萊姆病病原體感染[7-8]。然而萊姆病在海南西部地區(qū)的分布情況不明確，因此，本文通過(guò)對(duì)海南西部地區(qū)的關(guān)節(jié)炎或神經(jīng)癥狀病患者開(kāi)展萊姆病血清流行病學(xué)調(diào)查研究，了解海南省西部地區(qū)萊姆病感染狀況。

1 材料與方法

1.1血清樣本的收集 2015年08月30日至11月30 日，從東方市人民醫(yī)院收集400份血清，儋州市人民醫(yī)院收集500份血清。所有血清均來(lái)源于患有關(guān)節(jié)炎癥狀或神經(jīng)系統(tǒng)癥狀患者，均排除風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等其他疾病。

1.2主要試劑 羊抗人IgM和IgG熒光抗體、HRP標(biāo)記的羊抗人IgM 和SPA，均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。萊姆病抗原片和WB膜條由中國(guó)疾病預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制所萊姆病室提供。

1.3 萊姆病抗體檢測(cè)

1.3.1間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)(IFA) 將血清用3%卵黃液從1∶16開(kāi)始倍比稀釋，在熒光顯微鏡40×10視野下,50%以上螺旋體染上明亮熒光，抗體效價(jià)IgM≥1∶64,IgG≥1∶128為陽(yáng)性。同時(shí)做陽(yáng)性、陰性對(duì)照。

1.3.2蛋白免疫印跡法(WB) 將IFA初篩的陽(yáng)性標(biāo)本用WB進(jìn)一步檢測(cè)。用PBS-T以1∶25稀釋血清并浸泡抗原條，震蕩4 h，洗脫3～5次，每次5～10 min，將抗原條分別加入二抗IgG或IgM，過(guò)夜。再經(jīng)過(guò)洗脫5次，每次5～10 min，加入顯色劑顯色30 min。顯色結(jié)束，用純水終止反應(yīng)。WB結(jié)果根據(jù)中國(guó)萊姆病WB診斷標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判定[9-10]，當(dāng)OspA、OspB、OspC、14 kD、17 kD、28 kD、30 kD、39 kD、58 kD、66 kD、83/100 kD中至少有一條蛋白顯色即可診斷IgG陽(yáng)性；OspA、OspB、OspC、14 kD、17 kD、30 kD、39 kD、58 kD、83/100 kD中至少有一條蛋白帶顯色可診斷IgM陽(yáng)性；如果是41 kD顯色，須進(jìn)一步作梅毒螺旋體和鉤體鑒別診斷。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)數(shù)資料以率表示， 采用χ2檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1萊姆病血清學(xué)抗體檢測(cè)結(jié)果 利用IFA方法檢測(cè)血清樣本900份，35份陽(yáng)性，其中IgG陽(yáng)性 28份，IgM 陽(yáng)性共10份，有3份樣本的IgG和IgM同時(shí)為陽(yáng)性。這次調(diào)查結(jié)果顯示，海南省西部地區(qū)關(guān)節(jié)炎或神經(jīng)性疾病患者的萊姆病的IFA陽(yáng)性率為3.89%(見(jiàn)表1)。對(duì)IFA 檢測(cè)陽(yáng)性的35份血清樣本進(jìn)一步用 WB方法確認(rèn)，結(jié)果顯示共有15份 WB檢測(cè)陽(yáng)性， 其中IgG陽(yáng)性10份， IgM 陽(yáng)性8份，有3份樣本的IgG和IgM同時(shí)為陽(yáng)性(見(jiàn)表2)。

2.2不同性別人群感染狀況 所有調(diào)查對(duì)象中, IFA方法檢測(cè)男性血清萊姆病總抗體陽(yáng)性率4.33%，高于女性的3.52%(見(jiàn)表3)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.389，P=0.533)。經(jīng)IFA和WB兩步法檢測(cè)男性血清萊姆病總抗體陽(yáng)性率1.68%，女性血清萊姆病總抗體陽(yáng)性率1.66%(見(jiàn)表3)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.001，P=0.975)。

2.3不同年齡人群萊姆病感染情況 所有調(diào)查對(duì)象中,所有年齡組均檢出陽(yáng)性者， 血清萊姆病抗體陽(yáng)性標(biāo)本的患者年齡跨度為5～85歲。其中，IFA方法檢測(cè)結(jié)果，≤20歲為4人,陽(yáng)性率最高，為11.76%(4/34),21～40歲次之，陽(yáng)性率為8.60%(8/93)，41～60歲、61～80歲和≥81歲陽(yáng)性率分別為1.85%(5/271)、4.21%(15/356)、2.40%(3/125)，另有21份樣本無(wú)年齡報(bào)告(見(jiàn)表4)。以上人群的感染率，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=14.684，P=0.005)。IFA和WB兩種方法檢測(cè)結(jié)果，≤20歲、21～40歲、41～60歲、61～80歲和≥81歲陽(yáng)性率分別為11.76%(4/34)、3.23%(3/93)、0.74%(2/271)、1.40%(5/356)和0.80%(1/125)，不同年齡人群萊姆病感染率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=24.108，P<0.001)。見(jiàn)圖1。

表1 海南西部地區(qū)萊姆病血清學(xué)抗體檢測(cè)結(jié)果
Tab.1 Serological antibody detection of Lyme disease in Western areas of Hainan Province

抗體類型檢測(cè)數(shù)IFA法陽(yáng)性數(shù)陽(yáng)性率(%)IgG900283.11IgM900101.11IgG和IgM90030.33IgG和(或)IgM900353.89

表2 35例IFA陽(yáng)性標(biāo)本的 WB檢測(cè)結(jié)果
Tab.2 Results of WB detection in 35 IFA positive samples

序號(hào)性別年齡首診癥狀I(lǐng)gG(+)IgM(+)1女5神經(jīng)癥狀33 kD37,39 kD2男8神經(jīng)癥狀37,39 kD-3男12神經(jīng)癥狀37,39 kD-4男13神經(jīng)癥狀-39 kD5女59神經(jīng)癥狀37,39 kD-6女28神經(jīng)癥狀-33 kD7女30關(guān)節(jié)癥狀39 kD-8男33關(guān)節(jié)癥狀39 kD39 kD9男63神經(jīng)癥狀37,39 kD-10男63關(guān)節(jié)癥狀39 kD-11女68關(guān)節(jié)癥狀-66 kD12男68關(guān)節(jié)癥狀31 kD31 kD、28 kD13女57關(guān)節(jié)癥狀-83-100 kD14女73關(guān)節(jié)癥狀39 kD-15女85關(guān)節(jié)癥狀-36 kD

表3 不同性別人群血清萊姆病抗體檢測(cè)結(jié)果
Tab.3 Results of serum antibody of Lyme disease in different sex groups

性別檢測(cè)數(shù)IFA法WB法陽(yáng)性數(shù)陽(yáng)性率(%)陽(yáng)性數(shù)陽(yáng)性率(%)男416184.3371.68 女483173.5281.66 不詳100.0000.00

2.4不同癥狀患者萊姆病感染情況 對(duì)不同癥狀人群萊姆病血清抗體檢測(cè)結(jié)果顯示, IFA方法檢測(cè)關(guān)節(jié)癥狀患者萊姆病總抗體陽(yáng)性率4.47%，略高于神經(jīng)癥狀的陽(yáng)性率3.19%(見(jiàn)表5)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.986，P=0.321)。IFA和WB兩種方法檢測(cè)關(guān)節(jié)癥狀患者萊姆病總抗體陽(yáng)性率1.63%，略低于神經(jīng)癥狀的陽(yáng)性率1.72%(見(jiàn)表5)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.011，P=0.917)。

表4 不同年齡人群血清萊姆病抗體檢測(cè)結(jié)果
Tab.4 Results of serum antibody of Lyme disease in different age groups

年齡組檢測(cè)數(shù)IFA法WB法陽(yáng)性數(shù)陽(yáng)性率(%)陽(yáng)性數(shù)陽(yáng)性率(%)≤2034411.76 411.76 21～409388.60 33.23 41～6027151.85 20.74 61～80356154.21 51.40 ≥8112532.40 10.80 不詳2100.00 00.00

圖1 不同年齡人群血清萊姆病抗體陽(yáng)性率Fig.1 Positive rate of serum antibody of Lyme disease in different age groups

表5 不同癥狀患者血清萊姆病IFA檢測(cè)結(jié)果
Tab.5 Results of IFA test in Lyme patients with different symptoms

癥狀檢測(cè)數(shù)IFA法WB法陽(yáng)性數(shù)陽(yáng)性率(%)陽(yáng)性數(shù)陽(yáng)性率(%)關(guān)節(jié)癥狀492224.47 81.63 神經(jīng)癥狀408133.19 71.72

3 討 論

萊姆病分布廣泛，發(fā)病率呈上升趨勢(shì)，新的疫源地不斷發(fā)現(xiàn)。在北美洲，萊姆病的疫源地主要分布于東北部、中西部及西部地區(qū)。在歐洲，病例主要分布在北歐和中歐地區(qū)[5,11]。在亞洲，分布在日本和中國(guó)。我國(guó)萊姆病的疫區(qū)主要集中在東北部、西北部和華北部分地區(qū)的林區(qū)，分布范圍比較廣，新疆、黑龍江、吉林等省(自治區(qū)) 已有大量萊姆病發(fā)病的病例報(bào)告，而且大多數(shù)地區(qū)已經(jīng)分離出病原體[6,12]。海南省位于中國(guó)的最南端，它的自然地理?xiàng)l件與我國(guó)萊姆病發(fā)生率高的地區(qū)差異極大。2011年金玉明等[13]報(bào)道了蜱感染疾病。2015—2018年，朱雄等[7-8]對(duì)海南省三亞市關(guān)節(jié)炎和神經(jīng)癥狀患者進(jìn)行血清萊姆病伯氏疏螺旋體抗體篩查，確證海南省存在萊姆病。

本次研究從海南西部地區(qū)萊姆病疑似患者血清中檢出萊姆病抗體，表明海南省西部地區(qū)人群存在萊姆病感染。在關(guān)節(jié)炎和神經(jīng)性疾病患者中，IFA法初篩陽(yáng)性率為3.89%，并通過(guò)WB方法確診萊姆病15例，感染率1.67%，人群總感染率低于2018年三亞地區(qū)調(diào)查結(jié)果[8]。表明在海南省西部地區(qū)存在關(guān)節(jié)炎和神經(jīng)系統(tǒng)癥狀的萊姆病患者，提示當(dāng)?shù)氐呐R床醫(yī)生對(duì)該類患者應(yīng)考慮是否患萊姆病。

本研究結(jié)果表明，900例血清樣本中，IFA法檢測(cè)初篩陽(yáng)性率為3.89%，而WB法檢測(cè)陽(yáng)率為1.67%，IFA法陽(yáng)性率高于WB法，原因是IFA法與鉤端螺旋體、梅毒螺旋體等有交叉反應(yīng)導(dǎo)致假陽(yáng)性結(jié)果。2010年，Biesiada G[14]研究表明檢測(cè)萊姆病需要用兩步診斷方法(Two-step diagnosis)，即ELISA 或 IFA 法初篩為陽(yáng)性，且 WB法檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性即可確診，以此來(lái)提高診斷的特異性和準(zhǔn)確性。但血清學(xué)方法檢測(cè)萊姆病仍存在一些問(wèn)題?？笲．burgdorferi的IgM 和IgG可長(zhǎng)期存在于愈后病人或動(dòng)物的血液中，無(wú)法辨別近期感染和繼發(fā)感染，所以血清學(xué)方法不能作為該病臨床療效的判定標(biāo)準(zhǔn)。

從取樣的性別和癥狀結(jié)果分析，不同性別和癥狀人群均有萊姆病螺旋體感染的發(fā)生，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。不同性別萊姆病螺旋體感染結(jié)果分析與武軍元等[15]研究結(jié)果一致，而李志清等[16]研究表明陜西省男性萊姆病總感染水平高于女性，王化勇等[17]研究表明北京市密云地區(qū)女性萊姆病總感染水平高于男性。

從不同年齡人群萊姆病血清抗體檢測(cè)結(jié)果看, 本次標(biāo)本IFA和WB法檢測(cè)≤20歲年齡組的萊姆病感染率居首位, 陽(yáng)性率為11.76% (4/34),這4例陽(yáng)性患者均有神經(jīng)癥狀；21～40歲年齡組次之，61～80歲年齡組居第3位。陜西省61～70歲年齡組人群萊姆病血清抗體陽(yáng)性率最高[16]。新疆喀什市20～50 歲人群的感染率明顯高于 20歲以下和 50歲上人群的感染率[15]。萊姆病是通過(guò)蜱叮咬而感染的一種自然疫源性疾病，不同地區(qū)不同年齡組人群自然感染率的高低與蜱暴露的頻率及持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)短密切相關(guān)。

本研究認(rèn)為海南西部地區(qū)存在萊姆病。本研究樣品數(shù)量有限，雖不能準(zhǔn)確反映當(dāng)?shù)厝巳喝R姆病流行的狀況，但是，為海南省萊姆病的防控提供了理論依據(jù)。提示當(dāng)?shù)蒯t(yī)務(wù)人員在進(jìn)行臨床疾病的診斷中,對(duì)神經(jīng)癥狀和關(guān)節(jié)癥狀的患者，應(yīng)注意萊姆病的鑒別診斷,做到早發(fā)現(xiàn)、早診斷和早治療,控制并發(fā)癥的出現(xiàn)。同時(shí),應(yīng)重視林區(qū)工人、護(hù)林人員、農(nóng)民以及青少年兒童的萊姆病知識(shí)的普及工作,提高當(dāng)?shù)厝巳旱姆雷o(hù)意識(shí),減少蜱暴露及受蜱的叮咬概率,預(yù)防和控制萊姆病的發(fā)生與流行。

利益沖突：無(wú)