白酒黃水中提取乳酸鏈球菌素的研究

李 覓 ，張 磊 ，孫中理 ，郭 杰 ，余 航 ，常少健 ，唐賢華 ，王 晗

(1.四川省食品發(fā)酵工業(yè)研究設(shè)計(jì)院，四川成都611130； 2.釀酒生物技術(shù)及應(yīng)用四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川成都611130； 3.國(guó)家固態(tài)釀造工程技術(shù)研究中心，四川瀘州646000； 4.四川工商職業(yè)技術(shù)學(xué)院，四川成都611830； 5.四川理工學(xué)院，四川自貢643000)

乳酸鏈球菌素（Nisin）可抑制大多數(shù)革蘭氏陽性細(xì)菌，對(duì)芽孢桿菌的孢子有強(qiáng)烈抑制作用[1]。因此，作為食品防腐劑廣泛應(yīng)用于食品行業(yè)，對(duì)食品的色、香、味、口感等無不良影響，且食用后不會(huì)改變?nèi)梭w腸道內(nèi)正常菌群，更不會(huì)與其他抗菌素出現(xiàn)交叉抗性，是一種高效、無毒、安全、無副作用的天然食品防腐劑[2]。

以黃水為主的固態(tài)釀造廢水中存在大量的乳酸菌[3]，乳酸菌在發(fā)酵代謝過程中除產(chǎn)生乳酸、乙酸等有機(jī)酸外，還產(chǎn)生大量的有抑菌或殺菌作用的乳酸鏈球菌素[4]。利用大孔吸附樹脂對(duì)黃水中的乳酸鏈球菌素進(jìn)行粗提取，研究樹脂添加量、提取時(shí)間、轉(zhuǎn)速、提取溫度等因素對(duì)提取效果的影響，以確定乳酸鏈球菌素的最適合提取條件[5]，為釀酒廢水的資源化利用提供思路。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

菌株：藤黃微球菌（釀酒生物與技術(shù)四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供）。

試劑及耗材：大孔吸附樹脂（NAK-Ⅱ，天津南開大學(xué)樹脂有限公司），乳酸鏈球菌素Nisin標(biāo)準(zhǔn)品（106 IU/g，Sigma），乙腈（色譜純，Sigma），三氟乙酸、葡萄糖、乙醇、NaCl、HCl、Na2HPO4·12H2O（AR，成都科龍化工試劑廠），瓊脂粉、蛋白胨、牛肉膏、酵母浸膏（BR，北京奧博星）。

儀器設(shè)備：電子天平，常熟市雙杰測(cè)試儀器廠；分析天平，梅特勒托利多；高效液相色譜（1260），美國(guó)Agilent；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；振蕩培養(yǎng)器，上海博訊；高溫滅菌鍋，上海申安。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 提取工藝[6-8]

預(yù)處理：將黃水粗濾，除去酒糟、稻殼等雜質(zhì)，5000 r/min離心，除去沉淀。

提?。侯A(yù)處理后的黃水加入大孔吸附樹脂（樹脂使用前按照說明書預(yù)處理），置于搖床提取一定時(shí)間，收集樹脂，加入80%、pH2的乙醇解吸后，收集清液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去溶劑，加入0.02 mol/L的鹽酸溶液溶解，得到粗提液。

1.2.2 效價(jià)測(cè)定[9-10]

（1）指示菌：藤黃微球菌

（2）營(yíng)養(yǎng)肉湯瓊脂培養(yǎng)基：蛋白胨1%，牛肉膏0.3%，NaCl 0.5%，瓊脂1.5%，pH7.0。

（3）效價(jià)檢測(cè)培養(yǎng)基（g/100 mL）：蛋白胨0.8，葡萄糖0.5，酵母浸膏0.25，氯化鈉0.5，瓊脂粉1，1%Na2HPO4·12H2O，pH7.0，121 ℃滅菌20 min。

（4）標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

準(zhǔn)確稱取100 mg Nisin標(biāo)準(zhǔn)品，溶于10 mL無菌0.02 mol/L的鹽酸稀溶液中，配成104 IU/mL的Nisin儲(chǔ)備液。取Nisin儲(chǔ)備液，以0.02 mol/L無菌鹽酸為稀釋液，制備濃度為1000 IU/mL、500 IU/mL、250 IU/mL、100 IU/mL、50 IU/mL、10 IU/mL的Nisin工作液。

將檢測(cè)培養(yǎng)基熔化并冷卻至50℃左右，用移液管移取15 mL到無菌平皿中，使其在培養(yǎng)基均勻涂布，放置在水平臺(tái)上凝固后，作為底層平板；另取檢測(cè)培養(yǎng)基適量，熔化后冷卻至45℃左右，加入制好的菌懸液使最終濃度在107～108cfu/mL，迅速搖勻，用移液管移取5 mL在底層上均勻涂布，作為菌層。置水平臺(tái)上冷卻后將牛津杯均勻直立于培養(yǎng)基上。加入200 μL不同濃度工作液于每個(gè)牛津杯中，30℃培養(yǎng)24 h，測(cè)定抑菌圈直徑。

（5）提取樣品效價(jià)測(cè)定

取200 μL粗提液按繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線法測(cè)定。

1.2.3 單因素試驗(yàn)

設(shè)計(jì)單因素試驗(yàn)，以提取物效價(jià)評(píng)估提取效果，分別研究樹脂添加量、提取溫度、提取時(shí)間、轉(zhuǎn)速等條件對(duì)提取效果的影響。

樹脂添加量選擇：在30℃條件下，向黃水中分別添加0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%樹脂，于搖床100 r/min，提取6 h。研究樹脂添加量對(duì)提取效果的影響。

提取溫度選擇：向黃水中添加1.5%樹脂，分別在20℃、30℃、40℃、50℃、60℃條件下，于搖床100 r/min，提取6 h。研究溫度對(duì)提取效果的影響。

提取時(shí)間選擇：在30℃條件下，向黃水中添加1.5%樹脂，搖床100 r/min分別提取6 h、12 h、18 h、24 h、30 h。研究提取時(shí)間的影響。

轉(zhuǎn)速選擇：在30℃條件下，向黃水中添加1.5%樹脂，搖床分別以 50 r/min、100 r/min、150 r/min、200 r/min、250 r/min的轉(zhuǎn)速提取6 h。研究轉(zhuǎn)速對(duì)提取效果的影響。

1.2.4 正交優(yōu)化

以提取物效價(jià)評(píng)估提取效果，設(shè)計(jì)L9（34）正交試驗(yàn)進(jìn)一步優(yōu)化提取條件。正交試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)見表1。

表1 正交試驗(yàn)因素與水平

1.2.5 高效液相色譜條件定性[11]

粗提液用0.22 μm膜過濾后，用高效液相色譜定性。

色譜柱：C18柱，檢測(cè)器：二極管陣列檢測(cè)器，波長(zhǎng)：220 nm，流速：1.5 mL/min，柱溫：25 ℃，進(jìn)樣量50 μL，流動(dòng)相：A（90%乙腈+0.1%三氟乙酸）、B（10%乙腈+0.1%三氟乙酸）。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

以抑菌圈直徑為橫坐標(biāo)，乳酸鏈球菌素效價(jià)對(duì)數(shù)值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖1所示。R2=0.9965，線性較好，滿足試驗(yàn)需求。

圖1 乳酸鏈球菌素標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 樹脂添加量影響（見圖2）

圖2 樹脂添加量對(duì)提取效果的影響

由圖2可知，隨著樹脂添加量的增加，提取物的效價(jià)逐漸提升，說明樹脂量越大，吸附的乳酸鏈球菌素越多。樹脂添加量從0.5%到1.5%，乳酸鏈球菌素吸附量增加幅度較大，樹脂添加量從1.5%到2.5%，乳酸鏈球菌素吸附量增加幅度較小?？赡苁且?yàn)辄S水中一定量的乳酸鏈球菌素被樹脂吸附，含量明顯降低，低到一定程度，樹脂無法吸附。

2.2.2 提取時(shí)間影響（見圖3）

圖3 提取時(shí)間對(duì)提取效果的影響

如圖3可知，隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，乳酸鏈球菌素的提取量逐漸增加，18～24 h范圍內(nèi)增加幅度較大，之后趨于平緩，說明樹脂對(duì)乳酸鏈球菌素的吸附達(dá)到飽和。

2.2.3 轉(zhuǎn)速影響（見圖4）

圖4 轉(zhuǎn)速對(duì)提取效果的影響

如圖4所示，在50～150 r/min范圍內(nèi)，增加轉(zhuǎn)速，可以使乳酸鏈球菌素的提取量增加，但繼續(xù)增加轉(zhuǎn)速，會(huì)引起乳酸鏈球菌素提取量一定程度的降低，最終趨于平緩。一定范圍內(nèi)增加轉(zhuǎn)速可以使乳酸鏈球菌素分子與吸附劑樹脂充分接觸，有利于吸附。但轉(zhuǎn)速過高，可能會(huì)因機(jī)械力的作用而對(duì)吸附造成不利影響。

2.2.4 溫度影響（見圖5）

圖5 溫度對(duì)提取效果的影響

由圖5可知，在20～40℃范圍內(nèi)，隨著溫度升高，乳酸鏈球菌素吸附量增多，在40～60℃范圍，隨著溫度升高，乳酸鏈球菌素吸附量減少。溫度升高，分子運(yùn)動(dòng)加劇，增加乳酸鏈球菌素分子與吸附劑樹脂的碰撞機(jī)會(huì)，一定溫度范圍內(nèi)升高溫度，吸附量增加；但吸附本身是放熱過程，溫度升高，樹脂的吸附能力降低。

2.3 正交試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，設(shè)計(jì)4因素3水平正交試驗(yàn)，進(jìn)一步優(yōu)化乳酸鏈球菌素的粗提取條件，正交試驗(yàn)結(jié)果與分析見表2。通過對(duì)比極差R可以看出，影響乳酸鏈球菌素提取效果的因素：樹脂添加量＞提取溫度＞提取時(shí)間＞轉(zhuǎn)速。通過比較均值k可以看出，乳酸鏈球菌素最優(yōu)提取條件組合為A2B2C3D3，通過驗(yàn)證試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)提取條件為A2B2C3D3時(shí)，效價(jià)為572.02 IU/mL，因此乳酸鏈球菌素最合適提取條件為：樹脂添加量1.5%，提取溫度50℃，提取時(shí)間24 h，轉(zhuǎn)速150 r/min。

表2 L9(34)正交試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.4 高效液相色譜分析定性結(jié)果（圖6、圖7）

圖6 乳酸鏈球菌素標(biāo)準(zhǔn)品的色譜分析

圖7 粗提取樣品的色譜分析

采用高效液相色譜對(duì)粗提取物進(jìn)行定性，乳酸鏈球菌素標(biāo)準(zhǔn)品出峰時(shí)間在9.413 min，粗提取物在9.420 min時(shí)出現(xiàn)了一個(gè)特征峰，從保留時(shí)間的一致性可以初步判定粗提取物為乳酸鏈球菌素，但粗提取物仍存在較多雜質(zhì)，需進(jìn)一步純化。

3 結(jié)論

通過正交試驗(yàn)探究了大孔吸附樹脂添加量、提取時(shí)間、轉(zhuǎn)速、提取溫度對(duì)黃水中乳酸鏈球菌素粗提取的影響，結(jié)果表明影響因素的順序?yàn)闃渲砑恿浚咎崛囟龋咎崛r(shí)間＞轉(zhuǎn)速。乳酸鏈球菌素最合適提取條件為：樹脂添加量1.5%，提取溫度50℃，提取時(shí)間24 h，轉(zhuǎn)速150 r/min，粗提取物效價(jià)為572.02 IU/mL。

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