薛蓉 吳亦潔 李曉晶

摘 要 脫水素是一類植物抗逆相關(guān)蛋白，可幫助植物抵抗干旱、低溫、鹽堿等環(huán)境脅迫。富含賴氨酸的K片段是脫水素中的保守功能片段，在低溫保護和膜保護功能中起至關(guān)重要的作用。目前，脫水素及K片段的作用機理仍不完全清楚。本研究采用圓二色譜（CD）和核磁共振波譜（NMR）方法及分子動力學模擬計算研究了具有抗菌活性的大米脫水素K片段在模擬膜中的三維結(jié)構(gòu)及其與膜的結(jié)合方式。圓二色譜研究表明，水中呈現(xiàn)無規(guī)卷曲構(gòu)象的K片段在模擬膜中會形成α-螺旋結(jié)構(gòu)。核磁共振結(jié)構(gòu)研究進一步證實了K片段在模擬膜中的空間結(jié)構(gòu)，即中間部分形成了兩親性的α-螺旋結(jié)構(gòu)，其中，疏水殘基位于螺旋結(jié)構(gòu)的一面，親水殘基位于螺旋結(jié)構(gòu)的另一面。擴散排序（DOSY）核磁共振實驗表明，K片段與膜在水溶液中形成了穩(wěn)定的結(jié)合體； 順磁性探針檢測表明，整個K片段插入膜中，其中疏水面朝向模擬膜的疏水核，其它部分朝向模擬膜親水表層。本研究得到的K片段在模擬膜中的精細結(jié)構(gòu)為理解環(huán)境脅迫下K片段及脫水素與膜的作用機理提供了重要信息。

關(guān)鍵詞 脫水素；核磁共振；三維結(jié)構(gòu)；膜結(jié)合；分子動力學模擬；K片段

1 引 言

脫水素，又稱二族胚胎發(fā)育晚期豐富蛋白（LEA蛋白），是一類與植物抗逆反應相關(guān)的重要蛋白質(zhì)。這類蛋白質(zhì)在植物胚胎發(fā)育晚期表達量十分豐富，在環(huán)境脅迫（如干旱、低溫、鹽堿等條件）下也會大量累積[1，2]。因此，脫水素被認為是在脅迫過程中對植物起保護作用的重要物質(zhì)之一，是當前抗逆研究方面?zhèn)涫荜P(guān)注的一類蛋白質(zhì)。脫水素的顯著特點是擁有一個或多個富含賴氨酸的保守性K片段。截掉K片段，會使得脫水素ERD10、RcDhn5和TaDHN-5對脫氧脫氫酶（LDH）的低溫保護活性降低[3，4]。K片段自身也可以對LDH起到低溫保護作用[5]。 近期研究表明， 脫水素還具有抗菌活性，K片段在其中起關(guān)鍵作用，且K片段自身具有類似全長蛋白的抵抗革蘭氏陽性菌活性[6]。在遭受各種脅迫的情況下，小麥脫水素的K片段通過阻止蛋白聚集對大腸桿菌起到保護作用，而且K片段也具有抗革蘭氏陰性、陽性菌和真菌的活性[7，8]。河岸葡萄的K片段可以在受到凍融損害時阻止膜融合，并在不改變膜的流動性和表面可及性情況下降低膜轉(zhuǎn)變溫度，對膜起到重要的保護作用[9]。 上述研究結(jié)果表明， 在脫水素的低溫保護及抗菌功能中，K片段發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。盡管體內(nèi)及體外實驗證明了脫水素及K片段的重要性，但目前對其分子作用機制仍不完全清楚。功能是蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的生化表現(xiàn)特征，結(jié)構(gòu)是蛋白質(zhì)行駛功能的基礎。因此，研究脫水素及其重要功能區(qū)域的結(jié)構(gòu)特征是全面認識其作用機制的有效途徑。

脫水素具有高度靈活的結(jié)構(gòu)，它包含大量親水殘基，被認為是天然無規(guī)蛋白。然而，當環(huán)境發(fā)生改變（如缺水或是與膜表面結(jié)合）時，脫水素可以形成一些有序結(jié)構(gòu)[10]。K片段被預測可以形成兩親性的螺旋結(jié)構(gòu)，因此推測其與脫水素的結(jié)構(gòu)改變密切相關(guān)[10]。詳細探究K片段的精細結(jié)構(gòu)對于揭示K片段，甚至于整個脫水素的作用機理是非常必要的。核磁共振波譜（NMR）技術(shù)是原位研究溶液中蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)的主要分析方法，它不僅可在原子水平上提供蛋白質(zhì)在生理條件下的空間結(jié)構(gòu)[11～13]，還可通過觀察蛋白質(zhì)上個別基團的行為特點為分析其分子相互作用等研究提供重要信息。本研究以具有抗菌活性的大米脫水素K片段[6]作為研究對象，利用圓二色譜（CD）、NMR等多種譜學方法及分子動力學模擬計算等手段研究了K片段在模擬膜SDS膠束中的三維結(jié)構(gòu)及其與模擬膜的相互作用方式， 為進一步了解K片段乃至脫水素抗菌及膜保護機理提供了精細的三維結(jié)構(gòu)及取向信息。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

J-810圓二色譜儀（日本Jasco公司）； AVANCE核磁共振波譜儀（600 MHz，Bruker 公司）。合成肽K片段（KKGFLDKIKEKLPGGHKK，純度>95%，蘇州強耀生物科技有限公司）。重水（D2O， 99.8%）、氘代十二烷基磺酸鈉（SDS-d25， 98%），均購于Cambridge Isotope Laboratories公司。實驗用水為去離子水。

2.2 實驗方法

2.2.1 遠紫外圓二色譜（Far-UV CD） 樣品制備：（1）水溶液中樣品制備：將適量K片段直接溶于水中，肽的濃度為30 μmol/L。（2）SDS中樣品制備：分別將適量K片段和SDS溶于水中，將肽溶液移入SDS溶液，旋轉(zhuǎn)混勻，制得K片段濃度30 μmol/L、SDS濃度10 mmol/L的水溶液樣品。

圓二色譜檢測所用石英比色皿的光程為0.1 cm，波長掃描范圍190～260 nm； 帶寬1.0 nm； 實驗檢測溫度為25℃。每個樣品掃描3次，每張CD譜圖取3次掃描圖的平均值。CD譜圖均已扣除背底，并以平均殘基摩爾橢偏率（θMRE）表示：

θMRE =θobs/10lcn（1）

其中， θobs（mdeg）是實驗所測橢偏率， l（cm）是石英比色皿的路徑長度， c（mol/L）是肽的濃度， n是多肽所含氨基酸個數(shù)。

蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)含量通過CDPro軟件分析得到。

2.2.2 核磁共振波譜 樣品制備：稱取1.7 mg K片段溶于220 L水中，稱取31.9 mg SDS-d25溶于275 L水中，將K片段溶液移入SDS-d25溶液，在混合溶液中加入55 L D2O，渦旋混勻，制得550 L的10% D2O-90% H2O的混合溶液，其中，K片段濃度為1.5 mmol/L、SDS-d25濃度為185 mmol/L。

全相關(guān)譜（Total correlation spectroscopy， TOCSY）和核的歐沃豪塞增強譜（Nuclear Overhauser effect spectroscopy， NOESY）檢測均采用壓水峰技術(shù)，混合時間分別為80和150 ms，累積次數(shù)分別為64次和80次。采樣數(shù)據(jù)矩陣2048512，延遲時間2 s，采樣時間0.1548 s，譜寬6613.8 Hz。采用標準Bruker軟件（TOPSPIN 2.1版本）進行譜圖處理，處理后的譜圖用SPARKY軟件進行分析。選用TSP-d4作為內(nèi)標。實驗溫度為298 K。

擴散排序（Diffusion-ordered spectroscopy， DOSY）核磁共振實驗溫度為298 K， 采用含有WATERGATE壓水峰技術(shù)的BPPSTE（Bipolar pulse pair stimulated echo）脈沖序列。擴散時間為200 ms，梯度脈沖持續(xù)時間為4.5 ms，掃描次數(shù)為8。

2.2.3 結(jié)構(gòu)計算 三維空間結(jié)構(gòu)通過CYANA軟件（1.0.6版本4）計算得到。從200個隨機的初始結(jié)構(gòu)開始計算，通過幾何空間的模擬退火計算尋找符合構(gòu)象約束的三維結(jié)構(gòu)。得到的結(jié)構(gòu)按目標函數(shù)值從小到大進行排列，然后利用程序AMBER7對目標函數(shù)值排在前20的結(jié)構(gòu)進一步進行能量優(yōu)化，并用PROCHECK_NMR6程序?qū)Y(jié)構(gòu)進行評估。利用MOLMOL7程序進行結(jié)構(gòu)可視化分析和繪圖。

3 結(jié)果與討論

3.1 結(jié)構(gòu)分析

許多與抗寒和抗旱相關(guān)的天然無規(guī)蛋白具有一個共同特點，即蛋白序列中都包含能促使蛋白與膜結(jié)合的結(jié)構(gòu)基序。玉米脫水素ZmDHN1的刪除研究表明，K片段可能負責將脫水素蛋白結(jié)合到不同膜上[10]，但具體作用殘基及結(jié)合機理仍不清楚。本研究采用CD譜表征K片段在水溶液中和SDS膠束溶液中的二級結(jié)構(gòu)。如圖1所示，在水溶液中，K片段只在197 nm處有一個負的最低峰，表現(xiàn)為典型的自由卷曲結(jié)構(gòu)； 在SDS膠束溶液中，K片段在206 和225 nm出現(xiàn)兩個負的最低峰，在192 nm處出現(xiàn)一個正的最高峰，表明K片段在SDS膠束溶液中主要以α-螺旋結(jié)構(gòu)存在[14]。利用CDPro軟件中CDSSTR程序?qū)﹄牡亩壗Y(jié)構(gòu)含量進行計算，得到α-螺旋含量為33.9%， β-折疊含量為21.1%，轉(zhuǎn)角含量為15.8%， 自由卷曲含量為28.8%。上述結(jié)果說明SDS膠束會誘導K片段由無規(guī)結(jié)構(gòu)向α-螺旋結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變， 這與一些脅迫蛋白會在膜存在時形成α-螺旋結(jié)構(gòu)[15～17]相類似。

進一步利用NMR方法對K片段在SDS膠束溶液中的三維結(jié)構(gòu)進行研究。根據(jù)Wüthrich提出的蛋白質(zhì)NMR譜序列識別方法[18]，結(jié)合TOCSY給出的各氨基酸自旋體系的信息以及NOESY給出的歐沃豪斯效應關(guān)系對NMR譜圖進行歸屬。NOESY譜中大部分相鄰氨基酸殘基間都存在NOE交叉峰，如HNi-HNi+1、Hαi-HNi+1和Hβi-HNi+1，部分不相鄰的氨基酸間也存在NOE交叉峰，如Hαi-HNi+3、 Hαi-Hβi+3和Hαi-HNi+2等（部分NOESY譜圖歸屬見圖2）。其中，連續(xù)的HNi-HNi+1 NOE連接和Hαi-HNi+3、 Hαi-Hβi+3的NOE連接是反映α-螺旋結(jié)構(gòu)的特征連接模式，表明K片段在SDS膠束溶液中主要以α-螺旋結(jié)構(gòu)形式存在。

根據(jù)NOESY譜輸出的NOE連接圖（圖3A）可見，α-螺旋結(jié)構(gòu)的特征連接模式主要存在于G3～L12區(qū)域，表明此區(qū)域形成了α-螺旋結(jié)構(gòu)。進一步通過比較SDS膠束溶液中K片段各個殘基的Hα化學位移值與它在水溶液中自由卷曲時各殘基的Hα化學位移值，可獲得化學位移標志（CSI）數(shù)據(jù)。如圖3B所示，F(xiàn)4～E10區(qū)域存在連續(xù)的-1值，表明K片段在此區(qū)域形成了α-螺旋結(jié)構(gòu)。以上核磁共振表征結(jié)果表明，在SDS膠束溶液中K片段的中間部分形成了α-螺旋結(jié)構(gòu)， 與CD結(jié)果一致。

為了進一步考察各氨基酸殘基質(zhì)子在空間上的分布情況和相對位置，以NOESY譜圖中給出的化學位移和NOE強度為NMR約束，利用CYANA程序進行了分子動力學計算。所有NOE中共有177個有意義的上限距離約束，包括84個殘基內(nèi)約束（Intraresidual）、 60個殘基間連接的約束（Sequential）和33個中等范圍的約束（Medium）。根據(jù)NMR約束，利用CYANA軟件，通過模擬退火方式對200個隨機初始結(jié)構(gòu)在扭轉(zhuǎn)角空間進行分子動力學計算。得到的結(jié)構(gòu)按目標函數(shù)值從小到大進行排列，然后用程序AMBER7對前20個具有最低目標函數(shù)值（平均值為0.0084 nm）的結(jié)構(gòu)（距離約束不超過0.02 nm，角度約束不超過5°）

進行能量最小化，求得平均能量為232.17 kcal/mol。圖4A顯示了15個最低能量分子的條帶結(jié)構(gòu)重疊， 從F4至K9定義了一個比較好的α-螺旋結(jié)構(gòu)。對于骨架原子，螺旋區(qū)結(jié)構(gòu)與平均結(jié)構(gòu)的均方根偏差為0.032 nm； 對于所有重原子，均方根偏差為0.13 nm。利用PROCHECK-NMR軟件進行Ramachandran分析后發(fā)現(xiàn)，結(jié)構(gòu)收斂較好的殘基中86.7%的骨架二面角落入了最有利區(qū)域（Most favored region），13.3%的骨架二面角落入了額外允許區(qū)域（Additionally allowed region）。MOLMOL計算結(jié)果表明，平均結(jié)構(gòu)（Mean structrue，20個結(jié)構(gòu)的平均）中殘基G3、E10、K11和L12未被包含到α-螺旋結(jié)構(gòu)中，但NOE連接預測這些殘基是螺旋結(jié)構(gòu)的延伸，CSI數(shù)據(jù)預測E10為螺旋結(jié)構(gòu)的延伸。從圖4B可見，K片段的螺旋結(jié)構(gòu)表現(xiàn)出類似兩親性的殘基分布，即疏水殘基F4、L5和I8在一側(cè)，極性殘基D6、K7和E10在另一側(cè)。這種兩親性α-螺旋分布特點將有利于K片段與膜發(fā)生相互作用。

3.2 與模擬膜的結(jié)合

之前的文獻已報道了LEA蛋白與膜之間的相互作用[19，20]。大豆LEA蛋白GmPM28和GmPM1被發(fā)現(xiàn)能夠有效地維持磷脂體系的穩(wěn)定性[19]。豌豆（Pisum sativum）線粒體LEA3蛋白（PsLEAm）能與線粒體膜發(fā)生相互作用，可能是通過形成螺旋構(gòu)象方式保護脂質(zhì)體[20]。本研究采用核磁的DOSY技術(shù)考察K片段與模擬膜的結(jié)合作用。DOSY技術(shù)可以測定溶液中分子的擴散系數(shù)（D），從而間接關(guān)聯(lián)分子的動力學半徑， 目前已被廣泛用于檢測分子的聚集、配體-受體相互作用等[21，22]。如圖5A所示，位于3.90、1.15和0.73 ppm處的SDS膠束（Mr=18803）譜峰和K片段（Mr=2051.53）譜峰（除SDS膠束和水峰外的所有信號峰）縱坐標相同，即擴散系數(shù)相同，表明K片段結(jié)合到了模擬膜SDS膠束上，形成穩(wěn)定的結(jié)合體。

進一步采用順磁性Mn2+作為探針離子，對K片段各殘基相對SDS膠束的位置進行探測，從而確定K片段與模擬膜的作用模式（即K片段在SDS膠束中的取向）。由于弛豫速率增加，靠近Mn2+的原子核的核磁信號強度降低，距離Mn2+越近，核磁信號越弱，甚至消失。因為Mn2+不能進入膠束的疏水核區(qū)域，所以通過比較核磁信號強弱可間接判斷對應殘基在溶劑中的暴露程度。本研究考察了K片段在含有0.07 mmol/L MnCl2的SDS膠束溶液的2D1H-1H TOCSY譜交叉峰變化。Mn2+存在下，TOCSY譜中各殘基Hα-HN交叉峰的相對強度如圖5B所示，螺旋區(qū)域（F4～K9）受Mn2+影響相對較小，尤其是殘基F4、L5和D6的信號強度只有小幅減弱，這說明螺旋區(qū)域插入到了SDS膠束當中，且以疏水面朝向膠束的疏水內(nèi)核、親水面朝向親水頭基層的方式存在。在C端區(qū)域（E10～K18），Mn2+的加入使得這些殘基的信號強度大幅降低，這表明結(jié)構(gòu)較為無序的C端處于靠近溶劑的SDS膠束表層。N端區(qū)域（K1～G3）在加入Mn2+后，信號降低幅度略小于C端區(qū)域，說明N端區(qū)域插入SDS膠束比C端深。K片段所有區(qū)域中沒有信號完全消失的殘基，說明K片段沒有徹底暴露在水中的殘基。擴散及順磁探針實驗結(jié)果表明，K片段具備與膜結(jié)合的能力，支持了它在脫水素保護作用中負責結(jié)合膜的說法。

4 結(jié) 論

盡管脫水素的膜保護功能及抗菌功能早已為人們所熟知，但對于其作用機理尚不清楚。本研究采用TOCSY和NOESY等核磁技術(shù)及分子動力學模擬從原子水平揭示了大米脫水素K片段在模擬膜SDS膠束溶液中的特定三維結(jié)構(gòu)，并通過擴散實驗、順磁探針實驗考察了K片段在SDS膠束中的取向。本研究結(jié)果表明，K片段可能通過形成兩親性α-螺旋結(jié)構(gòu)起到與細胞膜結(jié)合并進入細胞膜的作用。其中，疏水殘基F4、L5和I8形成螺旋結(jié)構(gòu)的疏水面，便于K片段穩(wěn)定存在于模擬膜中，這與近期研究發(fā)現(xiàn)疏水殘基對脫水素功能至關(guān)重要[23]相一致。以上結(jié)果為K片段與膜的生物作用機制研究提供了重要的結(jié)構(gòu)信息，也將為研究脫水素的膜保護功能及抗菌功能提供新的參考。

References

1 Sunderlikova V， Wilhelm E. Protoplasma， 2002， 220（1-2）： 97-103

2 Tunnacliffe A， Wise M J. Naturwissenschaften， 2007， 94（10）： 791-812

3 Reyes J L， Campos F， Wei H， Arora R， Yang Y I， Karlson D T， Covarrubias A A. Plant Cell Environ.， 2008， 31（12）： 1781-1790

4 Drira M， Saibi W， Brini F， Gargouri A， Masmoudi K， Hanin M. Mol. Biotechnol.， 2013， 54（2）： 643-650

5 Hughes S L， Schart V， Malcolmson J， Hogarth K A， Martynowicz D M， Tralman-Baker E， Patel S N， Graether S P. Plant Physiol.， 2013， 163（3）： 1376-1386

6 Zhai C， Lan J， Wang H， Li L， Cheng X， Liu G. Biochemistry（Moscow）， 2011， 76（6）： 645-650

7 Drira M， Saibi W， Amara I， Masmoudi K， Hanin M， Brini F. Appl. Biochem. Biotechnol.， 2015， 175（7）： 3310-3321

8 Yang W， Zhang L， Lv H， Li H， Zhang Y， Xu Y， Yu J. Front. Plant Sci.， 2015， 6： 406

9 Clarke M W， Boddington K F， Warnica J M， Atkinson J， McKenna S， Madge J， Barker C H， Graether S P. J. Biol. Chem.， 2015， 290（45）： 26900-26913

10 Koag M C， Wilkens S， Fenton R D， Resnik J， Vo E， Close T J. Plant Physiol.， 2009， 150（3）： 1503-1514

11 Huang X， Beullens M， Zhang J， Zhou Y， Nicolaescu E， Lesage B， Hu Q， Wu J， Bollen M， Shi Y. J. Biol. Chem.， 2009， 284（37）： 25375-25387

12 Hu Y， Zhang X， Shi Y， Zhou Y， Zhang W， Su X D， Xia B， Zhao J， Jin C. J. Biol. Chem.， 2011， 286（14）： 12381-12388

13 Feng Y， Yao H， Wang J. Proteins， 2010， 78（2）： 474-479

14 SHEN Xing-Can， LIANG Hong， HE Xi-Wen， WANG Xin-Sheng. Chinese J. Anal. Chem.， 2004， 32（3）： 388-394

沈星燦， 梁 宏， 何錫文， 王新省. 分析化學， 2004， 32（3）： 388-394

15 Tolleter D， Hincha D K， Macherel D. Biochim. Biophys. Acta， 2010， 1798（10）： 1926-1933

16 Welker S， Rudolph B，F(xiàn)renzel E， Hagn F， Liebisch G， Schmitz G， Scheuring J， Kerth A， Blume A， Weinkauf S， Haslbeck M， Kessler H. Buchner. Mol. Cell， 2010， 39（4）： 507-520

17 Petersen J， Eriksson S K，Harryson P， Pierog S， Colby T， Bartels D， Rhrig H. J. Exp. Bot.， 2012， 63（13）： 4919-4929

18 Wüthrich K. NMR of Proteins and Nucleic Acids John Wiley & Sons， New York， 1986

19 Shih M D， Hsieh T Y， Lin T P， Hsing Y I， Hoekstra F A. Plant Cell Physiol.， 2010， 51（3）： 395-407

20 Tolleter D， Jaquinod M， Mangavel C， Passirani C， Saulnier P， Manon S， Teyssier E， Payet N， Avelange-Macherel M H， Macherel D. Plant Cell， 2007， 19（5）： 1580-1589

21 LI Jian-Xin， HUA Jia， HE Cui-Cui， ZHAO Jian-Wei. Chinese J. Anal. Chem.， 2007， 35（7）： 988-992

李建新， 華 嘉， 何翠翠， 趙健偉. 分析化學， 2007， 35（7）：988-992

22 XUE Rong， ZOU Yong-Dong， ZHENG Yi-Zhi， WU Yi-Jie， LI Xiao-Jing， PEI Feng-Kui. Chinese J. Anal. Chem.， 2012， 40（4）： 563-568

薛 蓉， 鄒永東， 鄭易之， 吳亦潔， 李曉晶， 裴奉奎. 分析化學， 2012， 40（4）： 563-568

23 Hara M， Endo T， Kamiya K， Kameyama A. Plant Physiol.， 2017， 210： 18-23