宋寧慧 徐懷洲 吉貴祥 張圣虎 張芹 郭敏 石利利

摘 要 建立了超高效液相色譜-串聯(lián)四極桿復(fù)合線性離子阱質(zhì)譜（Ultra performance liquid chromatography-triple quadrupole-linear ion trap mass spectrometry， UPLC-QTRAP）技術(shù)結(jié)合QuEChERS（Quiek， Easy， Cheap， Effective， Rugged， and Safe）法檢測尿樣中毒死蜱代謝產(chǎn)物殘留的分析方法。采用乙腈提取，PSA和BCB凈化，ZORBAX Eclipse Plus C18色譜柱分離，以乙腈-0.2%氨水為流動相梯度洗脫，在電噴霧電離（ESI負(fù)離子模式下），使用觸發(fā)增強(qiáng)子離子掃描方式（MRM-IDA-EPI）對尿樣中毒死蜱的代謝產(chǎn)物進(jìn)行定性和定量分析。方法線性范圍為1.0～100.0 μg/L，檢出限0.10～0.73 μg/L。尿樣中3種毒死蜱代謝物的平均加標(biāo)回收率在80.3%～90.1%之間， RSD均小于5%。本方法操作簡單、靈敏度高、準(zhǔn)確性好、重現(xiàn)性強(qiáng)，利用QTRAP的質(zhì)譜優(yōu)勢可有效的對色譜峰進(jìn)行鑒定，有效預(yù)防樣品的假陽性。本方法已成功應(yīng)用于人體尿液實際樣品中，檢出的濃度范圍為ND～54.6 μg/L。本方法可為復(fù)雜基質(zhì)中化學(xué)品的識別和定量提供技術(shù)參考。

關(guān)鍵詞 毒死蜱； 代謝產(chǎn)物； 超高效液相色譜-串聯(lián)四極桿離子阱質(zhì)譜； 尿樣

1 引 言

毒死蜱（Chlorpyrifos），化學(xué)品名O，O-二乙基-O-（3，5，6-三氯-2-吡啶基）硫代磷酸，屬于有機(jī)磷類殺蟲劑。由于毒死蜱對哺乳動物急性毒性中等且在環(huán)境中的持久性較低，因此廣泛用于我國農(nóng)作物病蟲害和家庭衛(wèi)生害蟲的防治。然而，毒死蜱的大量使用也會引發(fā)人和動物產(chǎn)生多種毒性反應(yīng)[1，2]。

毒死蜱的急性暴露會導(dǎo)致神經(jīng)毒性的發(fā)生，抑制乙酰膽堿酯酶活性，使神經(jīng)纖維長期處于興奮狀態(tài)，正常的神經(jīng)傳導(dǎo)受阻，引發(fā)膽堿能綜合癥[2]。毒死蜱被人體吸收后，主要分布在肝臟、腎臟、脾臟等血流量較高的器官，經(jīng)脂酶分解成一系列代謝產(chǎn)物[3～5]，包括3，5，6-三氯-2-吡啶醇（3，5，6-Trichloro-2-pyridinol， TCP）、二乙基硫代磷酸酯（Diethyl thiophate， DETP）、二乙基磷酸酯（Diethyl phosphate， DEP），其結(jié)構(gòu)式見圖1。其中TCP是毒死蜱在人體中經(jīng)腎臟排泄的最主要的代謝產(chǎn)物，具有抑制人體乙酰膽堿酯酶活性的作用，因此，人尿液中TCP的濃度是人體毒死蜱生物負(fù)荷的一個特異性生物監(jiān)測指標(biāo)，可反映毒死蜱這種外源性污染物質(zhì)對人體產(chǎn)生的危害，如抑制人體紅細(xì)胞乙酰膽堿酯酶活性以及導(dǎo)致血色素濃度下降等[6～8]。TCP在代謝過程中很大程度被軛合[9]。因此，尿樣中含有烷基（含硫）磷酸酯和醇的碎片更具有化合物的特異性，并且測定DEP和DETP的濃度比例可以對有機(jī)磷農(nóng)藥代謝物的來源進(jìn)一步確證，可作為人體毒死蜱生物負(fù)荷的特異性生物監(jiān)測指標(biāo)。

隨著質(zhì)譜技術(shù)的發(fā)展，檢測尿液中毒死蜱代謝產(chǎn)物的分析方法主要有氣相色譜-質(zhì)譜法[10～12]和液相色譜-質(zhì)譜法[12～14]。氣相色譜法前處理時需要衍生化，過程較為繁瑣。高效液相色譜法前處理較為簡單[12]。但由于基質(zhì)的復(fù)雜性，即使使用串聯(lián)四極桿模式也難免造成假陽性或假陰性的誤判[15]。因此需要開發(fā)靈敏度更高和選擇性更優(yōu)的分析方法。

基于尿樣的基質(zhì)復(fù)雜性，本實驗在優(yōu)化樣品前處理方式的基礎(chǔ)上，采用UPLC-QTRAP的兩種采集模式，即傳統(tǒng)的多反應(yīng)監(jiān)測掃描（Multiple reaction monitoring， MRM）模式進(jìn)行定量檢測和線性離子阱的增強(qiáng)子離子掃描模式（Enhanced product ion scanning， EPI）獲得相應(yīng)的二級碎片圖進(jìn)行定性確證。當(dāng)使用數(shù)據(jù)依賴性獲取技術(shù)（Information dependent acquisition，IDA）時，可將兩種掃描模式相結(jié)合，即多反應(yīng)監(jiān)測-觸發(fā)增強(qiáng)子離子掃描模式（MRM-IDA-EPI），該種模式一次進(jìn)樣可以同時獲得高靈敏度MRM的定量數(shù)據(jù)和二級全掃描質(zhì)譜圖（EPI）進(jìn)行定性確認(rèn)。在不降低定性和定量分析性能的同時，既能實現(xiàn)準(zhǔn)確定量特定目標(biāo)化合物，又能在一次運行中高靈敏地定性鑒定化合物。使用本方法對尿樣中毒死蜱的代謝產(chǎn)物進(jìn)行定性和定量分析，簡便快速，并將定性和定量方法有機(jī)結(jié)合在一起，可以滿足復(fù)雜基質(zhì)中目標(biāo)物的準(zhǔn)確定性和定量分析要求。

2 實驗部分

2.1 儀器、試劑與材料

超高效液相色譜-串聯(lián)四極桿復(fù)合線性離子阱質(zhì)譜（UPLC-Agilent Technologies 1290 Infinity，MS-AB SCIEX QTRAP 4500，美國）； Milli-Q超純水機(jī)（德國Millipore公司）； 高速離心機(jī)（德國Eppendorf公司）。

毒死蜱代謝產(chǎn)物：硫代磷酸二乙酯（DETP）、磷酸二乙酯 （DEP）、三氯吡啶醇 （TCP）和內(nèi)標(biāo)磷酸二丁酯（Dibutyl phosphate，DBP）標(biāo)準(zhǔn)品（純度>95%，德國 Dr. Ehrenstorfer公司）。DETP、DEP、TCP和DBP標(biāo)準(zhǔn)品用乙腈配制得1000 mg/L的儲備液。β-葡萄糖苷酸酶（5.0×106～2.0×107 units/mg protein，美國Sigma Aldrich 公司）。乙腈（色譜純，德國Merck公司）； HCl（分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）。分散固相萃取填料（無水Na2SO4、PSA、GCB、NaCl，美國Agilent公司）； 人體尿液由居住在江蘇省某農(nóng)藥廠附近兒童（3～6歲）提供。

2.2 樣品前處理

冰凍尿樣于室溫下緩慢解凍，取10 mL于50 mL離心管中，加入4 mL HCl（6 mol/L）振蕩，于80℃水浴條件下水解2 h。取出后降至室溫。繼續(xù)在尿樣中加入10 mL乙腈溶液、3 g NaCl，渦旋1 min后，以8000 r/min離心分離，取上層5 mL乙腈，加入100 mg PSA、20 mg GCB、2 g無水Na2SO4，渦旋1 min后，濾紙過濾，收集濾液，旋蒸近干，N2吹干后，加1 mL乙腈，待LC-MS/MS測定。

2.3 色譜條件

ZORBAX Eclipse Plus C18色譜柱（150 mm×2.1 mm，3.5 μm）； 流動相：0.02%（V/V）氨水（A）和乙腈（B）； 線性梯度洗脫： 0～2 min，99% A； 3～6 min，70%～5% A； 6～8 min，5% A； 13～15 min，99% A。流速：0.3 mL/min； 柱溫：40℃； 進(jìn)樣體積：5 μL。

2.4 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源（ESI-）； 掃描模式：MRM-IDA-EPI； 離子源溫度：400℃； 離子噴霧電壓：5500 V； 氣簾氣壓力：0.207 MPa； 噴霧氣壓力：0.241 MPa； 輔助加熱氣壓力：0.276 MPa。EPI參數(shù)設(shè)置：探測掃描模式選擇負(fù)離子模式，碰撞能量CE： 10、25和40 eV； 掃描速度：4000 Da/s； 掃描閾值：1000 cps。其它參數(shù)見表1。

2.5 質(zhì)量控制與保證（QA/QC）

根據(jù)離子對豐度比和保留時間定性，目標(biāo)化合物通過與標(biāo)樣的保留時間（2%以內(nèi)）和選擇離子的豐度比與標(biāo)準(zhǔn)樣品豐度比（25%以內(nèi)）比較進(jìn)行定性確認(rèn)，并進(jìn)一步使用二級譜庫比對確證。采用內(nèi)標(biāo)法定量，選擇最高豐度或背景干擾最少的選擇離子進(jìn)行定量分析。每一組樣品中添加1 個基質(zhì)空白、1 個樣品重復(fù)和1 個基質(zhì)加標(biāo)回收進(jìn)行質(zhì)量控制。 方法空白樣品中目標(biāo)化合物含量均低于檢出限。

3 結(jié)果與討論

3.1 液相色譜和質(zhì)譜條件的優(yōu)化

本實驗考察了ZORBAX Eclipse Plus C18（150 mm ×2.1 mm，3.5 μm）、ZORBAX SB-CN（100 mm ×2.1 mm，3.5 μm）、ZORBAX HILIC Plus C18（100 mm ×2.1 mm， 3.5 μm）3種色譜柱。結(jié)果表明， 利用ZORBAX Eclipse Plus C18色譜柱（150 mm×2.1 mm，3.5 μm）可將4種目標(biāo)物完全分離， 且響應(yīng)較高； 其它色譜柱對4種物質(zhì)均不能有效分離， 因此，本實驗選用ZORBAX Eclipse Plus C18作為分離柱。在流動相的選擇中，根據(jù)目標(biāo)物分子結(jié)構(gòu)特征，堿性條件可以提高化合物[M-H]峰的離子響應(yīng)，因此采用乙腈-0.2%氨水作為流動相，通過梯度洗脫改變流動相的極性， 使混合物得到更好的分離。

根據(jù)毒死蜱代謝物及內(nèi)標(biāo)物的分子結(jié)構(gòu)特征，選擇電噴霧離子（ESI）源負(fù)離子模式掃描。采用半自動進(jìn)樣方式，以5 μL/min 的流速將100 μg/L 的標(biāo)準(zhǔn)儲備液分別注入離子源； 分別考察了ESI全掃描在正、負(fù)離子模式下待測物峰的響應(yīng)。結(jié)果表明，在負(fù)離子模式下，TCP、DEP、DETP及內(nèi)標(biāo)DBP的分子離子峰[M-H]分別是m/z 198、153、169和209。在較低的能量下分別對各個分子離子進(jìn)行二級質(zhì)譜掃描，確定目標(biāo)物的特征離子峰，具體參數(shù)見表1。TCP以m/z 198為母離子，其較穩(wěn)定的碎片離子只有m/z 35，且響應(yīng)較弱，因此選取m/z 198為定量離子，同時選擇TCP的脫氫峰m/z 196為定性離子。

在優(yōu)化的色譜和質(zhì)譜條件下，建立MRM-IDA-EPI掃描模式。質(zhì)譜分析選取對應(yīng)的母離子峰，對其子離子進(jìn)行二級質(zhì)譜分析，得到碎片離子信息； 并對目標(biāo)化合物二級質(zhì)譜的CE、DP、EP、CXP 等質(zhì)譜參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。在優(yōu)化的MRM參數(shù)基礎(chǔ)上建立IDA的方法。其方法原理見圖2，即樣品首先通過 Q1 掃描（Q1 Scan），獲取一級質(zhì)譜全掃描信息，在此基礎(chǔ)上通過閾值的設(shè)定，響應(yīng)高于閾值的質(zhì)譜峰將會被觸發(fā)（IDA），Q3 在離子阱（LIT）采集模式下，采用線性離子阱啟動增強(qiáng)子離子掃描模式（EPI），對其進(jìn)行二級碎片全掃采集，獲得相對應(yīng)的二級碎片圖。最終軟件通過母離子質(zhì)荷比、子離子掃描圖譜、同位素豐度比等信息，進(jìn)行未知色譜峰的結(jié)構(gòu)確認(rèn)。

3.2 尿液前處理過程優(yōu)化

3.2.1 酶解條件的優(yōu)化 尿液中毒死蜱代謝產(chǎn)物TCP以游離態(tài)和葡萄糖苷酸結(jié)合共軛態(tài)兩種形式存在，且部分代謝物的結(jié)合態(tài)所占比例較高，因此對樣品進(jìn)行去葡萄糖苷酸的酶解處理十分必要。根據(jù)文獻(xiàn)[16，17]，可以使用解離酶β-葡萄糖苷酸酶或酸解鹽酸化解除TCP的軛合態(tài)。本實驗分別采用兩種方式解除TCP的軛合態(tài)：添加50 Units β-葡萄糖苷酸酶，在37℃條件下解離120 min； 添加4 mL HCl（6 mol/L）振蕩，于80℃水浴條件下水解2 h。結(jié)果表明，使用葡萄糖苷酸酶會使DEP產(chǎn)生基質(zhì)干擾，同時基線干擾較為嚴(yán)重； 使用HCl處理，對DEP及其它代謝產(chǎn)物均未產(chǎn)生干擾（圖3），且酸解過程對目標(biāo)物分子均無破壞。同時，酸解可以降低實驗成本。因此，本實驗采用添加HCl（6 mol/L）解除TCP的結(jié)合態(tài)。

3.2.2 凈化條件優(yōu)化 尿液是含內(nèi)源性物質(zhì)較多的復(fù)雜基質(zhì)。本實驗采用QuEChERS法，將凈化劑直接分散于提取液中，盡可能多地吸附干擾基質(zhì)，將待檢測的目標(biāo)化合物保留在溶液中。選用凈化劑PSA和GCB，PSA對有機(jī)酸、色素、糖和脂肪酸等干擾物質(zhì)具有較強(qiáng)的吸附能力[18]； GCB主要用于去除色素，但對部分農(nóng)藥組分具有一定的保留[19]，其用量需在去除色素和保證回收率之間進(jìn)行優(yōu)化。由圖4可知，當(dāng)GCB添加量分別為5、10、20、30和40 μg時，各種農(nóng)藥的回收率在54.4%～91.4%之間； 隨著GCB用量增加，各種農(nóng)藥的回收率逐步降低，其中僅當(dāng)GCB的用量為20 μg時，毒死蜱各代謝產(chǎn)物的回收率在81.6%～88.2%之間， 基本符合殘留檢測的要求。

3.3 方法學(xué)確證

3.3.1 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線、方法靈敏度與重復(fù)性 本實驗采用內(nèi)標(biāo)法定量，分別配制1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、50.0和100.0 μg/L的3種毒死蜱代謝物基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液，以峰面積（y）對目標(biāo)物的質(zhì)量濃度（x）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，目標(biāo)物在1.0～100.0 μg/L范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系良好（R2>0.995），以信噪比S/N=3計算方法檢出限（LOD），S/N=10作為方法定量限（LOQ），同時對50 μg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液連續(xù)測定5天，每天測定5次，計算日內(nèi)和日間精密度。結(jié)果表明，毒死蜱各代謝產(chǎn)物的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液分析重現(xiàn)性良好，RSD<5%（表2）。

3.3.2 方法的回收率及精密度 吸取適量混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液到尿樣空白（低于檢出限），配制3個濃度水平（0.5、5.0 和10 μg/L）的待測樣品，每個濃度設(shè)置3個平行樣。尿樣中TCP、DEP和DETP 3種毒死蜱代謝物的平均加標(biāo)回收率分別在80.3%～84.7%、83.5%～90.0%和85.2%～90.1%之間（表3和圖5），RSD<10%，滿足農(nóng)藥殘留定量分析的需求。

3.3 實際樣品的定性與定量分析

3.3.1 定性分析 本實驗所選UPLC-QTRAP系統(tǒng)，三重四極桿與線性離子阱技術(shù)結(jié)合，使用MRM-IDA-EPI模式對尿樣中毒死蜱的代謝產(chǎn)物進(jìn)行定性分析，在此模式下，不僅可以通過MRM進(jìn)行高靈敏定量分析，得到定性確認(rèn)的二級全掃描質(zhì)譜圖（EPI圖），同時可利用EPI質(zhì)譜庫進(jìn)行檢索。原理如圖2所示。采集了某農(nóng)藥廠附近兒童的晨尿（30份），按照以上實驗方法處理樣品，并以實際樣品驗證所建立的方法。實際尿樣的檢測色譜圖見圖6，以TCP為例，將實際尿樣中檢測到的TCP和標(biāo)準(zhǔn)譜庫進(jìn)行對比，匹配度高達(dá)93.372%（表4），可作為TCP定性依據(jù)。

3.3.2 定量分析 采用內(nèi)標(biāo)法對毒死蜱的3種代謝產(chǎn)物定量分析（表5），結(jié)果表明，在80%以上兒童尿液中均檢出毒死蜱代謝產(chǎn)物， TCP最高檢出質(zhì)量濃度為54.6 μg/L。這一方面可能與農(nóng)藥廠周邊人群吸入含有毒死蜱的空氣有關(guān)； 另一方面也與人群飲食攝入有關(guān)。其中DEP與DETP的質(zhì)量濃度比例基本是1∶1，進(jìn)一步說明了檢出的有機(jī)磷類的代謝物來自毒死蜱[20]。

4 結(jié) 論

建立了QuEChERS-UPLC-QTRAP方法用于分析人體尿液中毒死蜱的代謝產(chǎn)物。結(jié)果表明，本方法操作簡單，靈敏度、準(zhǔn)確度、精密度均良好，且定性與定量分析準(zhǔn)確，并成功應(yīng)用于實際測定某農(nóng)藥廠附近居民尿液中毒死蜱代謝物的含量。本方法不僅可對游離態(tài)的DETP、DEP和TCP進(jìn)行定性和定量分析，而且可以用于分析TCP的總量（游離態(tài)和軛合態(tài)之和）。本方法為揭示毒死蜱在體內(nèi)的代謝方式和暴露途徑、科學(xué)評價毒死蜱暴露水平與其代謝物之間的關(guān)系提供了研究基礎(chǔ)。

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