王雯邈 董林 李文斌 鄒霜梅 呂寧

一、前言

Lynch 綜合征，舊稱遺傳性非息肉病性結(jié)直腸癌（hereditary nonpolyposis colorectal cancer，HNPCC），是一種常染色體顯性遺傳綜合征。正常人患結(jié)直腸癌的風(fēng)險(xiǎn)是5～6%，而Lynch綜合征人群則升高至70～80%，占所有大腸癌的2～3%［1］。此外，該綜合征同時(shí)增加了罹患胃、子宮內(nèi)膜和卵巢惡性腫瘤的風(fēng)險(xiǎn)，而泌尿系、肝膽道及胰腺惡性腫瘤風(fēng)險(xiǎn)則相對(duì)較低。因此，提高Lynch綜合征的篩檢率，進(jìn)而加強(qiáng)對(duì)該類人群的監(jiān)測(cè)和隨訪可有效降低結(jié)直腸癌的發(fā)病率及死亡率。

二、遺傳學(xué)基礎(chǔ)

Lynch綜合征是由于編碼錯(cuò)配修復(fù)基因（mismatch repair，MMR）的種系突變、失活導(dǎo)致的遺傳性疾?。?］?，F(xiàn)已闡明，人類MMR基因編碼的錯(cuò)配修復(fù)蛋白可相互作用形成一種多聚復(fù)合物，參與細(xì)胞錯(cuò)配修復(fù)反應(yīng)。錯(cuò)配修復(fù)反應(yīng)既可以修復(fù)DNA復(fù)制過(guò)程中出現(xiàn)的堿基錯(cuò)配，可以消除由于含簡(jiǎn)單重復(fù)序列的同源序列之間的遺傳重組出現(xiàn)的不配對(duì)堿基序列，這樣可有效防止DNA復(fù)制差錯(cuò)的發(fā)生，MMR系統(tǒng)在識(shí)別和修復(fù)DNA復(fù)制過(guò)程中出現(xiàn)的錯(cuò)配堿基，維持細(xì)胞DNA中微衛(wèi)星乃至整個(gè)基因組的穩(wěn)定方面發(fā)揮重要作用。MMR基因在人類多達(dá)12個(gè)，但目前已知與Lynch綜合征的發(fā)生明確有關(guān)的有4個(gè)，分別是MSH2，MLH1，MSH6 和 PMS2［2］。其中 70～85% 的 Lynch綜合征與MLH1或MSH2的突變有關(guān)，其產(chǎn)生的腫瘤大多為結(jié)直腸癌，而MSH6突變約占14%，其突變者中子宮內(nèi)膜癌的患病率明顯高于其他基因突變者［3-4］。

此外，作為錯(cuò)配修復(fù)系統(tǒng)的一部分，MLH3和Exo140與Lynch綜合征的相關(guān)性研究進(jìn)展仍然值得期待［5］。

微衛(wèi)星是由2～6個(gè)核苷酸組成的具有高度多態(tài)性的簡(jiǎn)單串聯(lián)重復(fù)序列，在不同個(gè)體間各不相同，而在同一個(gè)體的不同組織中保持一致。微衛(wèi)星廣泛分布于整個(gè)基因組序列中，常見(jiàn)的有核苷酸重復(fù)序列，尤以二核苷酸的重復(fù)序列最為常見(jiàn)。微衛(wèi)星不穩(wěn)定性（microsatellite instability，MSI）是指微衛(wèi)星序列中重復(fù)單位的增加或減少，是發(fā)生在核苷酸水平的不穩(wěn)定現(xiàn)象［1］。大量研究表明，MMR系統(tǒng)功能缺失可導(dǎo)致MSI顯著增加，從而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。Lynch綜合征的患者出生時(shí)已攜帶一個(gè)MMR等位基因突變（通常稱為雜合性突變），當(dāng)其另一個(gè)遺傳自健康親代等位基因受到點(diǎn)突變、雜合性缺失或甲基化等二次打擊時(shí)，可以引起錯(cuò)配修復(fù)系統(tǒng)的功能下降，從而使得復(fù)制錯(cuò)誤累積引起MSI，增加細(xì)胞自發(fā)突變的頻率，進(jìn)而促進(jìn)結(jié)直腸癌的發(fā)生。

大約有12～17%的結(jié)腸癌可檢測(cè)到微衛(wèi)星不穩(wěn)定（因檢測(cè)方式不同，比例有所異）［6］，其中約27.1%的微衛(wèi)星不穩(wěn)定是由MMR種系突變所致，即Lynch綜合征；而大部分具有微衛(wèi)星不穩(wěn)定的結(jié)腸癌則為散發(fā)的［7］。主要原因是在散發(fā)的結(jié)直腸癌中MLH1上游啟動(dòng)子甲基化引起MLH1基因沉默，MMR蛋白功能受損，進(jìn)而導(dǎo)致微衛(wèi)星不穩(wěn)定。

三、臨床病理特點(diǎn)

Lynch綜合征的患者具有以下臨床特點(diǎn)：（1）發(fā)病年齡早，對(duì)于MLH1和MSH2突變攜帶者，結(jié)直腸癌的中位發(fā)病年齡為45歲；（2）好發(fā)于右半結(jié)腸，約占70.9%；（3）第二原發(fā)結(jié)直腸癌的發(fā)病率高，其中同時(shí)性占18.1%，異時(shí)性約占24.2%，其發(fā)病率還與原發(fā)病灶手術(shù)切除范圍相關(guān)［8-9］。因此，提高Lynch綜合征的診斷率，加強(qiáng)高危人群的篩查尤為重要。

四、診斷流程及常用實(shí)驗(yàn)室方法

自從1991年HNPCC國(guó)際合作組織（HNPCCICG）制定了Amesterdam標(biāo)準(zhǔn)以來(lái)，Lynch綜合征的臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)歷經(jīng)數(shù)次變革。目前常用的臨床標(biāo)準(zhǔn)有Amesterdam II和改良的Bethesda指南［10］（圖1）用于在臨床中選擇進(jìn)行MSI檢測(cè)的患者。但二者均難以兼具敏感性及特異性：前者的特異性較高，敏感性低；后者反之。

圖1 改良版Bethesda標(biāo)準(zhǔn)

近期一項(xiàng)針對(duì)4項(xiàng)大型結(jié)直腸癌家系人群研究的數(shù)據(jù)分析顯示，廣泛的MMR篩查對(duì)于Lynch綜合征的診斷敏感性為100%，優(yōu)于Bethesda標(biāo)準(zhǔn)的87.8%的敏感性［7］。因此，利用分子遺傳學(xué)檢測(cè)在MMR基因中發(fā)現(xiàn)致病性胚系突變?nèi)詾槟壳癓ynch綜合征的診斷的金標(biāo)準(zhǔn)。NCCN指南已明確指出，對(duì)于發(fā)病年齡小于70歲的或雖大于70歲但滿足改良Bethesda標(biāo)準(zhǔn)的所有結(jié)直腸癌患者在術(shù)后選擇輔助化療前均需進(jìn)行Lynch綜合征的篩查，流程見(jiàn)圖2。

對(duì)于MSI的檢測(cè)可采用兩種途徑。一種是免疫組化的方法觀察4種MMR蛋白在細(xì)胞核和臨近腫瘤組織中的表達(dá)情況。若4個(gè)蛋白均表達(dá)，說(shuō)明該患者為錯(cuò)配修復(fù)功能完整（pMMR）；若其中任一陰性表達(dá)，則判斷為錯(cuò)配修復(fù)功能缺陷（dMMR）。另一種是通過(guò)PCR的方法擴(kuò)增微衛(wèi)星位點(diǎn)，常用檢測(cè)位點(diǎn)是美國(guó)NCI專家推薦的5個(gè)標(biāo)準(zhǔn)位點(diǎn)：BAT26、BAT25、D2S123、D5S346 和 D17S250。比較正常組織和腫瘤組織，如果兩個(gè)以上位點(diǎn)存在MSI則認(rèn)為該患者高度微衛(wèi)星不穩(wěn)定（MSI-H），即dMMR，小于2個(gè)位點(diǎn)MSI或無(wú)一位點(diǎn)存在MSI者被認(rèn)定為低度微衛(wèi)星不穩(wěn)定（MSI-L）或微衛(wèi)星穩(wěn)定（MSS），即pMMR。此方法之后又經(jīng)過(guò)不斷完善，目前認(rèn)為兩種方法是等效的，一致性高達(dá)97.8［11］。免疫組化的好處在于其結(jié)果可直接指導(dǎo)對(duì)應(yīng)基因的突變檢測(cè)，因?yàn)槟硞€(gè)蛋白的丟失往往意味著其基因水平的缺陷。

圖2 篩查流程

由于部分散發(fā)性結(jié)直腸癌可因MLH1啟動(dòng)子區(qū)域的甲基化而表現(xiàn)為MLH1表達(dá)缺失，且這部分患者常伴隨BRAF（通常為V600E）突變，而在Lynch綜合征的患者中則無(wú)此突變［12］。因此，在觀察到MLH1/PMS2表達(dá)缺失時(shí)，首先需完善BRAF V600E體細(xì)胞突變或MLH1啟動(dòng)子甲基化的檢測(cè)，以除外散發(fā)性結(jié)直腸癌。

長(zhǎng)久以來(lái)，BRAF突變的檢測(cè)主要依賴于測(cè)序的方法，包括Sanger 一代測(cè)序、焦磷酸鹽測(cè)序以及質(zhì)譜分析等方法。Capper D等［13］于2011年報(bào)道了一個(gè)可用免疫組化手段檢測(cè)的BRAF V600E突變情況新型特異性抗體VE1，但在結(jié)直腸癌的檢測(cè)中，該抗體一度因與Sanger等其他基因檢測(cè)結(jié)果的一致性較低而備受爭(zhēng)議。目前學(xué)界普遍認(rèn)為，造成IHC在結(jié)直腸癌中檢測(cè)的準(zhǔn)確率低下的主要原因之一在于研究者過(guò)于寬松的陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)把BRAF IHC染色中——強(qiáng)陽(yáng)定義為陽(yáng)性結(jié)果時(shí)，VE1抗體的敏感性和特異性分別為85%和68%。若將任何強(qiáng)度的染色陽(yáng)性定義為陽(yáng)性結(jié)果，則特異性會(huì)降至51%，而敏感性卻沒(méi)有提升。因此建議僅將VE1抗體染色強(qiáng)陽(yáng)性的標(biāo)本定義為陽(yáng)性病例［14］。Vakiani E等對(duì)117例結(jié)直腸癌標(biāo)本的BRAF V600E突變情況進(jìn)行了檢測(cè)，研究將＞80%的腫瘤細(xì)胞染色彌漫陽(yáng)性定義為IHC陽(yáng)性病例，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，IHC方法與測(cè)序一致性較高，敏感性93.7%，特異性95.6%［15］。高度提示應(yīng)用IHC的方法對(duì)Lynch綜合征進(jìn)行篩選，除外MLH1啟動(dòng)子甲基化的散發(fā)性患者的可行性。

根據(jù)最新的篩查指南，MLH1表達(dá)缺失的患者除BRAF V600E突變檢測(cè)外，可選擇性進(jìn)行MLH1啟動(dòng)子區(qū)域的甲基化的檢測(cè)。目前應(yīng)用較多的是第二代甲基化特異性的PCR 法（methylation-specific PCR，MS-PCR）和特異性甲基化多重連接依賴的探針擴(kuò)增（methylation specific-multiplex probe amplification，MS-MLPA）。二者優(yōu)點(diǎn)在于所需DNA總量較小，適用于微切割的石蠟組織，臨床應(yīng)用較多；而甲基熒光技術(shù)Methy Light盡管是甲基化檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn)，但所需技術(shù)水平較高。Pérez-Carbonell L等利用上述兩平臺(tái)對(duì)73例MLH-1表達(dá)缺失的結(jié)腸癌的MLH1甲基化水平進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)二者的一致性達(dá)92%，可分別使67%和64%的患者免于進(jìn)行MLH1胚系突變檢測(cè)［16］。只有對(duì)BRAF V600E突變和（或）MLH1啟動(dòng)子甲基化檢測(cè)陰性的MLH1失表達(dá)的結(jié)直腸癌患者，考慮Lynch綜合征可能性大。此時(shí)需進(jìn)行最終的胚系突變檢測(cè)。既往對(duì)于MSH2、MSH6或PMS2表達(dá)缺失者，可直接進(jìn)行相關(guān)基因的胚系突變檢測(cè)以確診Lynch綜合征。近年研究發(fā)現(xiàn)，位于2號(hào)染色體臨近MSH2的EPCAM基因（又稱TACSTD 1）的3`區(qū)域的常見(jiàn)缺失，可引起MSH2基因體細(xì)胞高甲基化，而繼發(fā)于EPCAM基因突變的腫瘤表現(xiàn)為MSH2和（或）MSH6的表達(dá)缺失，但胚系突變檢測(cè)陰性，提示EPCAM基因的胚系突變是除4個(gè)已知MMR基因外造成Lynch綜合征的重要原因［17］。據(jù)估計(jì)，高達(dá)30% MSH2免疫組化檢測(cè)陰性的結(jié)直腸癌存在EPCAM基因的胚系突變。而這部分患者占全部Lynch綜合征的6%［18］。因此，目前推薦對(duì)于MSH2/MSH6免疫組化陰性的患者首先進(jìn)行MSH2基因的胚系突變檢測(cè)，陰性者再依次進(jìn)行EPCAM及MSH6的突變檢測(cè)。

目前常用的有1、2代測(cè)序兩種方法，相比于Sanger一代測(cè)序技術(shù)，二代測(cè)序（next generation sequencing，NGS）采用不同顏色的熒光標(biāo)記四種不同的dNTP，當(dāng)DNA聚合酶合成互補(bǔ)鏈時(shí)，每添加一種dNTP就會(huì)釋放出不同的熒光，根據(jù)捕捉的熒光信號(hào)并經(jīng)過(guò)特定的計(jì)算機(jī)軟件處理，從而獲得待測(cè)DNA的序列信息。與一代相比，二代測(cè)序方法更加高效、便捷，而且大大降低了成本，成為目前主要檢測(cè)手段。但由于其讀長(zhǎng)相對(duì)較低的局限性，尚無(wú)法撼動(dòng)Sanger一代測(cè)序的金標(biāo)準(zhǔn)地位。由于大片段缺失和重排占已知突變的20%，因此，對(duì)于MMR相關(guān)的胚系突變檢測(cè)需包括DNA測(cè)序及大片段缺失和重排的檢測(cè)［19］。而多重連接依賴的探針擴(kuò)增（multiplex ligation-dependent probe amplification，MLPA）方法是國(guó)際上通用的檢測(cè)大片段缺失的方法，因此，對(duì)于NGS檢測(cè)陰性者，需進(jìn)行MLPA檢測(cè)。

二代測(cè)序結(jié)果發(fā)現(xiàn)突變的患者，我們利用LOVD 數(shù) 據(jù) 庫(kù)（http：//chromium.lovd.nl/LOVD2/colon_cancer/variants.php）和NCBI Clinvar數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar/）進(jìn)行基因突變致病性判讀。判讀結(jié)果分為5類：致病突變、疑似致病突變、臨床意義未明突變、疑似非致病突變、非致病突變。對(duì)于陽(yáng)性結(jié)果需進(jìn)一步采用Sanger測(cè)序進(jìn)行驗(yàn)證。但是目前參考的數(shù)據(jù)來(lái)源大多為歐美人種的研究結(jié)果，而越來(lái)越多的研究顯示中國(guó)Lynch綜合征的人群在發(fā)病特點(diǎn)和突變基因的分布上與歐美人種存在差異。國(guó)外研究一致顯示子宮內(nèi)膜癌是發(fā)病率最高的腸外腫瘤，累計(jì)終身患病風(fēng)險(xiǎn)在15～71%［20］，而國(guó)內(nèi)以胃癌最為常見(jiàn)，且不斷有基于中國(guó)人群的研究發(fā)現(xiàn)新的MLH1、MSH2、MSH6突變位點(diǎn)［21］。以上均提示Lynch綜合征作為一種遺傳性疾病，其致病基因譜在人種間的差異，進(jìn)一步說(shuō)明在國(guó)內(nèi)積極開(kāi)展Lynch綜合征的篩查，建立中國(guó)人群Lynch綜合征相關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)的必要性。

五、累計(jì)風(fēng)險(xiǎn)及長(zhǎng)期隨訪

經(jīng)過(guò)上述檢測(cè)確診Lynch綜合征的患者，意味著終身患癌風(fēng)險(xiǎn)的顯著增加。目前對(duì)于藥物降低腫瘤風(fēng)險(xiǎn)的證據(jù)不足。僅CAPP-2一項(xiàng)隨機(jī)對(duì)照研究顯示，相比于安慰劑對(duì)照組，長(zhǎng)于兩年每日口服600 mg 阿司匹林的患者結(jié)直腸癌及Lynch相關(guān)腫瘤的發(fā)生率降低且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義［22］。但長(zhǎng)期高劑量的阿司匹林的副作用堪憂，目前尚不作為常規(guī)推薦應(yīng)用。而一項(xiàng)前瞻性的研究顯示，嚴(yán)格的隨訪和監(jiān)測(cè)可顯著降低結(jié)直腸癌的發(fā)病率和死亡率［23］。因此，2015年的NCCN/ASCO/ESMO等Lynch綜合征的相關(guān)指南均建議對(duì)于MLH1/MSH2/EPCAM突變的患者，自20～25歲開(kāi)始每1～2年進(jìn)行結(jié)腸鏡檢查，若家族中先證者于25歲前發(fā)病，則隨診時(shí)間提前至發(fā)病年齡前的2～5年開(kāi)始。不同于MLH1突變者早發(fā)、高發(fā)結(jié)直腸癌的特點(diǎn)，MSH6突變的患者子宮內(nèi)膜癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)更高；而PMS2突變的患者，結(jié)直腸癌及子宮內(nèi)膜癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)均相對(duì)較低。因此，NCCN指南建議對(duì)這部分患者的結(jié)腸鏡檢查可開(kāi)始于25～30歲，若先證者發(fā)病年齡早于30歲，則于發(fā)病年齡前2～5年開(kāi)始結(jié)腸鏡篩查，每1～2年一次。鑒于Lynch綜合征的患者同時(shí)增加了罹患腸外腫瘤的風(fēng)險(xiǎn)（中樞神經(jīng)系統(tǒng)1.2%～3.7%，胰腺4%）［24］，對(duì)于該部分患者的篩查還需包括腸外器官的監(jiān)測(cè)和隨訪。目前NCCN明確推薦，對(duì)于已生育女性，選擇性口服避孕藥或預(yù)防性雙側(cè)輸卵管切除以預(yù)防子宮內(nèi)膜癌及卵巢癌的風(fēng)險(xiǎn)；同時(shí)明確非功能性子宮出血需及時(shí)檢查。但尚無(wú)證據(jù)顯示定期的B超、CA125檢測(cè)及子功內(nèi)膜活檢有助于降低子宮內(nèi)膜癌及卵巢癌的風(fēng)險(xiǎn)，僅作為臨床醫(yī)生選擇性應(yīng)用。此外，指南還建議自25～30歲開(kāi)始，考慮每年行尿常規(guī)檢查以降低尿路上皮癌的發(fā)生。而對(duì)于胃、小腸、胰腺、乳腺以及中樞神經(jīng)系統(tǒng)，盡管有研究顯示上述器官的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)有所增加，但尚無(wú)明確的證據(jù)顯示定期的監(jiān)測(cè)隨訪有助于發(fā)病率的降低［25］。

綜上，Lynch綜合征作為結(jié)直腸癌中最常見(jiàn)的一類遺傳性腫瘤綜合征，發(fā)病率相對(duì)較高，且具有發(fā)病年齡早、易發(fā)生腸外及第二腫瘤的特點(diǎn)?，F(xiàn)有的臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)難以兼具敏感性及特異性。因此，臨床中對(duì)于結(jié)直腸癌患者應(yīng)積極選取以分子病理及遺傳基因?yàn)榛A(chǔ)的檢測(cè)手段，對(duì)Lynch綜合征的患者及其家系進(jìn)行篩查，并對(duì)陽(yáng)性患者進(jìn)行科學(xué)的監(jiān)測(cè)、隨訪以降低該病的發(fā)病率及死亡率。

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