SD大鼠死后心血中大腸桿菌DNA含量與早期死亡時(shí)間相關(guān)性的研究

安志遠(yuǎn)，趙攀峰，李 聃，周懷谷，郭育林

（1.上海公安學(xué)院，上海200137；2.上海市公安局物證鑒定中心 法醫(yī)物證學(xué)現(xiàn)場(chǎng)應(yīng)用技術(shù)公安部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室上海市現(xiàn)場(chǎng)物證重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海200083；3.無(wú)錫中德美聯(lián)生物技術(shù)有限公司，江蘇 無(wú)錫214174）

死亡時(shí)間（postmortem interval， PMI）的推斷一直是法醫(yī)學(xué)工作實(shí)踐和科研攻關(guān)的一項(xiàng)重、難點(diǎn)課題。以往的PMI推斷研究主要聚焦于個(gè)體死后尸體現(xiàn)象和尸體內(nèi)源性物質(zhì)變化規(guī)律，近年來(lái)微生物在尸體腐敗過(guò)程中的作用成為了一項(xiàng)研究熱點(diǎn)。大腸桿菌（Escherichia coli，E.coli）是人和動(dòng)物腸道中的正常棲居菌，嬰兒出生后即隨哺乳進(jìn)入腸道，與人終身相伴。在個(gè)體死后，大腸桿菌屬于具有較強(qiáng)分解蛋白質(zhì)能力的腐敗菌種，且由于其周身鞭毛能運(yùn)動(dòng)，最易出現(xiàn)細(xì)菌移位（bacterial translocation， BT）[1-3]。故本實(shí)驗(yàn)對(duì)SD大鼠心血中大腸桿菌LacZ基因含量的檢測(cè)方法及其隨PMI變化的規(guī)律進(jìn)行了一系列初步研究，探討利用心血中LacZ基因含量推斷PMI的可行性。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

EZ1 DNA Investigator Kit（美國(guó) Promega 公司）；Taq DNA 聚合酶（5U/μl，Takara），10×BufferMg2+plus，dNTPs（2.5mM），pMD18-T vector Cloning Kit（寶生物工程（大連）有限公司）引物和Taqman探針（生工生物工程（上海）股份有限公司）；熒光定量PCR儀為ABIPISM-7900HT擴(kuò)增系統(tǒng)；分光光度計(jì)（Thermo Scientific NanoDrop 2000c）；EZ1 Advanced XL（美國(guó)Promega公司）。

1.2 方法

1.2.1 大鼠心血DNA樣本采集

18只健康SD大鼠，雌雄不限，體重180～200 g。控制室內(nèi)環(huán)境溫度25℃，適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d頸椎脫位法處死，按PMI隨機(jī)分成9組，每組2只，其中1組對(duì)照組（死后 0 h），8 組實(shí)驗(yàn)組（PMI分別為：12、24、36、48、60、72、84、96 h），置于密閉室內(nèi)，分別在各時(shí)間點(diǎn)取心血100μL，然后應(yīng)用EZ1 Advanced XL按照EZ1 DNA Investigator Kit說(shuō)明書進(jìn)行操作提取心血DNA，最終每組得到DNA洗脫液100μL，-20℃冰凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 菌種獲取

E.coliDH-5α（無(wú)錫中德美聯(lián)生物技術(shù)有限公司）。

1.2.3 引物及探針

在NCBI上獲取已有E.coli的 β-D-半乳糖苷酶合成基因LacZ的序列，選擇較保守的一段序列構(gòu)建探針及引物體系（表1），設(shè)計(jì)應(yīng)滿足以下幾個(gè)條件：（1）引物 Tm 值 58～60 ℃；（2）探針 Tm 值 68～70℃；（3）G+C 在 30%～80%之間；（4）引物和探針沒(méi)有連續(xù)3個(gè)以上的堿基G；（5）探針5’端第1個(gè)堿基不是 G；（6）探針序列中 C 大于 G；（7）擴(kuò)增片斷在50～150 bp之間。

表1 大腸桿菌LacZ基因熒光定量PCR引物和探針序列

1.2.4 標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒的制備

選取E.coli的 β-D-半乳糖苷酶合成基因LacZ上大片段克隆引物（LacZ-DF1和LacZ-DR1）（表2），對(duì)模板大腸桿菌D-H-5α進(jìn)行直接擴(kuò)增獲得PCR產(chǎn)物，經(jīng)過(guò)連接、轉(zhuǎn)化，篩選出所需菌種，并進(jìn)行測(cè)序比對(duì)驗(yàn)證，證實(shí)重組質(zhì)粒與設(shè)計(jì)片段的目標(biāo)序列完全一致，符合設(shè)計(jì)要求。

表2 大片段克隆引物的寡核苷酸序列

1.2.5質(zhì)粒濃度測(cè)定

將重組質(zhì)粒提取物以去離子水稀釋，于紫外分光光度計(jì)上進(jìn)行定量，測(cè)定其在260nm與280nm的A值，判斷其純度（A260/A280＞1.8為純品）。 取1μL提取質(zhì)粒，加入 Nano Drop（Thermo）上，測(cè)定三次，然后得出質(zhì)粒濃度（表3）。

1.2.6 線性標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

以提取的LacZ基因克隆轉(zhuǎn)化菌質(zhì)粒DNA為模板標(biāo)準(zhǔn)，將其10倍梯度稀釋形成濃度為3.747、0.3747、37.47、3.747、0.3747、0.03747 pg/μL，取各稀釋梯度模板1μL進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系20μL，均為三個(gè)復(fù)孔，在PCR過(guò)程中由實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀自動(dòng)繪制線性標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖1）。

圖1 擴(kuò)增曲線圖

以克隆質(zhì)粒模板濃度的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，以Ct值為縱坐標(biāo)建立LacZ熒光定量PCR檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖2）。曲線回歸得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：Ct=-3.41lgX+25.46（直線斜率 A=-3.41，截距 B=25.46，X 為模板濃度，單位 pg/μL），曲線相關(guān)系數(shù)r=0.9985，說(shuō)明標(biāo)準(zhǔn)曲線線性較好。根據(jù)A=-1/log（1+E）（E為熒光定量PCR反應(yīng)的擴(kuò)增效率），得熒光定量PCR擴(kuò)增效率為96.34%，符合熒光定量PCR對(duì)擴(kuò)增效率的要求。

圖2 標(biāo)準(zhǔn)曲線線性擬合圖

1.2.7 qPCR擴(kuò)增體系及程序

用 2×Mastermix10μL、10μM YF1 1μL、10μM YR1 1μL、10μM Taqman 0.4μL、模板 1μL和ddH2O 6.6μL配置成20μL的擴(kuò)增體系。

設(shè)置擴(kuò)增程序：（1）50℃，持續(xù) 2min；（2）95℃，持續(xù) 10min；（3）95℃，持續(xù) 15 s；（4）60℃，持續(xù) 1min；（5）（2）～（4）步驟 40 個(gè)循環(huán)。

2 結(jié)果

2.1 SD大鼠尸體變化

SD大鼠處死后18 h，有輕微異味產(chǎn)生。死后72 h，尸體腹部出現(xiàn)腫脹，口腔開(kāi)始有腐敗液體流出，臭味明顯，尸體表面可見(jiàn)脫毛現(xiàn)象，腹部有尸綠形成。死后96 h，尸體皮膚下有腐敗靜脈網(wǎng)形成。

2.2 SD大鼠心血DNA樣本的濃度測(cè)定

用分光光度法分別測(cè)量不同PMI下SD大鼠心血樣本DNA濃度，取1μLDNA樣品，加入Nano Drop（Thermo）上，檢測(cè)每組樣本 DNA濃度，取平均值（表 4）。

表3 質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品濃度測(cè)定

表4 SD大鼠死后96 h內(nèi)心血樣本DNA濃度測(cè)定

對(duì)上述樣本的檢測(cè)濃度繪成線性趨勢(shì)圖，檢測(cè)結(jié)果顯示在SD大鼠死后96 h時(shí)間段內(nèi)，死后12 h DNA濃度開(kāi)始增高，死后60h增速加快，至死后96h達(dá)到高峰。對(duì)SD大鼠死后96 h心血DNA濃度變化值經(jīng)過(guò)EXCEL軟件相關(guān)分析，得出回歸方程式：y=1.0233x+31.647，PMI與DNA濃度的決定系數(shù)R2=0.9345，表明DNA濃度隨著PMI的延長(zhǎng)而呈增加趨勢(shì)，兩者之間存在著較強(qiáng)的正相關(guān)（圖3）。

圖3 SD大鼠死后96 h內(nèi)心血樣本DNA濃度變化趨勢(shì)圖

2.3 SD大鼠心血DNA樣本qPCR

對(duì)PMI為0～48 h的5個(gè)時(shí)間點(diǎn)SD大鼠心血樣本進(jìn)行檢測(cè)。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線定量結(jié)果，幾乎均無(wú)擴(kuò)增，類似陰性，初步得出，PMI為0～48 h，擴(kuò)增 Ct值均在35以后，說(shuō)明SD大鼠心血中未有LacZ基因的存在（圖4）。

圖4 PMI為0～48h SD大鼠心血樣本LacZ基因檢測(cè)圖譜

對(duì)PMI為60～96 h的4個(gè)時(shí)間點(diǎn)SD大鼠心血樣本進(jìn)行檢測(cè)，同批次擴(kuò)增標(biāo)準(zhǔn)品，制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線定量結(jié)果，發(fā)現(xiàn)各時(shí)間點(diǎn)的樣本均有擴(kuò)增產(chǎn)物出現(xiàn)（圖 5～6）。

圖5 標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒擴(kuò)增圖譜

圖6 PMI為60～96h SD大鼠心血樣本LacZ基因檢測(cè)圖譜

以標(biāo)準(zhǔn)品濃度梯度稀釋的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，以Ct值為縱坐標(biāo)建立LacZ熒光定量PCR檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖7）。曲線回歸得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：Ct=-3.65lgX+27.04（直線斜率 A=-3.65，截距 B=27.04，X 為模板濃度，單位 pg/μL），曲線相關(guān)系數(shù)r=0.9822，說(shuō)明標(biāo)準(zhǔn)曲線線性較好。根據(jù)A=-1/log（1+E）（E為熒光定量PCR反應(yīng)的擴(kuò)增效率），得該次熒光定量PCR擴(kuò)增效率為88%，符合熒光定量PCR對(duì)擴(kuò)增效率的要求。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，可計(jì)算出實(shí)際樣本中LacZ基因的濃度，圖中標(biāo)“×”為實(shí)際樣本擴(kuò)增在標(biāo)準(zhǔn)曲線線性擬合圖中的位置。

圖7 標(biāo)準(zhǔn)曲線線性擬合圖（標(biāo)×位置為實(shí)際樣本）

按照上述標(biāo)準(zhǔn)曲線，對(duì)60～96 h的4個(gè)時(shí)間點(diǎn)心血樣本檢測(cè)，每組樣本基因濃度取平均值（表5）。

表5 SD大鼠死后60～96 h心血樣本中LacZ基因濃度

對(duì)上述定量檢測(cè)樣本中LacZ基因的趨勢(shì)圖（圖8）檢測(cè)結(jié)果顯示在SD大鼠死后60 h LacZ基因濃度開(kāi)始增加，隨著PMI的延長(zhǎng)呈指數(shù)式增長(zhǎng)，至死后96 h達(dá)到高峰。對(duì)SD大鼠死后60～96 h心血DNA樣品檢測(cè)LacZ基因濃度變化值經(jīng)EXCEL軟件相關(guān)分析，得出回歸方程式：y=3E-06e0.1567x，PMI與DNA濃度的決定系數(shù)R2=為0.9569，表明DNA濃度隨著PMI的延長(zhǎng)而呈增加趨勢(shì)，兩者之間存在著較強(qiáng)的正相關(guān)。

圖8 SD大鼠死后60～96 h心血DNA樣本中LacZ基因濃度變化趨勢(shì)圖

3 討論

個(gè)體死亡后，抑制微生物生長(zhǎng)的平衡被打破，腐敗菌開(kāi)始大量繁殖，并在尸體腐敗的進(jìn)程中起主導(dǎo)作用。2009年劉茜[4]利用生物發(fā)光法檢測(cè)大鼠死后不同時(shí)間點(diǎn)尸體組織中微生物ATP含量，初步證實(shí)在大鼠尸體上腐敗菌存在著量的變化性規(guī)律。但是ATP檢測(cè)只能反映存活狀態(tài)細(xì)菌的數(shù)量，不能反應(yīng)出死亡細(xì)菌的數(shù)量，而且其在死后早期易受個(gè)體本身ATP的干擾。2014年謝丹[5]通過(guò)檢測(cè)尸體不同部位的腐敗菌多樣性的演替規(guī)律，發(fā)現(xiàn)利用優(yōu)勢(shì)菌群的演替變化可用于推斷PMI，但是該研究只是對(duì)優(yōu)勢(shì)菌群的種屬做了定性鑒別，而沒(méi)有相關(guān)的定量研究，因此推斷的PMI只能是大概的一個(gè)時(shí)間段，精確性不高且需檢測(cè)的指標(biāo)偏多。

筆者認(rèn)為，在尸體腐敗降解過(guò)程中，無(wú)疑存在著腐敗菌數(shù)量的變化，通過(guò)檢測(cè)腐敗菌DNA含量更能準(zhǔn)確反映出腐敗菌的變化情況，而目前國(guó)內(nèi)外學(xué)者應(yīng)用qPCR技術(shù)定量檢測(cè)大腸桿菌的研究主要集中在疾病診斷治療和食品衛(wèi)生安全等方面[6-8]，本研究將檢測(cè)大腸桿菌DNA含量的技術(shù)應(yīng)用到法醫(yī)學(xué)PMI推斷中來(lái)，在國(guó)內(nèi)外研究中罕見(jiàn)報(bào)道。

本研究成功的用紫外分光光度計(jì)分別檢測(cè)了SD大鼠死后0～96 h的心血DNA樣本濃度，結(jié)果顯示隨著PMI的延長(zhǎng)，樣本DNA濃度呈現(xiàn)線性增長(zhǎng)的趨勢(shì)，與PMI呈顯著正相關(guān)，這可能與個(gè)體死后水分流失有關(guān)，心血管內(nèi)血液中的水分等細(xì)小分子受重力的影響向外向下滲透，致使血液發(fā)生濃縮，血樣本的DNA濃度隨著升高，因此個(gè)體死后在一定的時(shí)間范圍內(nèi)檢測(cè)心血總DNA濃度可用于推斷PMI。

細(xì)菌的生長(zhǎng)繁殖分為4個(gè)時(shí)期：遲緩期（又叫調(diào)整期）、對(duì)數(shù)期（又稱指數(shù)期）、穩(wěn)定期和衰亡期。本研究在SD大鼠死后0～48 h的心血DNA中，均未檢測(cè)到LacZ基因的擴(kuò)增，可能的結(jié)果有兩個(gè)：（1）心血中沒(méi)有大腸桿菌繁殖，自然不會(huì)出現(xiàn)LacZ基因擴(kuò)增；（2）心血中有大腸桿菌，只是處于遲緩期，基因濃度很低，本研究RT-PCR的基因濃度檢測(cè)限是≥0.003747pg/μL，而 NTC 的濃度是 0.02pg/μL，可能的原因是擴(kuò)增試劑本身（如Taq酶來(lái)源于大腸桿菌，而目前的提取技術(shù)不可能達(dá)到完全純化[9]）存在少量大腸桿菌基因組的污染而帶來(lái)假陽(yáng)性的結(jié)果，為此本研究人為將基因含量檢測(cè)限提高到是≥0.03747 pg/μL，使所測(cè)Ct值與NTC沒(méi)有重疊，不過(guò)這樣也可能造成了一定幾率的假陰性結(jié)果產(chǎn)生，導(dǎo)致遲緩期基因擴(kuò)增結(jié)果不明顯。

本研究成功建立了檢測(cè)大腸桿菌LacZ基因含量的qPCR方法，結(jié)果顯示SD大鼠死后60～96 h心血中大腸桿菌DNA含量與PMI呈顯著正相關(guān)，LacZ基因濃度呈指數(shù)式增長(zhǎng)，這與細(xì)菌的二分裂繁殖方式有關(guān)，符合細(xì)菌的生長(zhǎng)曲線規(guī)律中對(duì)數(shù)期（又稱指數(shù)期）的特征。值得一提的是，本實(shí)驗(yàn)測(cè)定大腸桿菌LacZ基因含量是不區(qū)分細(xì)菌死活狀態(tài)的，無(wú)論死亡細(xì)菌或存活細(xì)菌均能檢測(cè)到LacZ基因，這點(diǎn)不同于一般的根據(jù)存活細(xì)菌數(shù)量繪制的細(xì)菌生長(zhǎng)曲線規(guī)律，因此死后96 h以后能否出現(xiàn)細(xì)菌生長(zhǎng)的穩(wěn)定期和衰亡期特征還值得進(jìn)一步的研究。由于本實(shí)驗(yàn)對(duì)象SD大鼠的心血存量受限，超過(guò)96h的心血難以提取到，故筆者認(rèn)為為了更好地驗(yàn)證本研究的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值，有必要進(jìn)一步研究不同死亡時(shí)間點(diǎn)上的人類尸體與SD大鼠尸體的異同點(diǎn)，并根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)心血存量結(jié)果，適當(dāng)延長(zhǎng)樣本檢測(cè)PMI時(shí)間點(diǎn)，以更大地發(fā)揮大腸桿菌LacZ基因含量推斷PMI的作用。

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