咪唑類(lèi)物質(zhì)KK-42對(duì)日本沼蝦免疫功能的影響

王文鋒，關(guān)建義，寧黔冀

( 1.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院 生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453003； 2.河南師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453003 )

日本沼蝦(Macrobrachiumnipponense)又名青蝦、河蝦，主要生活在江河、湖泊及池塘等淡水水域中，為我國(guó)重要的淡水養(yǎng)殖品種之一。但隨著養(yǎng)殖面積的擴(kuò)大化，環(huán)境污染和病害問(wèn)題也日趨嚴(yán)重，導(dǎo)致青蝦病害蔓延、產(chǎn)量降低[1]。其中，嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)是淡水養(yǎng)殖水體中一種重要的條件致病菌，當(dāng)環(huán)境條件惡化時(shí)，養(yǎng)殖動(dòng)物免疫機(jī)能隨之下降，可能會(huì)引起疾病的爆發(fā)。因此，如何提高蝦的抗病能力及免疫力以達(dá)到健康養(yǎng)殖，逐漸受到人們的重視。

日本沼蝦等甲殼動(dòng)物缺乏真正的抗體，其主要依靠非特異性免疫方式實(shí)現(xiàn)其免疫[2]，如體液免疫和細(xì)胞免疫。在機(jī)體內(nèi)，諸多免疫因子參與了機(jī)體的免疫反應(yīng)(抗菌肽、溶菌酶、血藍(lán)蛋白和超氧化物歧化酶等)[2-4]。研究表明，當(dāng)甲殼動(dòng)物受到外界病原等刺激時(shí)，則會(huì)引起呼吸爆發(fā)以及其他多種的免疫反應(yīng)，這些反應(yīng)均會(huì)引起大量活性氧的產(chǎn)生。但由于活性氧反應(yīng)缺乏特異性，一是過(guò)量產(chǎn)生的活性氧殺滅入侵的病原微生物的同時(shí)，也會(huì)對(duì)宿主的細(xì)胞、組織和器官造成嚴(yán)重傷害[5-6]。但作為機(jī)體內(nèi)的一些抗氧化酶則會(huì)及時(shí)消除機(jī)體內(nèi)過(guò)量的活性氧，以維持機(jī)體的正常代謝，其中，超氧化物歧化酶就是抗氧化免疫防御途徑中一種極其重要的酶類(lèi)[7]。超氧化物歧化酶分布廣泛，幾乎存在于各種需氧生物中[8]。另一種重要的免疫因子——血藍(lán)蛋白，是存在于軟體動(dòng)物和節(jié)肢動(dòng)物的血淋巴中的一種含銅蛋白，除基本的載氧功能外，它還是一種多功能蛋白，目前被尤為關(guān)注的是該蛋白所表現(xiàn)出的抗病毒、抗菌和抗血細(xì)胞凝集活性以及酚氧化物酶活性等免疫學(xué)功能[9-11]。在近年來(lái)的研究中，已將機(jī)體免疫基因的表達(dá)水平以及相應(yīng)的活力大小作為衡量甲殼動(dòng)物免疫水平的指標(biāo)之一[7,12]。

作為一種昆蟲(chóng)生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，KK-42也開(kāi)始在甲殼動(dòng)物方面有了一些應(yīng)用[13]。如用適宜劑量的KK-42溶液浸泡凡納濱對(duì)蝦(Litopenaeusvannamei)體長(zhǎng)0.6～0.8 cm蝦苗，不僅能加速蝦苗的生長(zhǎng)速率[14]，還可顯著提高幼蝦的成活率[15]，但其作用機(jī)制尚不明確。鑒于此，考慮到日本沼蝦與凡納濱對(duì)蝦為不同的科屬，為研究KK-42對(duì)日本沼蝦是否具有同樣的作用并揭示其作用機(jī)理，筆者設(shè)計(jì)了水體常見(jiàn)致病菌——嗜水氣單胞菌的體內(nèi)攻毒試驗(yàn)，分析了KK-42處理前后日本沼蝦成活率的變化，以及免疫因子超氧化物歧化酶和血藍(lán)蛋白基因表達(dá)水平的變化，以評(píng)估KK-42對(duì)日本沼蝦免疫功能的影響，為KK-42更合理的廣泛應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料及試驗(yàn)用蝦的養(yǎng)殖

KK-42由煙臺(tái)大學(xué)應(yīng)用化學(xué)系提供(含量≥95%)；嗜水氣單胞菌由該課題組分離并鑒定。

選取體長(zhǎng)(45±0.5) cm蛻皮間期的健康蝦，飼養(yǎng)于流水養(yǎng)殖水槽(直徑800 mm，高1200 mm，上海海圣工貿(mào)有限公司)，水溫(27±1) ℃，日投喂2次，1周后用于試驗(yàn)。

1.2 日本沼蝦超氧化物歧化酶、血藍(lán)蛋白基因mRNA表達(dá)量的測(cè)定

取蛻皮間期的日本沼蝦120尾，隨機(jī)分為KK-42處理組和對(duì)照組。KK-42處理組用0.195 mmol/L的KK-42溶液浸泡處理1 min，取出后迅速控去水分，立刻投入到養(yǎng)殖水槽中，按正常方式飼養(yǎng)；對(duì)照組用不含KK-42的溶液處理，方法同上。分別提取處理后0、3、6、12、24、48 h的蝦肝胰腺總RNA，用RNase-Free DNase (Promega，USA)去除總RNA中殘留的基因組DNA。oligo (dT)18為引物反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈，采用Real-time PCR進(jìn)行時(shí)空表達(dá)分析。

根據(jù)日本沼蝦線粒體錳超氧化物歧化酶(HQ852225)、細(xì)胞質(zhì)錳超氧化物歧化酶(HQ852226)、血藍(lán)蛋白(JF683437)和18S RNA(DQ531769.1)的cDNA序列，分別設(shè)計(jì)相對(duì)應(yīng)目的基因引物mtSOD-F、mtSOD-R、 cytSOD-F、cytSOD-R、Hc-F、Hc-R和內(nèi)參基因引物18S RNA-F、18S RNA-R。 Real-time PCR依照SYRB Premix Ex TaqTM(TaKaRa)試劑盒進(jìn)行。20 μL體系中包括：cDNA模板2.0 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各0.4 μL，SYRB Premix Ex TaqTM 1.0 μL， ROX Reference Dye 0.4 μL，ddH2O 6.8 μL。反應(yīng)條件：95 ℃ 30 s，1 個(gè)循環(huán)；95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，40個(gè)循環(huán)。每組樣品設(shè)3次重復(fù)，以18S rRNA作為內(nèi)參基因，用2-△△ct來(lái)表示基因的相對(duì)轉(zhuǎn)錄量，結(jié)果表示為3個(gè)反應(yīng)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，利用SPSS 10.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.3 日本沼蝦超氧化物歧化酶活力的測(cè)定

采用超氧化物歧化酶測(cè)試盒(南京建成生物工程研究所)測(cè)定日本沼蝦肝胰腺超氧化物歧化酶活力。

1.4 日本沼蝦血藍(lán)蛋白含量的測(cè)定

血藍(lán)蛋白含量的測(cè)定參照Nickerson等的方法[16]，并稍作改進(jìn)。取血漿樣品100 μL，加入900 μL磷酸鹽緩沖液，在334 nm下測(cè)定光密度值OD334，按下式計(jì)算血藍(lán)蛋白質(zhì)量濃度(mg/mL) ：E334 nm= 2.30×OD334

表1 試驗(yàn)中所用引物

1.5 嗜水氣單胞菌急性感染試驗(yàn)

選取日本沼蝦120尾，隨機(jī)分為對(duì)照組和KK-42處理組(各60尾)。KK-42處理組用KK-42溶液浸泡處理1 min，對(duì)照組用不含KK-42的溶液處理，方法同上。用KK-42預(yù)處理后12 h，分別向2組蝦腹部血竇注射密度為3.0×107個(gè)/mL的菌懸液20 μL，每組分別設(shè)3次重復(fù)。分別于注射后0、3、6、12、24、48 h 計(jì)算各組的死亡率。

2 結(jié) 果

2.1 KK-42對(duì)日本沼蝦肝胰腺錳超氧化物歧化酶表達(dá)的影響

對(duì)照組肝胰腺細(xì)胞質(zhì)錳超氧化物歧化酶和線粒體錳超氧化物歧化酶mRNA的含量變化波動(dòng)不大(圖1)。KK-42可明顯誘導(dǎo)細(xì)胞質(zhì)錳超氧化物歧化酶和線粒體錳超氧化物歧化酶基因的表達(dá)，在處理后3 h均開(kāi)始升高，6 h達(dá)到峰值，12 h開(kāi)始下降，24 h恢復(fù)到正常水平。在處理后3、6、12 h，處理組與對(duì)照組相比，均出現(xiàn)顯著性差異(P<0.05)。

對(duì)照組中肝胰腺超氧化物歧化酶活力水平表現(xiàn)一定的波動(dòng)性，但與0 h相比沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的差異；試驗(yàn)組在KK-42處理后6 h和12 h 超氧化物歧化酶活力水平顯著升高，與相應(yīng)的對(duì)照組相比具有顯著差異(P<0.05)(圖2)。

2.2 KK-42對(duì)日本沼蝦血藍(lán)蛋白基因表達(dá)及血藍(lán)蛋白含量的影響

KK-42處理能明顯誘導(dǎo)肝胰腺血藍(lán)蛋白基因的表達(dá)(圖3)，與對(duì)照組相比，分別在KK-42處理后3、6、12 h，血藍(lán)蛋白基因的表達(dá)量均出現(xiàn)顯著性差異(P<0.05)。

對(duì)照組血淋巴中血藍(lán)蛋白含量變化波動(dòng)不大。KK-42處理顯著提高血淋巴中血藍(lán)蛋白的含量，與對(duì)照組相比，處理后第3、6、12 h分別提高了60.2%(P<0.01)、54.2%(P<0.05)和76.9%(P<0.01)(圖4)。

2.3 KK-42對(duì)日本沼蝦感染嗜水氣單胞菌后的免疫保護(hù)

試驗(yàn)期間，感染嗜水氣單胞菌后48 h內(nèi)，對(duì)照組死亡率迅速上升，在24 h時(shí)升到最高點(diǎn)并趨向穩(wěn)定；而KK-42處理組死亡率在12 h和24 h與對(duì)照組相比呈顯著性降低(圖5)。

圖1 KK-42處理對(duì)日本沼蝦肝胰腺細(xì)胞質(zhì)錳超氧化物歧化酶(a)和線粒體錳超氧化物歧化酶(b)基因表達(dá)的誘導(dǎo)“*”表示與相應(yīng)對(duì)照組相比差異顯著(P<0.05).下同.

圖2 KK-42處理對(duì)日本沼蝦肝胰腺超氧化物歧化酶活力的影響

圖3 KK-42處理對(duì)日本沼蝦肝胰腺血藍(lán)蛋白基因表達(dá)的誘導(dǎo)

圖4 KK-42處理對(duì)日本沼蝦血藍(lán)蛋白質(zhì)量濃度的影響“**” 表示與相應(yīng)對(duì)照組相比有極顯著差異(P<0.01).下同.

圖5 日本沼蝦感染嗜水氣單胞菌后死亡率與時(shí)間變化的關(guān)系

3 討 論

3.1 KK-42對(duì)日本沼蝦免疫相關(guān)基因表達(dá)的影響

KK-42是一種咪唑類(lèi)物質(zhì)，其主要是作為一種保幼激素拮抗物，如可以在蠶五齡中期適時(shí)噴施適當(dāng)劑量的KK-42，可使五齡期延長(zhǎng)，增加蠶的食桑量，也可擾亂昆蟲(chóng)正常變態(tài)過(guò)程，促進(jìn)幼蟲(chóng)提前蛻皮，形成畸形小個(gè)體，使其脫水、饑餓而死，因這種殺蟲(chóng)方法可以有效防止環(huán)境污染，因此KK-42曾廣泛用于害蟲(chóng)抗性綜合治理[17-18]。鑒于目前KK-42在甲殼動(dòng)物方面的研究進(jìn)展[13-15]，以及甲殼動(dòng)物缺乏真正的抗體，主要靠非特異性的方式實(shí)現(xiàn)其免疫的特點(diǎn)，研究了KK-42對(duì)日本沼蝦一些重要免疫因子及其抗菌機(jī)能的影響，為其進(jìn)一步的合理應(yīng)用打下基礎(chǔ)。

在對(duì)甲殼動(dòng)物的研究中，已將超氧化物歧化酶、酚氧化酶、溶菌酶和過(guò)氧化物酶等共同作為檢測(cè)甲殼動(dòng)物免疫功能的指標(biāo)酶[12]。鑒于肝胰腺在甲殼動(dòng)物中執(zhí)行著代謝、吸收和消化等重要生理功能，同時(shí)對(duì)環(huán)境變化也非常敏感，參與機(jī)體的免疫防御反應(yīng)，因此筆者以肝胰腺為研究對(duì)象。研究結(jié)果顯示，KK-42處理可顯著誘導(dǎo)肝胰腺細(xì)胞質(zhì)錳超氧化物歧化酶和線粒體錳超氧化物歧化酶兩個(gè)基因的表達(dá)，在處理后3 h基因表達(dá)水平明顯升高，6 h達(dá)到峰值。肝胰腺中超氧化物歧化酶活力的變化和基因表達(dá)基本一致。推測(cè)基因表達(dá)上調(diào)或者相應(yīng)酶活力增高可能會(huì)減輕或避免過(guò)量活性氧對(duì)機(jī)體的傷害，從而提高了機(jī)體的免疫機(jī)能。也有前期試驗(yàn)表明，KK-42可以誘導(dǎo)另一重要免疫相關(guān)基因——酚氧化酶及其活力的表達(dá)[19]，推測(cè)KK-42誘導(dǎo)日本沼蝦相關(guān)免疫基因的表達(dá)有利于動(dòng)物對(duì)不良環(huán)境的適應(yīng)，增強(qiáng)其對(duì)致病菌和病毒的免疫能力，增強(qiáng)了動(dòng)物體的耐受力。

血藍(lán)蛋白是構(gòu)成甲殼動(dòng)物免疫防御體系中重要的一員[9-11]，其蛋白分子的N端可表現(xiàn)出酚氧化物酶活性， C末端產(chǎn)生的小分子具有抗菌肽的活性[9,20]。因前期試驗(yàn)克隆得到了日本沼蝦血藍(lán)蛋白基因的全長(zhǎng)cDNA序列，時(shí)空表達(dá)分析表明，其主要在肝胰腺中表達(dá)[20]，故本研究以日本沼蝦肝胰腺中血藍(lán)蛋白基因表達(dá)水平和血淋巴中血藍(lán)蛋白含量的變化作為檢測(cè)指標(biāo)，以期探討KK-42預(yù)處理對(duì)其表達(dá)的影響。結(jié)果表明，KK-42處理3 h后，可明顯誘導(dǎo)血藍(lán)蛋白基因的表達(dá)(圖3)，血淋巴中血藍(lán)蛋白含量的變化趨勢(shì)與其基于表達(dá)基本一致(圖4)，推測(cè)KK-42可以在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平上調(diào)節(jié)血藍(lán)蛋白的表達(dá)，并通過(guò)某種途徑刺激血藍(lán)蛋白的釋放。增加的血藍(lán)蛋白除滿(mǎn)足呼吸等生理需求外，有可能更多地表現(xiàn)出一些免疫活性，如酚氧化酶活性，提高了動(dòng)物對(duì)環(huán)境的適應(yīng)性和對(duì)外來(lái)病原的抵抗性。

3.2 KK-42對(duì)日本沼蝦抗菌機(jī)能的影響

嗜水氣單胞菌是淡水養(yǎng)殖水體中一種常見(jiàn)的條件致病菌，其產(chǎn)生的外毒素，毒性較強(qiáng)，可引發(fā)黑鰓病和紅體病等，傳染性強(qiáng)，發(fā)病率高[21]。如環(huán)境條件惡化，養(yǎng)殖動(dòng)物免疫機(jī)能隨之下降，則可能導(dǎo)致該疾病的爆發(fā)。為找到一種適宜的物質(zhì)以提高日本沼蝦的抗菌機(jī)能，本研究以日本沼蝦的嗜水氣單胞菌進(jìn)行體內(nèi)攻毒試驗(yàn)，結(jié)果表明，經(jīng)KK-42預(yù)處理的日本沼蝦感染嗜水氣單胞菌后可以顯著降低其死亡率，同時(shí)，以往的研究表明[19]， KK-42處理組還能顯著提高對(duì)嗜水氣單胞菌的清除率，提示KK-42預(yù)處理可以提高日本沼蝦的抗菌機(jī)能。

研究發(fā)現(xiàn)，KK-42處理可明顯誘導(dǎo)細(xì)胞質(zhì)錳超氧化物歧化酶、線粒體錳超氧化物歧化酶和血藍(lán)蛋白免疫因子的表達(dá)和相應(yīng)酶活力或者蛋白含量的提高，同時(shí)，體內(nèi)嗜水氣單胞菌感染試驗(yàn)表明，KK-42預(yù)處理能顯著降低日本沼蝦感染嗜水氣單胞菌后的死亡率以及對(duì)嗜水氣單胞菌的清除率。初步結(jié)果表明，KK-42預(yù)處理可以提高日本沼蝦的抗菌機(jī)能。當(dāng)然，甲殼動(dòng)物的免疫機(jī)制非常復(fù)雜，如細(xì)胞免疫和體液免疫，對(duì)引起的其他因子的反應(yīng)尚需進(jìn)一步的研究。

[1] Bachère E.Shrimp immunity and disease control [J]. Aquaculture, 2000,191(1):3-11.

[2] Chang C C, Rahmawaty A, Chang Z W. Molecular and immunological responses of the giant freshwater prawn,Macrobrachiumrosenbergii, to the organophosphorus insecticide, trichlorfon[J]. Aquat Toxicol, 2013,131(2):18-26.

[3] Lin Y C, Chen J C, Chen Y Y, et al. Crowding of white shrimpLitopenaeusvananmeidepresses their immunity to and resistance againstVibrioalginolyticusand white spot syndrome virus[J]. Fish & Shellfish Immunol, 2015,45(1):104-111.

[4] 王文鋒,關(guān)建義,呂黎, 等.日本沼蝦cytMnSOD和mtMnSOD全長(zhǎng)克隆及表達(dá)分析[J].水產(chǎn)學(xué)報(bào), 2012,36(3):49-56.

[5] Duan Y, Zhang J, Dong H, et al. Oxidative stress response of the black tiger shrimpPenaeusmonodontoVibrioparahaemolyticuschallenge[J]. Fish & Shellfish Immunol, 2015,46(2):354-365.

[6] Sun H, Xu X Y, Tian X L, et al. Activation of NF-kappaB and respiratory burst followingAspergillusfumigatusstimulation of macrophages[J]. Immunobiology , 2014, 219(1):25-36.

[7] Duan Y, Zhang J, Dong, H, et al. Effect of desiccation and resubmersion on the oxidative stress response of the kuruma shrimpMarsupenaeusjaponicus[J]. Fish & Shellfish Immunol, 2015,49(1):91-99.

[8] Xie X Q, Li F, Ying S H, et al. Additive contributions of two manganese-cored superoxide dismutases (MnSODs) to antioxidation, UV tolerance and virulence ofBeauveriabassiana[J]. PLoS One, 2012,7(1):e30298.

[9] Yan F, Zhang Y L, Luo H Q , et al. The phenoloxidase activity of hemocyanin from white leg shrimpLitopenaeusvannamei[J]. Fish Sci, 2008, 27(1):5-8.

[10] Lei K Y, Li F, Zhang M C, et al. Difference between hemocyanin subunits from shrimpPenaeusjaponicusin anti-WSSV defense[J]. Dev Comp Immunol, 2008, 32(7):808-813.

[11] Kunlaya S, Vorrapon C, Wang H C, et al. Proteomic analysis of differentially expressed proteins inPenaeusmonodonhemocytes afterVibrioharveyiinfection [J].Proteome Science, 2010, 8(1):39-50.

[12] Liu Y T, Chang C I, Hseu J R, et al. Immune responses of prophenoloxidase and cytosolic manganese superoxide dismutase in the freshwater crayfishCheraxquadricarinatusagainst a virus and bacterium[J]. Mol Immunol, 2013,56(1):72-80.

[13] 王佩,呂艷杰,呂黎,等. 咪唑類(lèi)物質(zhì)KK-42對(duì)日本沼蝦幾丁質(zhì)酶基因表達(dá)的影響[J].水產(chǎn)科學(xué),2014,33(12):777-781.

[14] Ning Q J, Fu S G, Xu X J, et al. A new and practical application of JH antagonist KK-42 to promoting growth of shrimpPenaeusschmitti[J]. Aquaculture, 2007, 270(1):422-426.

[15] 寧黔冀, 楊洪,程鴻軒. 保幼激素拮抗物溶液及其提高水產(chǎn)養(yǎng)殖甲殼動(dòng)物成活率方法:中國(guó)，ZL200510017350.X [P]. 2008.

[16] Nickerson K W, Van Hold K E. A comparison of molluscan and arthopod hemocyanin in circular dichroism and absorption spectra[J]. Com Biochem Physiol, 1971, 39(4):855-872.

[17] Liu Y, Zhang Q, Denlinger D L. Imidazole derivative KK-42 boosts pupal diapause incidence and delays diapause termination in several insect species[J]. J Insect Physiol, 2015, 74(1):38.

[18] Kirane-Amrani L, Touiker S Y, Soltani-Mazouni N. Effect of imidazole derivative KK-42 on in vivo development and ecdysteroid levels in pupal stage of meal-worms[J]. Fresenius Environmental Bulletin, 2015,24(5):1856-1861.

[19] 王文鋒,關(guān)建義, 郭愛(ài)蓮, 等. 咪唑類(lèi)物質(zhì)KK-42提高日本沼蝦成活率機(jī)制的研究[J].中國(guó)免疫學(xué)雜志，2014,30(2):162-166.

[20] Fernando L, Garcia C, Keni C,et al. Phenoloxidase activity of hemocyanin in whiteleg shrimpPenaeusvannamei: conversion, characterization of catalytic properties, and role inPostmortemmelanosis[J]. Agric Food Chem, 2008, 56(15):6454-6459.

[21] 王文鋒, 夏西超, 王雪參, 等. 日本沼蝦血藍(lán)蛋白全長(zhǎng)克隆及表達(dá)分析[J]. 解剖學(xué)報(bào)，2012,43(2):90-96.

[22] Sen K, Rodgers M. Distribution of six virulence factors inAeromonasspecies isolated from US drinking water utilities: a PCR identification [J]. J Appl Microbiol, 2004, 97(5):1077-1086.