烏原鯉的胚胎發(fā)育特征

韓耀全,何安尤,藍家湖,吳偉軍,李育森,王大鵬,雷建軍,施 軍

( 1.廣西水產(chǎn)科學研究院,廣西水產(chǎn)遺傳育種與健康養(yǎng)殖重點實驗室,廣西 南寧 530021；2.廣西都安瑤族自治縣水產(chǎn)畜牧獸醫(yī)局,廣西 都安 530700 )

烏原鯉(Procyprismerus)俗名烏鯉、烏鉤、黑鯉、墨鯉等，屬鯉形目、鯉科、鯉亞科、原鯉屬，是珠江水系特有魚類，僅分布于珠江流域西江水域部分干流及支流[1-2]。由于眾多致危因素導(dǎo)致其自然資源日漸枯竭，已列為《中國瀕危動物紅皮書》瀕危物種和《世界自然保護聯(lián)盟瀕危物種紅色名錄》易危物種[3]。國內(nèi)外關(guān)于烏原鯉的研究極少，僅見有烏原鯉精子活力的影響[4]和寄生于烏原鯉鰓指環(huán)蟲(Dactylogyrus)新種等[5]少量報道。近年來烏原鯉的資源保護工作受到重視，魚類培育及繁殖工作已陸續(xù)開展，但有關(guān)烏原鯉生理生化、遺傳學和人工繁殖及養(yǎng)殖增殖的研究成果少有公開發(fā)表報道。為了開展烏原鯉資源養(yǎng)護與增殖，筆者自2014年起展開了烏原鯉性腺發(fā)育及人工繁殖相關(guān)技術(shù)研究，2016年3月成功人工繁育出烏原鯉仔魚3批次。全程觀察烏原鯉胚胎發(fā)育過程，為烏原鯉資源保護增殖工作和相關(guān)研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 親魚催產(chǎn)、人工授精與孵化

烏原鯉親本來自漁民捕獲出售的成熟親魚及野生魚苗池塘培育成熟的親魚，雌親魚體質(zhì)量1.0～2.0 kg，雄親魚體質(zhì)量0.8～2.5 kg。2016年3月8日、10日和26日，3次進行烏原鯉人工催產(chǎn)及胚胎發(fā)育觀察。篩選性腺發(fā)育良好的親魚，按每千克體質(zhì)量對雌魚注射催產(chǎn)，催產(chǎn)藥物為：1 mg鯉魚腦垂體+20 μg促黃體素釋放激素類似物+3 mg馬來酸地歐酮，用0.9%氯化鈉注射液研磨、溶解約至每尾魚1 mL劑量。采取胸鰭基部1次性注射，注射后放入催產(chǎn)池中，流水刺激促產(chǎn)。試驗雄魚性腺發(fā)育良好，未注射催產(chǎn)藥物。待發(fā)現(xiàn)催產(chǎn)池中親魚出現(xiàn)追逐，有產(chǎn)卵跡象時進行人工干法授精。受精卵置于微流水、連續(xù)充氧孵化桶中孵化，水溫為(20±1) ℃和(15±1) ℃、溶解氧>7 mg/L。

1.2 胚胎發(fā)育觀察

參考魚類胚胎發(fā)育相關(guān)研究成果，描述烏原鯉胚胎各個發(fā)育階段不同時期的發(fā)育特征[6-12]。通過OLYMPUS CX31生物顯微鏡和OLYMPUS SZ61體視顯微鏡對胚胎發(fā)育過程進行連續(xù)活體觀察，利用OLYMPUS DP73顯微鏡成像系統(tǒng)和OLYMPUS cellSens Standard 1.6顯微鏡圖像程序?qū)Ω靼l(fā)育時期胚胎進行成像和采集。受精后至囊胚期前每隔10 min、囊胚期后至原腸晚期每30 min、原腸晚期后每60 min觀察拍攝記錄1次。隨機取樣20粒以上，觀察，拍攝，記錄各發(fā)育階段的形態(tài)特征及發(fā)育時間，以50%胚胎進入某個發(fā)育階段為該發(fā)育階段的起始時間，自前一個發(fā)育階段至下一個發(fā)育階段的時間間隔為該階段的持續(xù)發(fā)育時長。發(fā)育積溫為某發(fā)育期平均水溫與此發(fā)育期持續(xù)發(fā)育時長的乘積。

為清晰觀察及拍攝胚胎發(fā)育圖像，并觀察經(jīng)去膜處理胚胎的發(fā)育情況，試驗同步觀察未處理及經(jīng)去膜處理胚胎的發(fā)育情況。烏原鯉卵膜不易通過物理方法剝離，采用Solarbio胰蛋白酶0.1%、0.25%、0.35%水解液對受精卵進行消化，消化3～10 min，消化時間達到后用Holtfreter培養(yǎng)液清洗并在培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)發(fā)育，直至出膜。Holtfreter培養(yǎng)液為3.5 g NaCl+0.05 g KCl+0.1 g CaCl2+0.2 g NaHCO3溶解至1000 mL雙蒸水中配制而成。

1.3 數(shù)據(jù)處理和分析

受精卵卵徑、胚胎及出膜仔魚等相關(guān)長度數(shù)據(jù)使用OLYMPUS DP73顯微鏡成像系統(tǒng)和OLYMPUS cellSens Standard 1.6顯微鏡圖像軟件內(nèi)置測量程序采集及測量。選取3次試驗觀察拍攝獲得的典型照片通過Adobe Photoshop CS 8.0.1軟件處理后，作為各烏原鯉胚胎各發(fā)育階段的特征模版照片。

2 結(jié) 果

烏原鯉約4齡性成熟，為一次性產(chǎn)卵型魚類[13]，產(chǎn)卵期2—4月。成熟卵子呈圓球形，亮黃色，卵徑1.68～1.98 mm，具較強黏性。受精卵吸水膨脹后，卵徑2.28～2.57 mm。烏原鯉胚胎發(fā)育與其他魚類胚胎發(fā)育過程相似，歷經(jīng)受精、卵裂、囊胚、原腸胚、神經(jīng)胚、器官形成及孵化出膜6階段，每個發(fā)育階段又有若干個發(fā)育時期[9-19]。在水溫(20±1) ℃、溶解氧>7.0 mg/L條件下，烏原鯉受精至出膜時長為80.8 h，胚胎發(fā)育所需總積溫為1616.0 ℃·h。

受精卵階段：受精后1.50 h，胚盤隆起。本階段歷時2.22 h，積溫44.4 ℃·h。

卵裂階段：受精后2.22、3.07、3.93、4.82、5.90 h和7.13 h，分別進入2細胞期、4細胞期、8細胞期、16細胞期、32細胞期和多細胞期。本階段2.22～9.02 h，歷時6.80 h，積溫136.0 ℃·h。

囊胚階段：受精后9.02、10.42、12.17 h，分別進入囊胚早期、囊胚中期和囊胚晚期。本階段9.02～15.37 h，歷時6.35 h，積溫127.0 ℃·h。

原腸胚階段：受精后15.37、19.25、21.27 h，分別進入原腸早期、原腸中期和原腸晚期。本階段15.37～21.88 h，歷時6.51 h，積溫130.2 ℃·h。

神經(jīng)胚階段：受精后21.88、22.47 h，分別進入神經(jīng)胚期和胚孔封閉期。本階段21.88～24.63 h，歷時2.75，積溫55.0 ℃·h。

器官形成階段：受精后24.63 h肌節(jié)出現(xiàn)，26.42、28.55、30.85、31.77 h，眼基、眼囊、尾芽和尾鰭相繼形成，34.97 h眼晶體出現(xiàn)，37.73 h進入肌肉效應(yīng)期，40.37 h耳石出現(xiàn)，43.53心臟形成，52.38 h進入心臟搏動期。本階段24.63～80.80 h，歷時56.17 h，積溫1123.4 ℃·h。

孵化出膜階段：受精后80.80 h，仔魚孵化出膜。本階段歷時47.45 h。其中初始出膜時間為71.33 h，25%出膜時間為78.60 h， 50%出膜時間80.80 h， 75%出膜時間為87.72 h，最遲出膜時間為128.25 h；水溫(15±1) ℃時，烏原鯉受精卵至出膜時長為116.5 h，初始出膜時間為100.50 h，25%出膜時間為110.33 h，50%出膜時間為116.50 h，75%出膜時間為134.33 h，最遲出膜時間為164.50 h。

初孵仔魚全長約6100 μm，體高1600 μm。卵黃囊呈前大后小漏斗形，后部約為前部最高的1/5～1/4。出膜后靜臥水底，偶能掙扎彈起，不能游動；出膜24 h仔魚全長6500 μm，體高1640 μm。卵黃囊前大后小，后部高約為前部最高的1/3；出膜48 h仔魚全長7240 μm，體高1540 μm；出膜72 h仔魚全長7970 μm，體高1390 μm。靜臥水底，可偶爾彈起游動數(shù)秒。水溫(20±1) ℃條件下烏原鯉胚胎發(fā)育過程各個發(fā)育時期主要特征見表1和圖1。

3 討 論

3.1 烏原鯉胚胎發(fā)育特點

烏原鯉隸屬的鯉科鯉亞科共有5屬魚類，分別為鲃鯉屬(Puntioplites)、原鯉屬(Procypris)、鯉屬(Cyprinus)、須鯽屬(Carassioides)和鯽屬(Carassius)[1-2]，原鯉屬、鯉屬和鯽屬魚類有胚胎發(fā)育研究記載[14-18]，鲃鯉屬和須鯽屬尚未見相關(guān)報道。烏原鯉胚胎發(fā)育過程與相同亞科魚類相似，但不同魚類胚胎各發(fā)育時間及歷時各有特點[14-18]。水溫約20 ℃時，原鯉屬的烏原鯉胚胎發(fā)育時長80.80 h，巖原鯉(P.rabaudi)90.57 h。鯉屬的三角鯉(C.multitaeniata)為92.17 h，相差不大。鯉屬的鯉魚(C.carpio)胚胎發(fā)育時長為60.00 h，鯽屬的鯽魚(C.anratus)為59.08 h，時間較短。

烏原鯉與同屬的巖原鯉相比，受精卵階段至囊胚階段發(fā)育時間基本相近，原腸胚階段至器官形成階段，巖原鯉胚胎發(fā)育相對較慢；水溫約20 ℃時，烏原鯉出膜階段持續(xù)時長47.45 h，比巖原鯉的27.43 h更長，二者均為尾部先出膜；烏原鯉與巖原鯉胚胎心臟搏動時間及各時期心率略有差異，巖原鯉受精后65.25 h心臟開始搏動，65.75 h心率38次/min，78.27 h(即開始搏動13 h后)心率60次/min，初孵仔魚心率80～82次/min。烏原鯉受精后50.78 h心臟開始搏動，55.67 h心率40～45次/min，55.68～67.67 h心率60次/min，開始搏動17 h后，心率穩(wěn)定在75次/min。

烏原鯉胸鰭原基出現(xiàn)較早，在尾鰭形成期已經(jīng)出現(xiàn)。巖原鯉胸鰭原基在心臟原基形成階段才形成[14]。

表1 烏原鯉胚胎發(fā)育特征

(續(xù)表1)

發(fā)育階段發(fā)育時期發(fā)育時間/h發(fā)育階段持續(xù)時間/h主要形態(tài)特征圖解器官形成階段晶體形成期34.97肌肉效應(yīng)期37.73嗅窩耳石期40.37心臟形成期43.53心臟摶動期52.38脊索非常清晰,眼杯中可見晶體,卵黃體呈上腎形,肌節(jié)清晰。1v胚體延長,頭部突出,尾的邊緣出現(xiàn)皮褶,可見胚體微弱的間歇性顫動,顫動時間間隔及次數(shù)無規(guī)律。此時去膜胚胎直徑1594 μm,高2489 μm。頭尾間距718 μm。眼長305 μm,眼高268 μm,眼晶體直徑117 μm。1w眼囊逐漸凹陷呈杯狀,脊索前端的上方出現(xiàn)小泡狀耳囊,尾鰭伸長,脊索可見,肌肉收縮加強,眼前方有一對淺的凹陷,耳囊出現(xiàn)小石粒。尾鰭長550 μm。1x尾部游離增長,在胚胎頭部和卵黃囊之間可見葫蘆狀細胞串心臟原基。尾鰭長664 μm。1y尾部伸長,頭部腹下方、卵黃囊正前方的心臟開始跳動,由弱到強,胚體伸直。開始搏動前面5 h跳動頻率為40～45次/min,隨后12 h跳動頻率為60次/min,17 h后穩(wěn)定在75次/min。1z孵出階段出膜期80.8047.45胚體加速扭動,尾部不斷拍擊,通過扭動尾部頂破卵膜,自尾部脫膜而出。初孵仔魚全長約6100 μm,體高1600 μm。出膜后靜臥水底,偶能掙扎彈起,不能游動;出膜24 h仔魚全長6500 μm。1aa1bb

3.2 溫度對胚胎發(fā)育和仔魚出膜的影響明顯

溫度對烏原鯉胚胎發(fā)育及出膜階段影響明顯。一是溫度對胚胎發(fā)育時間影響明顯。水溫(15±1) ℃時烏原鯉受精卵至出膜時間為116.5 h，水溫(20±1) ℃時為80.8 h。在溫度較低的條件下，胚胎發(fā)育相對遲緩，前期各階段發(fā)育時間相差較小，后期階段相差較大；二是溫度對出膜階段影響明顯。在水溫(15±1) ℃時胚胎25%～75%出膜持續(xù)時長24 h，從初始出膜到完全出膜持續(xù)時長約64 h。而在水溫(20±1) ℃時胚胎25%～75%出膜持續(xù)時長為9 h，從初始出膜到完全出膜持續(xù)時長約57 h?？梢娝疁?20±1) ℃比水溫(15±1) ℃仔魚出膜時間更早、出膜更同步、出膜時段更集中。此外，無論(15±1) ℃還是(20±1) ℃條件下，烏原鯉出膜階段持續(xù)時長均接近50 h，與巖原鯉在相同條件下發(fā)育卵孵化的時間差達30 h有類似現(xiàn)象[18]，其相關(guān)機理及影響有待研究。

3.3 去膜處理有利胚胎發(fā)育觀察研究

對胚胎進行去膜處理，可以更清楚觀察及展現(xiàn)胚胎發(fā)育情況，有些胚胎發(fā)育研究直接采用經(jīng)脫膜胚胎發(fā)育的觀察結(jié)果[19-21]。烏原鯉受精卵具黏性表面易黏連異物，且卵膜較厚，去膜處理有利觀察胚胎內(nèi)部情況。本試驗采用胰蛋白酶水解液對部分受精卵進行脫膜，同步觀察未處理及經(jīng)去膜處理胚胎的發(fā)育情況。結(jié)果顯示，經(jīng)3種劑量消化液脫膜處理的胚胎均能發(fā)育良好，與未脫膜處理的胚胎發(fā)育進程基本同步，直至孵化出膜的各發(fā)育階段均未發(fā)現(xiàn)明顯發(fā)育差異。胚胎經(jīng)短時間消化處理，卵膜在較短時間內(nèi)不會完全脫落，但能去除部分表面卵膜及黏連的異物，視野會更清晰，有利觀察和拍攝。受精卵移出消化液經(jīng)Holtfreter培養(yǎng)液清洗并移入培養(yǎng)液中后，酶作用并未完全停止，消化尚在緩慢進行，時間稍長，部分受精卵膜會整體完全脫落。使用胰蛋白酶水解液消化脫膜要控制好消化時間，在顯微鏡下注意觀察，不能過度消化，避免胰蛋白酶對細胞造成損傷。

表2 鯉亞科魚類胚胎發(fā)育進程 h

圖1 烏原鯉的胚胎發(fā)育1a：受精卵；1b：胚盤隆起；1c：2細胞期；1d：4細胞期；1e：8細胞期；1f：16細胞期；1g：32細胞期；1h：多細胞期；1i：囊胚早期；1j：囊胚中期；1k：囊胚晚期；1l：原腸早期；1m：原腸中期；1n：原腸晚期；1o：神經(jīng)胚期；1p：胚孔封閉期；1q：肌節(jié)形成期；1r：眼基形成期；1s：眼囊形成期；1t：尾芽出現(xiàn)期；1u：尾鰭形成期；1v：晶體形成期；1w：肌肉效應(yīng)期；1x：耳石形成期；1y：心臟形成期；1z：心臟摶動期；1aa：初孵仔魚(前部側(cè)面)；1bb：初孵仔魚(前部背面).

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