不同測定方法對聚維酮碘殺菌效果的比較研究

陳 璇，張飛飛，陳志永，隗黎麗，范玉頂，張家奇，徐 敏，湯百福，劉 彧，鐘其旺

( 1.江西農(nóng)業(yè)大學(xué)，江西 南昌 330045； 2.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院長江水產(chǎn)研究所，湖北 武漢 430223 )

黃鱔(Monopterusalbus)是我國重要的淡水經(jīng)濟(jì)魚類之一，具有很高的食用價值和藥用價值[1]。隨著人工養(yǎng)殖密度的增加、集約化程度的提高，使得黃鱔更易受到病原菌的侵害，大量疾病相繼爆發(fā)，而嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)就是常見的致病菌之一[2-4]。嗜水氣單胞菌廣泛存在于自然界的各種水體，是一種條件致病菌，當(dāng)環(huán)境因素(如溫度、氧含量、氨氮含量等)發(fā)生驟變時易導(dǎo)致疾病的爆發(fā)，如敗血癥、潰瘍和細(xì)菌性腸炎等[5]。不僅如此，嗜水氣單胞菌還是一種典型的人獸魚共患病病原菌，對爬行動物、兩棲動物、鳥類、哺乳動物以及人類都具有致病性[6]。為了減少養(yǎng)殖業(yè)的損失和保障人類的健康，消毒劑的使用就顯得尤為必要。聚維酮碘，又名聚乙烯吡咯烷酮碘，具有低毒、高效、廣譜的特點，是水產(chǎn)和醫(yī)學(xué)上常用的消毒劑。對于聚維酮碘殺菌效果的測定，常采用試管二倍稀釋法[9-10]和直接作用法[11-12]，兩種方法的差異主要是反應(yīng)時間和作用體系的不同。此前，已有研究證明有機物的存在會降低聚維酮碘殺菌的有效性[13-15]，而試管二倍稀釋法的作用體系內(nèi)含有液體培養(yǎng)基，推測培養(yǎng)基的存在會降低試管二倍稀釋法測定結(jié)果的可靠性和準(zhǔn)確性。故本研究擬同時采用試管二倍稀釋法和直接作用法測定聚維酮碘對嗜水氣單胞菌的殺菌效果，比較兩種方法中有效碘的含量，同時評估聚維酮碘對黃鱔的毒性效果，以期為生產(chǎn)實踐和實驗室養(yǎng)殖中嗜水氣單胞菌的防治提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 材料

聚維酮碘(碘含量11%～12%)，四川正泰動物制藥公司生產(chǎn)；試驗中使用的培養(yǎng)基為溶菌肉湯培養(yǎng)基、營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基和雙倍營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，pH 7.3；可溶性淀粉(國藥)；所有試劑均為分析純。試驗菌株為本實驗室分離的來自患病黃鱔的6株嗜水氣單胞菌(Ah1～Ah6)。黃鱔(體質(zhì)量為10～20 g)取自江西洪瑞黃鱔養(yǎng)殖場。試驗前黃鱔在曝氣除氯的自來水中暫養(yǎng)7 d，水溫(25±1) ℃，每日下午投餌一次，換水一次。挑選健康、無外傷的黃鱔進(jìn)行毒性試驗。

1.2 方法

1.2.1 菌懸液制備

將6株嗜水氣單胞菌分別接種于液體培養(yǎng)基中，25 ℃搖床培養(yǎng)至OD600≈ 0.5，10 000 r/min離心5 min，棄上清液，用無菌雙蒸水重懸，重復(fù)以上步驟3次，獲得菌懸液。

1.2.2 0.1%可溶性淀粉溶液配制

精確稱取0.1 g可溶性淀粉粉末，加入含有雙蒸水的燒杯中，加熱至溶液澄清透明，冷卻后定容至100 mL備用?？扇苄缘矸廴芤盒璎F(xiàn)配現(xiàn)用。

1.2.3 試管二倍稀釋法測定聚維酮碘的最小抑菌質(zhì)量濃度和最小殺菌質(zhì)量濃度

將聚維酮碘粉末分別用無菌的溶菌肉湯、營養(yǎng)肉湯和雙倍濃度營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基配制成8 g/L的母液，再用相應(yīng)的液體培養(yǎng)基進(jìn)行稀釋至終質(zhì)量濃度為4、2、1、0.5、0.25、0.125 g/L。取0.1 mL菌懸液接種于含有聚維酮碘的培養(yǎng)基中(終約2×106cfu/mL)，作為試驗組；取0.1 mL菌懸液以同樣方法接種于不含聚維酮碘的培養(yǎng)基中，作為對照組。將試驗組和對照組均置于25 ℃恒溫避光條件下培養(yǎng)24 h后觀察結(jié)果。以無菌生長(肉眼觀測液體透明澄清)、稀釋度最大的聚維酮碘質(zhì)量濃度作為各菌株的最小抑菌質(zhì)量濃度。從聚維酮碘作用后無菌生長的試管中取100 μL溶液，再加入等量的中和劑(0.004 mol/L硫代硫酸鈉)作用10 min后，涂布于相應(yīng)的無菌瓊脂平板上，過夜培養(yǎng)后平板上仍無細(xì)菌生長的最低聚維酮碘質(zhì)量濃度作為最小殺菌質(zhì)量濃度。以上試驗重復(fù)3次。

1.2.4 直接作用法測定聚維酮碘殺菌效果

將聚維酮碘粉末用雙蒸水配制成100、50 mg/L的溶液，取出100 μL加入到含有900 μL菌懸液的離心管中(終約2×106cfu/mL)。25 ℃恒溫避光孵育0、10、30、60 min之后，每管分別取150 μL加入等量的中和劑，作用10 min后，取100 μL進(jìn)行梯度稀釋并涂布于無菌瓊脂平板上，過夜培養(yǎng)后計數(shù)，根據(jù)稀釋倍數(shù)推算出100 μL涂布液中的細(xì)菌總數(shù)。進(jìn)行3次獨立重復(fù)試驗。

聚維酮碘處理后嗜水氣單胞菌的存活率=處理后細(xì)菌總數(shù)/處理前細(xì)菌總數(shù)

1.2.5 有效碘含量測定

有效碘含量的測定參考文獻(xiàn)[16]的方法，略有改動。將聚維酮碘的粉末用無菌培養(yǎng)基(溶菌肉湯、營養(yǎng)肉湯和雙倍濃度營養(yǎng)肉湯)或雙蒸水配制成質(zhì)量濃度為4、2、1、0.5 g/L的溶液。分別取上述溶液1 mL加至含有2 mL 0.1%可溶性淀粉溶液的離心管中，混勻后取1.5 mL于585 nm(最大吸收波長)處測吸光度，剩余1.5 mL溶液置于25 ℃恒溫箱中避光放置24 h后再次測定吸光度。所有吸光度的測定均以未加聚維酮碘的上述混合液(1 mL溶菌肉湯/營養(yǎng)肉湯/雙倍濃度營養(yǎng)肉湯/雙蒸水和2 mL 0.1%可溶性淀粉溶液的混合液)作為空白對照，進(jìn)行調(diào)零。以O(shè)D585 nm的數(shù)值來反映有效碘的含量。以上試驗均進(jìn)行3次重復(fù)。

1.2.6 聚維酮碘對黃鱔的急性毒性

采用靜水法[17]測定聚維酮碘對黃鱔(13.36±2.51) g的毒性效果。分別將聚維酮碘粉末加入至2 L除氯自來水中至終質(zhì)量濃度為100、150、175、200、250 mg/L，每組放入健康黃鱔10尾，試驗期間避光不喂食不換水，每個質(zhì)量濃度設(shè)置3組平行。連續(xù)觀察24 h，記錄各質(zhì)量濃度組黃鱔的死亡數(shù)目并清理死亡黃鱔(以喪失游動能力和掐尾無反應(yīng)作為死亡標(biāo)準(zhǔn))，計算聚維酮碘對黃鱔的半數(shù)致死質(zhì)量濃度。

1.3 數(shù)據(jù)處理和分析

采用Excel軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行初步整理，使用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié) 果

2.1 試管二倍稀釋法測定聚維酮碘殺菌效果

在不同培養(yǎng)基存在下，聚維酮碘對嗜水氣單胞菌作用24 h后，各試驗組表現(xiàn)出不同程度的澄清和渾濁現(xiàn)象。對培養(yǎng)后仍澄清的菌液進(jìn)行平板計數(shù)，發(fā)現(xiàn)部分澄清菌液中仍有活菌存在。在溶菌肉湯和營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，聚維酮碘對6株嗜水氣單胞菌的最小抑菌質(zhì)量濃度和最小殺菌質(zhì)量濃度均為2 g/L；在雙倍濃度營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，聚維酮碘對3株嗜水氣單胞菌(Ah1～3)的最小抑菌質(zhì)量濃度為2 g/L，最小殺菌質(zhì)量濃度為4 g/L，對另外3 株菌(Ah4～6)的最小抑菌質(zhì)量濃度和最小殺菌質(zhì)量濃度均為4 g/L(表1)。

2.2 直接作用法測定聚維酮碘殺菌效果

直接作用法的結(jié)果顯示，盡管不同嗜水氣單胞菌菌株對聚維酮碘的敏感性各不相同，但聚維酮碘對各菌株均有良好的殺菌效果(表2)，5 mg/L聚維酮碘在10 min內(nèi)對6株嗜水氣單胞菌的殺滅率高達(dá)99.99%以上，10 mg/L聚維酮碘在10 min內(nèi)殺滅率為100%。

2.3 培養(yǎng)基對聚維酮碘有效碘含量的影響

不同溶液在585 nm的吸光度均隨聚維酮碘質(zhì)量濃度的增加而升高(表3)。當(dāng)聚維酮碘的質(zhì)量濃度相同時，不同溶液展現(xiàn)出不同的效果，雙蒸水中有效碘的含量最高，其次是溶菌肉湯培養(yǎng)基和營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，而雙倍營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中有效碘的含量最低。當(dāng)聚維酮碘的質(zhì)量濃度為4 g/L時，不同溶液的吸光值由高到低依次為雙蒸水(>4)、溶菌肉湯(0.1123)、營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基(0.0607)、雙倍濃度營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基(0.0302)。放置24 h后，所有反應(yīng)液的吸光值均下降，說明有效碘含量減少，其中，雙蒸水中吸光值降幅最大，但仍遠(yuǎn)高于其他培養(yǎng)基。

2.4 聚維酮碘對黃鱔的急性毒性測定

黃鱔在聚維酮碘質(zhì)量濃度為100～250 mg/L的曝氣自來水中均出現(xiàn)了前期魚體劇烈游動的現(xiàn)象，部分黃鱔后期出現(xiàn)游動能力減弱和持續(xù)抬頭呼吸及死亡等不正?，F(xiàn)象，而且隨著聚維酮碘質(zhì)量濃度的升高，死亡率逐漸增加，當(dāng)聚維酮碘質(zhì)量濃度為250 mg/L時，黃鱔全部死亡。而低質(zhì)量濃度處理組(100 mg/L)和對照組黃鱔在整個試驗期間均未出現(xiàn)死亡的現(xiàn)象。聚維酮碘質(zhì)量濃度與黃鱔死亡率的相關(guān)性方程為：y=0.0069x-0.7[r2= 0.9804，其中y表示黃鱔的死亡百分率，x表示聚維酮碘的質(zhì)量濃度(mg/L)，r2表示相關(guān)系數(shù)]。由此計算得出聚維酮碘對黃鱔的24 h半致死質(zhì)量濃度為173.91 mg/L。

表1 聚維酮碘對嗜水氣單胞菌的最小抑菌質(zhì)量濃度和最小殺菌質(zhì)量濃度(n=3)

表2 不同質(zhì)量濃度聚維酮碘對嗜水氣單胞菌的殺菌效果(平均值±標(biāo)準(zhǔn)差)

注：**表示同行數(shù)據(jù)(平均值±標(biāo)準(zhǔn)差)經(jīng)LSD法比較在P<0.01水平上差異顯著.

表3 不同溶液中聚維酮碘有效碘含量隨時間的變化(平均值±標(biāo)準(zhǔn)差)

注：不同字母表示同行數(shù)據(jù)(平均值±標(biāo)準(zhǔn)差)經(jīng)LSD法比較在P<0.01水平上差異顯著；*表示同一聚維酮碘質(zhì)量濃度下0 h和24 h間的有效碘含量經(jīng)LSD法比較均存在顯著性差異(P<0.05).

3 討 論

3.1 聚維酮碘殺菌測定方法比較

聚維酮碘是一種廣譜消毒劑，對細(xì)菌、真菌、孢子和部分寄生蟲[18]均有良好的殺滅效果[19]。其通過與病原體的巰基化合物、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)等發(fā)生碘化反應(yīng)，以達(dá)到破壞膜結(jié)構(gòu)并殺死病原體的效果[20]。目前，聚維酮碘殺菌效果的測定方法主要有兩種，為試管二倍稀釋法和直接作用法，兩種方法測得的有效殺菌質(zhì)量濃度間存在較大差異。楊移斌[10]等采用試管二倍稀釋法研究了聚維酮碘對各種病原菌的殺菌效果，其中弗氏檸檬酸桿菌(Citrobacterfreundii)和魯氏耶爾森氏菌(Yersiniaruckeri)對聚維酮碘的敏感性最強，最小抑菌質(zhì)量濃度和最小殺菌質(zhì)量濃度分別為128 mg/L、1024 mg/L，嗜水氣單胞菌的敏感性最弱，最小抑菌質(zhì)量濃度和最小殺菌質(zhì)量濃度分別為256 mg/L、2048 mg/L；譚鳳霞[9]發(fā)現(xiàn)聚維酮碘對不同氣單胞菌菌株的最小抑菌質(zhì)量濃度為125～250 mg/L，最小殺菌質(zhì)量濃度為4～8 g/L。Mainous等[11-12]采用直接作用法發(fā)現(xiàn)在雙蒸水中，25 mg/L聚維酮碘對分支桿菌(Mycobacterium)的殺菌率5 min內(nèi)可達(dá)100%，而50 mg/L聚維酮碘在1 min內(nèi)即可完全殺滅遲緩愛德華菌(Edwardsiellatarda)。兩種方法獲得的結(jié)果間的差異可能是由菌株的差異性或測定方法的不同所致，故筆者同時采用兩種方法測定聚維酮碘對黃鱔源嗜水氣單胞菌的殺菌效果，以消除菌株間的差異對結(jié)果的影響。結(jié)果表明，使用試管二倍稀釋法時，在溶菌肉湯培養(yǎng)基和營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，聚維酮碘對嗜水氣單胞菌(Ah1～6)的最小抑菌質(zhì)量濃度和最小殺菌質(zhì)量濃度均為2 g/L；在雙倍營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，聚維酮碘對6株嗜水氣單胞菌(Ah1～6)的最小抑菌質(zhì)量濃度為2～4 g/L，最小殺菌質(zhì)量濃度均為4 g/L。而使用直接作用法時，5 mg/L聚維酮碘在10 min內(nèi)對6株嗜水氣單胞菌的殺菌率即可達(dá)99.99%。這說明測定方法的不同直接導(dǎo)致結(jié)果的差異，而這兩種測定方法間的差異主要在于反應(yīng)體系的不同，前者添加有機培養(yǎng)基，而后者僅為雙蒸水。細(xì)菌培養(yǎng)基成分復(fù)雜，富含有機物，而有機質(zhì)會中和有效碘[13,21-22]，導(dǎo)致聚維酮碘殺菌效率的下降。不同培養(yǎng)基對有效碘的中和效果不同，培養(yǎng)基濃度越高，有機質(zhì)的含量越多，有效碘的含量就越低，這直接導(dǎo)致了其在不同培養(yǎng)基中殺菌效率的不同。通過對有效碘的測定，也證實了培養(yǎng)基的確導(dǎo)致有效碘含量的顯著下降。

由于聚維酮碘刺激性小、作用時效長、無殘留毒性，故常用于魚卵和水生動物體表的殺菌，但環(huán)境中諸多因素均能對聚維酮碘的有效性造成影響，如溫度、光照、pH和有機物的存在等。一般胚胎消毒過程中，會漂洗去除過量的有機物，這主要是由于有機物的存在會降低聚維酮碘的有效性。當(dāng)小牛血清、血液、黏液存在時，均能弱化聚維酮碘的殺菌效果[20]。在醫(yī)學(xué)上，研究聚維酮碘的殺菌效果時，通常會加入少量的小牛血清蛋白，以模擬皮膚或黏膜表面[15,25-26]。但在水產(chǎn)養(yǎng)殖中，雖然養(yǎng)殖水體中含有機物，但其含量遠(yuǎn)未及培養(yǎng)基中豐富，故相比于試管二倍稀釋法，采用直接作用法更加合理，準(zhǔn)確性也更高。因而在測定養(yǎng)殖水體中聚維酮碘對各種病原菌的殺菌效果時，推薦使用直接作用法。

3.2 聚維酮碘對黃鱔的毒性作用

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