解脲棒狀桿菌與尿液中磷酸銨鎂結(jié)晶形成的相關(guān)性

李采青， 曹 靜， 詹明華， 韓旭穎， 李小鳳， 劉金祿

（河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院微生物科，河北 張家口 075000）

解脲棒狀桿菌是一種需氧、無芽胞革蘭陽性棒狀桿菌，是引起泌尿系統(tǒng)感染的重要病原菌。因其迅速分解尿素并利用其生長，導(dǎo)致高氨尿和堿性尿，使尿液中磷酸鹽、碳酸磷灰石和尿酸銨等成分過于飽和，從而易產(chǎn)生磷酸銨鎂結(jié)晶并形成感染性結(jié)石。為了解從泌尿系統(tǒng)感染的尿液中分離的解脲棒狀桿菌與磷酸銨鎂結(jié)晶的關(guān)系，本研究對(duì)用超高倍顯微鏡觀察到磷酸銨鎂結(jié)晶的尿液進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)，分析細(xì)菌構(gòu)成，并將解脲棒狀桿菌置于無菌、無污染尿液中培養(yǎng)，觀察磷酸銨鎂結(jié)晶情況，以確定其是否影響磷酸銨鎂結(jié)晶的形成，旨在為臨床抗感染治療、防止感染性結(jié)石的形成提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 研究對(duì)象 選取2015年1月—2016年12月來河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院就診的門診和住院患者送檢至微生物科超高倍顯微鏡室的尿液樣本，其中檢出磷酸銨鎂結(jié)晶陽性尿液46例[患者男31例，年齡（63.29±15.41）歲；女15例，年齡（63.60±12.49）歲]，無磷酸銨鎂結(jié)晶尿液40例[患者男20例，年齡（44.86±13.75）歲；女20例，年齡（41.64±17.96）歲]。均按要求留取患者中段尿于無菌容器立即送檢。解脲棒狀桿菌分離自磷酸銨鎂結(jié)晶尿液。

1.1.2 儀器與試劑 ACT-2000超高倍顯微成像系統(tǒng)（上海復(fù)星公司）， pH精密試紙（杭州特種紙業(yè)有限公司），KDC-40低速離心機(jī)（科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司），PHONEX100全自動(dòng)細(xì)菌鑒定/藥物敏感性系統(tǒng)（美國BD公司），UF-1000i全自動(dòng)尿有形成分分析儀及配套試劑（日本Sysmex公司）。

1.2 方法

1.2.1 原尿液鏡檢 取10 mL尿液于離心管中，以400×g離心5 min棄上清，剩余沉渣為0.2 mL，混勻吸取沉渣分別置于2張載玻片上，一張用于直接涂片并做革蘭染色，另一張用24 mm×24 mm蓋玻片壓片，用超高倍顯微鏡觀察全片。

1.2.2 磷酸銨鎂結(jié)晶陽性尿液細(xì)菌培養(yǎng)及鑒定 取10 μL 尿液接種于5%羊血瓊脂平板和麥康凱瓊脂平板上，置35 ℃孵箱中培養(yǎng)24～48 h，根據(jù)菌落形態(tài)、菌落計(jì)數(shù)、染色特點(diǎn)初步判斷，用Phonex100全自動(dòng)細(xì)菌鑒定/藥物敏感性系統(tǒng)進(jìn)行鑒定。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)菌株在尿液中的培養(yǎng) 將無菌、無污染、無各種結(jié)晶、無紅細(xì)胞和白細(xì)胞尿液置于無菌帶蓋試管中（約2 mL/管），將解脲棒狀桿菌、大腸埃希菌、奇異變形桿菌、銅綠假單胞菌、肺炎克雷伯菌和腸球菌分別配制成0.5麥?zhǔn)蠞岫染鷳乙?，分別取10 μL菌懸液加入上述裝有尿液的試管中，每份尿液均設(shè)立空白對(duì)照，置35 ℃孵箱中培養(yǎng)24和48 h。

1.2.4 實(shí)驗(yàn)菌株在尿液中培養(yǎng)后的磷酸銨鎂結(jié)晶鏡檢 取培養(yǎng)液20 μL于載玻片上，用24 mm×24 mm蓋玻片壓片，用超高倍顯微鏡觀察結(jié)晶形態(tài)，保存結(jié)晶圖像。

1.2.5 結(jié)晶顯微鏡判定 磷酸銨鎂結(jié)晶有很強(qiáng)的折光性，可見洋信封狀、方柱狀、立方體、未成形羽毛狀等形態(tài)。

1.2.6 尿液有形成分的分析 嚴(yán)格按照儀器說明書進(jìn)行尿液分析。參考區(qū)間：pH值5.5～6.5，結(jié)晶數(shù)量0～10個(gè)/μL，細(xì)菌0～6 000個(gè)/μL，白細(xì)胞0～30個(gè)/μL。

2 結(jié)果

2.1 磷酸銨鎂結(jié)晶陽性尿液解脲棒狀桿菌的陽性率

在46例檢出磷酸銨鎂結(jié)晶的尿液中，細(xì)菌培養(yǎng)陽性25例（陽性率54.3%），其中男性患者尿液17例（陽性率54.8%）、女性患者尿液8例（陽性率53.3%）。12例尿液培養(yǎng)出2種病原菌。解脲棒狀桿菌8株（陽性率32.0%），其中有2株與腸球菌、1株與大腸埃希菌、1株與白念珠菌混合生長，來自女性1株、男性7株。磷酸銨鎂結(jié)晶陽性尿液中的細(xì)菌種類及構(gòu)成比見表1。

表1 磷酸銨鎂結(jié)晶陽性尿液中的細(xì)菌種類及構(gòu)成比

2.2 磷酸銨鎂結(jié)晶陽性尿液的主要特點(diǎn)

尿液pH值7.0～7.5 7例、8.0～8.5 31例、9.0以上8例；結(jié)晶數(shù)量在參考區(qū)間內(nèi)35例，＞10個(gè)/μL 11例；細(xì)菌數(shù)量在參考區(qū)間內(nèi)37例，＞6 000個(gè)/μL 9例；白細(xì)胞在參考區(qū)間內(nèi)11例，＞30個(gè)/μL 35例。

2.3 解脲棒狀桿菌在尿液中繁殖后形成磷酸銨鎂結(jié)晶培養(yǎng)液的pH值

空白對(duì)照管中尿液的pH值為5.4～7.0，解脲棒狀桿菌培養(yǎng)液的pH值均＞9.0。

2.4 解脲棒狀桿菌和其他實(shí)驗(yàn)菌株在無結(jié)晶尿液繁殖后形成磷酸銨鎂結(jié)晶的情況

對(duì)分離的8株解脲棒狀桿菌選擇其中4株與尿液混合培養(yǎng)后，20例女性患者尿液中有9例（結(jié)晶形成率為75.0%），20例男性患者尿液中有15例（結(jié)晶形成率為45.0%）有磷酸銨鎂結(jié)晶形成，4株解脲棒狀桿菌在尿液中的磷酸銨鎂結(jié)晶形成情況和結(jié)晶形態(tài)均一致。實(shí)驗(yàn)菌株磷酸銨鎂結(jié)晶形成情況見表2。

2.5 解脲棒狀桿菌在無結(jié)晶尿液中繁殖后磷酸銨鎂的結(jié)晶形態(tài)

表2 實(shí)驗(yàn)菌株在無結(jié)晶尿液中繁殖后磷酸銨鎂結(jié)晶形成情況 （例）

解脲棒狀桿菌在無磷酸銨鎂結(jié)晶的尿液繁殖后可觀察到方柱狀、立方體、未成形羽毛狀、洋信封狀等結(jié)晶形態(tài)，以未成形羽毛狀多見；同一培養(yǎng)液中可觀察到不同形態(tài)的磷酸銨鎂結(jié)晶，48 h后可觀察到磷酸銨鎂結(jié)晶體積變大、變厚且有聚集現(xiàn)象。見圖1～圖3。

圖1 磷酸銨鎂洋信封狀結(jié)晶

圖2 磷酸銨鎂未成形方柱狀結(jié)晶

圖3 磷酸銨鎂未成形立方體結(jié)晶

3 討論

泌尿系統(tǒng)感染是泌尿外科和腎內(nèi)科常見疾病，臨床上常做尿液干化學(xué)分析和尿液培養(yǎng)[1]，忽視尿沉渣顯微鏡鏡檢。泌尿系統(tǒng)感染分解尿素的病原體后可在尿路中形成磷酸銨鎂結(jié)晶，磷酸銨鎂結(jié)晶是尿沉渣檢驗(yàn)中常見的結(jié)晶之一，正?；虿±砬闆r下均可形成，也是形成感染性結(jié)石的基礎(chǔ)，是泌尿系統(tǒng)感染發(fā)生的原因之一[2]。

本研究對(duì)超高倍顯微鏡下觀察到磷酸銨鎂結(jié)晶的尿液進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)，結(jié)果顯示細(xì)菌陽性率為54.3%，共分離出病原菌9種，具有尿素酶的細(xì)菌（解脲棒狀桿菌、奇異變形桿菌、肺炎克雷伯菌、銅綠假單胞菌）占50%以上。解脲棒狀桿菌陽性率為32.0%（8/25），可見在形成磷酸銨鎂結(jié)晶的泌尿系統(tǒng)感染中解脲棒狀桿菌是重要病原菌之一。體外實(shí)驗(yàn)顯示解脲棒狀桿菌在男性或女性患者尿液中生長繁殖時(shí)尿液中均有磷酸銨鎂結(jié)晶形成，48 h男性患者結(jié)晶的形成率[75.0%（15/20）]高于女性患者[45.0%（9/20）]，其可能與女性和男性飲食習(xí)慣不同有關(guān)，這種差異是否真實(shí)存在還需要增加樣本量或檢查尿液中無機(jī)鹽的濃度加以確定[3]。在由具有尿素酶的奇異變形桿菌、銅綠假單胞菌、肺炎克雷伯菌等引起的泌尿系統(tǒng)感染患者的尿液中均有磷酸銨鎂結(jié)晶形成，而在由不具有尿素酶的大腸埃希菌和腸球菌引起的泌尿系統(tǒng)感染患者的尿液中沒有磷酸銨鎂結(jié)晶形成或形成較少。本研究結(jié)果顯示，具有不同產(chǎn)尿素酶能力的細(xì)菌在無結(jié)晶的尿液中繁殖時(shí)其磷酸銨鎂結(jié)晶的形成能力不相同，解脲棒狀桿菌于24 h形成結(jié)晶例數(shù)最多，隨著時(shí)間增加例數(shù)沒有增加，這是由于解脲棒狀桿菌具有豐富的尿素酶之故。奇異變形桿菌形成結(jié)晶例數(shù)次之，銅綠假單胞菌和肺炎克雷伯菌形成結(jié)晶例數(shù)最少，隨著繁殖時(shí)間的延長形成結(jié)晶的例數(shù)增加。體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，解脲棒狀桿菌在無磷酸銨鎂結(jié)晶的尿液中繁殖后可見方柱狀、立方體、未成形羽毛狀、洋信封狀等不同形態(tài)結(jié)晶，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，磷酸銨鎂結(jié)晶體積變大、變厚、聚集，趨向形成結(jié)石，可見解脲棒狀桿菌在引起泌尿系統(tǒng)感染和感染后形成感染性結(jié)石的過程中具有重要作用。正常人尿液中包含有機(jī)物和無機(jī)物的代謝產(chǎn)物，如尿素、氨基酸、肌酐、尿酸等和Na+、K+、Cl-、PO3-、Mg2+、SO4

2-等，有些物質(zhì)可作為細(xì)菌生長所必須的營養(yǎng)物質(zhì)和磷酸銨鎂結(jié)晶形成的無機(jī)鹽類。解脲棒狀桿菌具有豐富的尿素酶，可迅速分解尿素產(chǎn)氨，使尿液pH值增加，以利于細(xì)菌生長，尿液在短時(shí)間內(nèi)呈堿性，氨與水結(jié)合形成銨離子、碳酸離子，銨與尿中鎂離子和磷酸根結(jié)合，形成磷酸銨鎂結(jié)晶以及碳酸磷灰石結(jié)晶等，進(jìn)而形成感染性結(jié)石。磷酸銨鎂等鹽類形成的感染性結(jié)石生長比較快、復(fù)發(fā)率高，給患者帶來巨大的痛苦。分離出解脲棒狀桿菌的患者多具有男性、高齡、長期留置導(dǎo)尿管的特點(diǎn)，臨床應(yīng)引起重視。老年人排尿不暢，長期留置導(dǎo)尿管或尿路任何部位的狹窄、梗阻、憩室都可使尿液滯留，而尿液滯留繼發(fā)泌尿系統(tǒng)感染，泌尿系統(tǒng)感染又有利于結(jié)石形成[4]。

解脲棒狀桿菌是條件致病菌，可引起人體急性膀胱炎、結(jié)痂性膀胱炎、潰瘍結(jié)痂性腎盂腎炎、尿路結(jié)石等泌尿系統(tǒng)感染。解脲棒狀桿菌在血瓊脂平板上生長緩慢，24 h菌落細(xì)小或沒有形成可見的菌落，在常規(guī)細(xì)菌培養(yǎng)中容易被漏檢。在留取尿液時(shí)樣本常會(huì)受到尿道口快速生長細(xì)菌的污染，與其他快速生長細(xì)菌和真菌混合感染時(shí)，其他細(xì)菌迅速生長會(huì)掩蓋解脲棒狀桿菌的生長，這也是在泌尿系統(tǒng)感染病原菌統(tǒng)計(jì)結(jié)果中很少有解脲棒狀桿菌的原因。本研究結(jié)果顯示有4株解脲棒狀桿菌與腸球菌、大腸埃希菌和白念珠菌混合生長。解脲棒狀桿菌呈多重耐藥[5]，對(duì)于特定的人群，如老年、男性以及長期留置導(dǎo)尿管的患者更應(yīng)重視，積極進(jìn)行尿沉渣鏡檢和細(xì)菌培養(yǎng)，避免形成持續(xù)慢性感染，防止結(jié)晶、結(jié)石形成，因此臨床和實(shí)驗(yàn)室應(yīng)當(dāng)密切聯(lián)系，共同提高解脲棒狀桿菌的檢出率，使患者早日得到正確的診斷和治療。

呂純莉等[6]報(bào)道影響尿有形成分分析儀檢測(cè)的因素很多，聯(lián)合使用尿干化學(xué)和尿有形成分分析，也不能完全代替人工顯微鏡檢查。結(jié)晶是尿沉渣分析項(xiàng)目之一，但由于磷酸銨鎂結(jié)晶等結(jié)晶不會(huì)被染色、大小不等、呈復(fù)合多面內(nèi)部結(jié)構(gòu)，在全自動(dòng)尿有形成分分析儀常規(guī)檢驗(yàn)中不能被明確種類。當(dāng)由具有尿素酶的細(xì)菌引起泌尿系統(tǒng)感染時(shí)，尿常規(guī)顯示尿液pH值＞7.0，并含大量白細(xì)胞、紅細(xì)胞、細(xì)菌及結(jié)晶[7]；解脲棒狀桿菌引起感染的尿常規(guī)顯示尿液pH值≥8.0，白細(xì)胞和細(xì)菌或結(jié)晶陽性。臨床和實(shí)驗(yàn)室對(duì)特定人群應(yīng)重視尿沉渣鏡檢和細(xì)菌培養(yǎng)，明確磷酸銨鎂結(jié)晶的存在和細(xì)菌種類，積極早期預(yù)防或依照藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行抗菌藥物治療，有效控制感染和防止感染性結(jié)石的形成。

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