慢性間歇性低氧對(duì)麻醉大鼠心血管系統(tǒng)的影響

，， ，

(四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院,四川省人民醫(yī)院麻醉科，四川 成都 610072)

阻塞性睡眠呼吸暫停綜合征(obstructive sleepapnea syndrome，OSAS)是一種臨床上常見的疾病，在中老年人群的患病率為4%左右。冠心病、高血壓、充血性心力衰竭等多種心臟疾病是OSAS的重要危險(xiǎn)因素[1-3]?，F(xiàn)有的睡眠呼吸暫停的基礎(chǔ)及臨床研究發(fā)現(xiàn)，夜間反復(fù)的低氧復(fù)氧可導(dǎo)致交感神經(jīng)驅(qū)動(dòng)增加、氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)的發(fā)生，誘導(dǎo)了心血管系統(tǒng)的損害[4]，但是睡眠呼吸暫?；颊咝墓δ墚惓５南嚓P(guān)機(jī)制還不是很明確。OSAS致器官損傷的一個(gè)重要機(jī)制是慢性間歇低氧(chronicintermittent hypoxygen，CIH)[4]，而麻醉狀態(tài)下慢性間歇性低氧大鼠是能夠較好反映睡眠呼吸暫停反復(fù)低氧血癥的動(dòng)物模型，近幾年來(lái)被廣泛用于睡眠呼吸暫停的基礎(chǔ)研究中[5]。本研究旨在通過(guò)建立慢性間歇性低氧麻醉大鼠模型，模擬睡眠呼吸暫停反復(fù)低氧和復(fù)氧的病理生理過(guò)程，探討慢性間歇性低氧對(duì)麻醉大鼠心血管功能的改變，及其與心肌細(xì)胞凋亡的關(guān)系，從而探討睡眠呼吸暫停對(duì)心血管功能的影響及發(fā)生機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物、儀器與試劑

健康成年雄性SD大鼠72只，動(dòng)物合格證編號(hào)(72915502616)，體質(zhì)量(284.45±14.78)g。所用儀器和試劑包括YS-1型數(shù)字式測(cè)氧儀、血壓計(jì)、恒溫加熱箱、超聲儀、硝酸還原酶、內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)試劑盒。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組 72只雄性SD大鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法分成3組，每組24只，分別為常氧對(duì)照組(對(duì)照組)、常氧麻醉組(模型組)和慢性間歇低氧組(低氧組)。對(duì)照組呼吸正?？諝?；模型組給予10%水合氯醛0.3 mL/kg腹腔注射麻醉；低氧組在模型組的基礎(chǔ)上給予8 h/d慢性間歇低氧刺激，每天重復(fù)麻醉并低氧刺激。7 d后處死大鼠，取血漿及心臟標(biāo)本用于檢驗(yàn)。

1.2.2 低氧模型的構(gòu)建 通過(guò)氮?dú)庀♂屧?，在CIH艙中放置SD大鼠，并循環(huán)充入壓縮空氣45 s和氮?dú)?5 s，90 s循環(huán)周期，并通過(guò)調(diào)節(jié)氣體流量，使每一循環(huán)艙內(nèi)最低氧濃度達(dá)5%，然后逐漸恢復(fù)至21%，其中使用YS-1型數(shù)字式測(cè)氧儀測(cè)定氧濃度。在相同的有機(jī)玻璃艙內(nèi)放置對(duì)照組和模型組大鼠，并向艙內(nèi)循環(huán)充入壓縮空氣。

1.2.3 病理觀察 取血后立即將大鼠心臟游離，稱重后留取左心室固定、包埋、切片，行HE染色后光鏡200倍觀察心肌細(xì)胞形態(tài)、排列和炎癥現(xiàn)象并攝片。

1.2.4 心肌細(xì)胞凋亡檢測(cè) 采用缺口末端標(biāo)記法檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡率。摘取心臟標(biāo)本后用4%多聚甲醛固定24 h，常規(guī)石蠟包埋，切片脫蠟入水后用蛋白酶K(20)消化15 min；1%H2O甲醇溶液封閉內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，加入20 μL TUNEL混合液，37 ℃孵化1 h，TBS液漂洗，封閉，加入生物素標(biāo)記抗地高辛抗體50 μL，37 ℃孵化30 min，TBS漂洗，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，計(jì)算凋亡率。凋亡指數(shù)=(凋亡陽(yáng)性細(xì)胞核數(shù)/總細(xì)胞核數(shù))×100%。

1.2.5 血壓測(cè)定 于實(shí)驗(yàn)前和實(shí)驗(yàn)最后1 d結(jié)束時(shí)采用無(wú)創(chuàng)鼠尾動(dòng)脈血壓測(cè)量法測(cè)量大鼠尾動(dòng)脈收縮壓和舒張壓，連續(xù)測(cè)量3次取平均值。

1.2.6 超聲心動(dòng)圖檢測(cè)左心室射血分?jǐn)?shù)和左心室舒張期及收縮末期內(nèi)徑 使用大鼠超聲儀，在胸骨旁短軸二尖瓣腱索水平引出M型曲線并進(jìn)行測(cè)量左心室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)、左心室舒張期內(nèi)徑(LVID)及左心室收縮末期內(nèi)徑(LVDs)，連續(xù)測(cè)量3次取平均值。

1.2.7 左心室內(nèi)壓最大上升速率和最大下降速率檢測(cè) 采用經(jīng)左心室心尖部插管到達(dá)左心室，測(cè)量反映左心室內(nèi)壓最大上升率(dp/dtmax)和最大下降率(-dp/dtmax)的指標(biāo)的方法，此方法需要進(jìn)行開胸手術(shù)，暴露心臟，因此要用小動(dòng)物人工呼吸機(jī)輔助呼吸。

1.2.8 紅細(xì)胞和紅細(xì)胞壓積指標(biāo)檢測(cè) 麻醉開腹后用粗紗布去除腹部筋膜和其他組織，找到下腔靜脈迸行采血，取血后在離心機(jī)上以3 500 r/min離心15 min，取上層血清并儲(chǔ)存于-80 ℃，直到下次進(jìn)行血清指標(biāo)的分析時(shí)取出，用全自動(dòng)血液分析儀測(cè)定紅細(xì)胞(RBC)和紅細(xì)胞壓積(HTC)。

1.2.9 心肌酶譜指標(biāo) 各組大鼠麻醉后行腹主動(dòng)脈取血5 mL，于全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)心肌酶譜4項(xiàng)指標(biāo)：肌酸激酶(CK)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)、乳酸脫氫酶(LDH)、羥丁酸脫氫酶(HBDH)的含量。

1.2.10 血液學(xué)檢測(cè) 心臟超聲檢查結(jié)束后立即處死大鼠，直接心臟取血，肝素抗凝。1 600 r/min離心5 min后取上清液，-80 ℃保存待測(cè)。血漿NO含量的測(cè)定采用硝酸還原酶測(cè)定法，血漿內(nèi)皮素-1、內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)測(cè)定采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)，按說(shuō)明書進(jìn)行操作。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 大鼠心臟HE染色

對(duì)照組大鼠心肌形態(tài)正常，細(xì)胞排列均勻，未見腫脹和炎癥；模型組大鼠心肌細(xì)胞排列輕度較均勻，未出現(xiàn)肥大和炎性改變；低氧組大鼠心肌細(xì)胞變形，排列不均勻，細(xì)胞核大深染，心肌組織有比較明顯的炎性變化(圖1)。

a：對(duì)照組；b：模型組；c:低氧組

2.2 大鼠心肌細(xì)胞凋亡的影響

模型組大鼠心肌細(xì)胞凋亡率與對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，低氧組大鼠心肌細(xì)胞凋亡率明顯高于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖2。

*：與模型組比較，P<0.05

2.3 各組大鼠鼠尾血壓比較

各組大鼠尾動(dòng)脈舒張壓比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與對(duì)照組比較，模型組大鼠尾動(dòng)脈收縮壓變化不明顯，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，低氧組大鼠尾動(dòng)脈收縮壓明顯高于對(duì)照組和模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

表1 各組大鼠鼠尾血壓比較±s，n=24，mmHg)

*：與對(duì)照組和模型組比較，P<0.05

2.4 各組大鼠超聲心動(dòng)圖比較

低氧組大鼠的LVEF顯著低于對(duì)照組和模型組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。超聲檢測(cè)值提示低氧組大鼠LVID稍微變大，左心腔擴(kuò)大，舒張功能尚正常，低氧組和模型組的LVDs均明顯高于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

表2 各組大鼠超聲心動(dòng)圖的比較±s,n=24)

*：與對(duì)照組和模型組比較，P<0.05

2.5 氧化應(yīng)激指標(biāo)的比較

與對(duì)照組比較，模型組的丙二醛(MDA)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-PX)和過(guò)氧化物歧化酶(SOD)變化不明顯，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。低氧組的血清MDA、GSH-PX和SOD顯著高于模型組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表3。

表3 各組大鼠氧化應(yīng)激指標(biāo)的比較±s,n=24)

*：與模型組比較，P<0.05

2.6 大鼠血液指標(biāo)的比較

低氧組的血清內(nèi)皮素-1水平顯著高于對(duì)照組和模型組，而對(duì)照組和模型組變化不明顯，低氧組的血清NO2-/NO3-總和顯著低于對(duì)照組和模型組，而模型組也明顯低于對(duì)照組。低氧組的血清e(cuò)NOS水平顯著低于對(duì)照組和模型組，而對(duì)照組和模型組變化不明顯，見表4。

2.7 各組大鼠RBC、HCT、dp/dtmax和-dp/dtmax的變化

表5顯示，與對(duì)照組比較，模型組大鼠RBC、HCT、dp/dtmax和-dp/dtmax變化不明顯，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。低氧組大鼠的RBC、HCT顯著高于對(duì)照組和模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而低氧組大鼠的dp/dtmax和-dp/dtmax顯著低于對(duì)照組和模型組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表4 各組大鼠血液指標(biāo)的比較±s,n=3)

*：與模型組比較，P<0.05；#：與對(duì)照組比較，P<0.05

2.8 心肌酶譜指標(biāo)的比較

與對(duì)照組比較，模型組大鼠的肌酸激酶(CK)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)、乳酸脫氫酶(LDH)、羥丁酸脫氫酶(HBDH)的變化不明顯，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，低氧組大鼠的血清CK、CK-MB和LDHD顯著高于模型組，HBDH顯著低于對(duì)照組，差異具有極顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見表6。

表5 各組血液RBC、HCT、血流動(dòng)力學(xué)dp/dtmax、-dp/dtmax 的變化±s,n=24)

*：與模型組比較，P<0.05

*：與模型組比較，P<0.01

3 討論

夜間長(zhǎng)期、反復(fù)且間斷的低氧容易導(dǎo)致機(jī)體各系統(tǒng)疾病的發(fā)生，這使得OSAHS成為造成機(jī)體損害的主要病理因素，對(duì)人類健康和生命構(gòu)成嚴(yán)重威脅[6]。有研究發(fā)現(xiàn)患有睡眠呼吸暫?；颊邥?huì)出現(xiàn)血壓升高、左室肥厚和左心功能不全等癥狀[7]，在麻醉過(guò)程中模擬慢性間歇性低氧的大鼠也出現(xiàn)了相似的癥狀，如大鼠心肌細(xì)胞排列不均勻，肥大、腫脹、核大深染、變形，心肌組織有明顯炎性改變，大鼠尾動(dòng)脈收縮壓明顯增加，超聲檢測(cè)值提示低氧組大鼠LVID稍微變大，左心腔擴(kuò)大，且血流指標(biāo)檢測(cè)均出現(xiàn)異常。有研究通過(guò)對(duì)慢性間歇性低氧大鼠進(jìn)行心導(dǎo)管檢查發(fā)現(xiàn)[8]，在進(jìn)行低氧干預(yù)后，大鼠的左心室舒張末期壓力水平出現(xiàn)了明顯升高的趨勢(shì)，dp/dtmax和心輸出量降低明顯，這意味著間歇性低氧能夠誘導(dǎo)左心功能不全的發(fā)生。有學(xué)者在全身麻醉狀態(tài)下通過(guò)用氣管套管鉗夾犬氣管[9]，通過(guò)3個(gè)月反復(fù)的模擬氣道阻塞睡眠呼吸暫停實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示大鼠的LVEF下降明顯，也得出了間歇性低氧可引起左心功能降低的可能機(jī)制，但左心室功能受損的機(jī)制目前尚不清楚。Chen等[10]每天將大鼠暴露于慢性間歇低氧(最低氧濃度4%～5%)8 h，共持續(xù)5周，定期測(cè)量血壓和心率發(fā)現(xiàn)，第2周時(shí)間歇性低氧組血壓高于對(duì)照組，但在第5周實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)這種動(dòng)脈收縮壓的差別消失，表明左心室功能不全可能不是由高血壓、左心室肥厚引起，而是與反復(fù)低氧復(fù)氧直接引起心肌細(xì)胞損傷有關(guān)。

血管內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生和分泌的內(nèi)皮素-1是具有強(qiáng)烈的縮血管作用[11]。NO與內(nèi)皮素-1是相拮抗的內(nèi)皮源性舒張因子，由eNOS催化底物L(fēng)-精氨酸合成。血管張力和血液動(dòng)力學(xué)的調(diào)節(jié)是內(nèi)皮素-1和NO共同參與的，可以有效反映血管內(nèi)皮功能[12]。在OSAS的特征性的慢性間歇低氧過(guò)程中，過(guò)多氧自由基的產(chǎn)生打破了氧的平衡，導(dǎo)致氧化應(yīng)激的發(fā)生，大大增加OSAHS患者患心血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)[13]。本研究結(jié)果顯示低氧干預(yù)使心肌氧化應(yīng)激水平增高，心功能損傷，內(nèi)皮功能紊亂且伴隨著血壓的升高，且這一系列的病理生理改變并不是獨(dú)立存在的，而是具有一定的關(guān)聯(lián)性[14-16]；這種損傷可能通過(guò)氧化應(yīng)激引起血清內(nèi)皮素-1、NO含量失衡，導(dǎo)致內(nèi)皮功能障礙，進(jìn)而損傷心肌有關(guān)。

心電圖與心肌酶譜變化可在一定程度上反映心臟損傷的輕重[17-18]，當(dāng)心電圖明顯異?；蛐募∶竿皆龈?，尤其當(dāng)兩者同時(shí)變化時(shí)，提示損傷嚴(yán)重[19]。本研究結(jié)果表明，間歇性低氧可以使左心射血分?jǐn)?shù)降低，心肌酶水平不同程度增高，這說(shuō)明低氧可能會(huì)抑制心功能。本實(shí)驗(yàn)考察了間歇性低氧對(duì)大鼠心電圖和心肌酶譜的毒性作用，且在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)心功能檢測(cè)指標(biāo)在心臟損傷時(shí)的作用機(jī)制尚未完全清楚，這需要更全面、深入的研究間歇性低氧對(duì)心臟的影響。

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