七氟醚聯(lián)合氧化亞氮吸入麻醉致腦功能下降與CREB信號通路的關(guān)系

，， ，，

[1.陸軍軍醫(yī)大學(xué)(第三軍醫(yī)大學(xué))第二附屬醫(yī)院急診科，重慶 400037；2.陸軍軍醫(yī)大學(xué)(第三軍醫(yī)大學(xué))第二附屬醫(yī)院麻醉科，重慶 400037；3.陸軍軍醫(yī)大學(xué)(第三軍醫(yī)大學(xué))第二附屬醫(yī)院呼吸科，重慶 400037]

學(xué)習(xí)和記憶屬于高等動物腦功能的一部分，研究表明麻醉患者腦功能損害時有發(fā)生，主要表現(xiàn)在空間記憶以及學(xué)習(xí)能力的下降[1]，但對不同人群不同麻醉方式產(chǎn)生效應(yīng)的研究卻較為有限，對分子機制的認識也較為局限。既往研究表明環(huán)腺苷酸應(yīng)答元件結(jié)合蛋白(cAMP response element binding protein，CREB)磷酸化與神經(jīng)元的數(shù)量、功能、再生、凋亡密切相關(guān)[2]，而記憶學(xué)習(xí)又受海馬區(qū)神經(jīng)元直接相調(diào)控，所以CREB或直接影響著學(xué)習(xí)和記憶的功能[3-5]。有文獻報道環(huán)磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate，cAMP)對細胞代謝的調(diào)節(jié)十分廣泛，其反應(yīng)蛋白CREB參與多條細胞代謝過程[6]，然而CREB是否參與吸入麻醉所致的腦功能損害尚不明確。本研究通過臨床試驗和動物實驗比較七氟醚聯(lián)合氧化亞氮吸入麻醉后對CREB表達及空間學(xué)習(xí)記憶運動影響，探討腦功能致?lián)p的潛在機制，同時對不同麻醉方式、不同麻醉人群以及麻醉時長做了初步研究，為七氟醚聯(lián)合氧化亞氮吸入麻醉致腦功能下降提供可能的防治策略。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選擇我院急診科2014年1月至2017年4月收治的442例患者，按照麻醉方式的不同分為3組。吸入麻醉組118例采用七氟醚聯(lián)合氧化亞氮麻醉，其中男60例，女58例，年齡17～78歲，平均(42.2±9.8)歲；體質(zhì)量(62.3±15.2)kg，身高(167.4±8.8)cm。局部麻醉組206例采用普魯卡因麻醉，其中男101例，女105例，年齡22～76歲，平均(43.4±6.9)歲，體質(zhì)量(57±9)kg，身高(162.5±4.8)cm。對照組118例不做麻醉處理，其中男64例，女54例，年齡19～77歲，平均(44.2±6.8)歲，體質(zhì)量(67.3±13.4)kg，身高(169.4±9.1)cm。所有患者心肺功能良好，肝腎功能及電解質(zhì)等各項檢查均提示耐受麻醉及手術(shù)，排除重要臟器功能障礙、精神異常、感覺存在障礙、智力低下者。3組患者比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

1.2 實驗動物

實驗大鼠購于第三軍醫(yī)大學(xué)動物實驗中心，使用許可證號為SYXK(渝)2012-0002，動物實驗通過實驗動物管理委員會批準并在第三軍醫(yī)大學(xué)動物實驗中心完成。大鼠飼養(yǎng)置于SPF級動物房，室溫25 ℃，濕度60%，食物滅菌。

1.3 實驗試劑

兔抗鼠cAMP、CREB、pCREB單抗、β-actin抗體(內(nèi)參)以及ELISA Kit酶聯(lián)免疫試劑盒購自美國Santa Cruz biotechnology公司，生物素化抗兔IgG抗體，購自北京方盛公司，蛋白濃度測定試劑盒、組織蛋白抽提試劑盒、BCA顯色試劑盒購自Beyotime上海分公司，PVDF膜購自德國MC公司，蛋白上樣緩沖SDS-PAGE液凝膠配制試劑盒、化學(xué)發(fā)光試劑盒、苯甲基磺酰氟(PMSF)均購自碧云天生物技術(shù)公司。

1.4 ELISA 法檢查血液標本中cAMP表達情況

靜脈穿刺獲取入組人員外周血5 mL于抗凝管內(nèi)，4 ℃保存，按Innogenetics公司生物診斷試劑人cAMP ELISA試劑盒說明書操作，450 nm讀取結(jié)果，Lowry法計算目的蛋白含量。

1.5 Morris 水迷宮實驗

所有動物實驗操作均遵守第三軍醫(yī)大學(xué)動物管理委員會關(guān)于動物實驗的相關(guān)規(guī)定。60只5月齡大鼠隨機分為麻醉組(n=30)和對照組(n=30)。麻醉組大鼠持續(xù)吸入1.3%七氟醚聯(lián)合50%氧化亞氮4 h，對照組吸入50%氧氣4 h，流量3 L/min。麻醉過程保留自主呼吸。大鼠Morris水迷宮主要設(shè)備包括：①1個裝有水的圓形水池，其直徑100 cm、高50 cm，水深25 cm，水溫(26.0±1.0)℃；②隱藏在水面下1 cm的透明平臺(平臺所在象限定義為四象限)；③1套圖像自動采集和處理系統(tǒng)。水迷宮訓(xùn)練過程包括定位航行實驗和空間探索。開始3 d讓大鼠適應(yīng)周圍環(huán)境，每天將大鼠面向池壁隨機從4個象限放入水中4次，通過攝像系統(tǒng)自動記錄并應(yīng)用相應(yīng)軟件分析其游泳軌跡，大鼠尋找平臺的最大時限設(shè)定為2 min，登臺5 s視為成功找到隱蔽平臺，攝像系統(tǒng)自動停止記錄。平臺停留1 min，以提供時間讓大鼠觀察周圍提示物，然后開始下一次訓(xùn)練。保證所有大鼠的訓(xùn)練間隔時間一致。如大鼠在1 min內(nèi)未找到隱蔽平臺，攝像系統(tǒng)自動停止記錄，逃避潛伏期(自入水至尋找到隱蔽平臺的時間)記為1 min。空間探索實驗分別在第3天、1個月、3個月進行去除平臺，然后任選2個入水點將大鼠放入水池中，記錄其在1 min內(nèi)的游泳軌跡。取2次的平均值作為空間探索實驗的結(jié)果。根據(jù)系統(tǒng)自動分析的結(jié)果，在空間探索實驗中平臺象限游泳距離占總距離百分比大于30%，認為大鼠對提示物和平臺空間位置關(guān)系形成記憶。

1.6 Western blot檢測cAMP、CREB、pCREB蛋白的表達

大鼠斷頭取腦，并研磨之后，充分裂解，BCA法測定蛋白濃度及蛋白變性。選用BCA試劑盒，計算待測蛋白的濃度。計算濃度后充分變性，低溫冰箱保存，根據(jù)檢測出的蛋白濃度，配平各蛋白，蛋白電泳，轉(zhuǎn)膜孵育一抗以及二抗。之后根據(jù)BCA說明書加入適量的發(fā)光液，進行曝光并采集圖像，采用Quantity One軟件進行灰度值分析，目的蛋白相對表達水平則通過目的蛋白的灰度值除以內(nèi)參蛋白(本實驗內(nèi)參采用β-actin)的灰度值的比值表示。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 吸入麻醉組麻醉前與麻醉后血液中cAMP濃度比較以及MMSE評分情況

吸入麻醉組患者麻醉前與麻醉后比較，麻醉后血液中cAMP濃度下降，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；麻醉后定向力、記憶力、語言能力MMSE評分下降，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；計算能力評分變化差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表1。

表1吸入麻醉組患者麻醉前后血液中cAMP濃度及MMSE評分(n=118)

時間 cAMP濃度(μg/ mL)MMSE評分(分)定向力記憶力語言能力計算能力麻醉前0.71±0.158.21±0.953.21±1.157.04±0.854.21±1.35麻醉后0.54±0.187.15±0.962.11±0.755.21±0.974.17±1.22t 7.8818.5258.70315.4130.238P 0.0410.0370.0360.0200.425

2.2 各組患者麻醉后cAMP濃度比較以及MMSE評分情況

吸入麻醉組麻醉后血液中cAMP濃度較局部麻醉組和對照組比較均下降，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，且麻醉后定向力、記憶力、語言能力MMSE評分下降，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，計算能力評分變化差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表2。

2.3 吸入麻醉患者中高齡組與低齡組cAMP濃度變化比較以及MMSE評分變化情況

高齡組患者(>50歲)72例與低齡組(<50歲)46例比較，高齡組液中cAMP濃度變化更大，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；麻醉后定向力、記憶力、語言能力MMSE評分變化更大，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，計算能力評分變化差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表3。

2.4 吸入麻醉患者中長時間麻醉組與短時間麻醉組cAMP濃度以及MMSE評分變化情況

麻醉長時間組(>2 h)68例與短時間組(<2 h)50例比較，長時間組中cAMP濃度變化更大，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；麻醉后定向力、記憶力、語言能力MMSE評分變化更大，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，計算能力評分變化差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表4。

2.5 水迷宮實驗

在定位航行實驗中，麻醉組大鼠找到平臺的潛伏期比對照組找到平臺時間(平臺潛伏期)長，麻醉組穿越平臺的次數(shù)比對照組大鼠少，麻醉組大鼠2 min內(nèi)在水迷宮中的運動距離比對照組大鼠少，2組比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，且麻醉組各項指標變化呈時間相關(guān)性(表5～7)。

表2 各組患者cAMP濃度及MMSE評分

*:與局部麻醉組比較，P<0.05；#：與對照組比較，P<0.05

表4 吸入麻醉患者中長時間組與短時間組cAMP濃度變化及MMSE評分變化

組別 平臺潛伏期(min)越平臺的次數(shù)(次)運動距離(cm)麻醉組68.01±7.899.03±1.821 351.68±141.81對照組32.21±5.2516.61±3.511 751.03±181.49t 20.69010.5009.497P 0.0150.0300.034

組別 平臺潛伏期(min)越平臺的次數(shù)(次)運動距離(cm)麻醉組78.01±9.198.03±1.371 157.68±181.51對照組29.21±4.5118.91±2.111 651.03±201.87t 26.11011.4789.954P 0.0120.0260.031

組別 平臺潛伏期(min)越平臺的次數(shù)(次)運動距離(cm)麻醉組87.51±8.156.21±1.54911.51±151.82對照組30.21±5.5817.65±2.911 798.03±191.53t 30.84011.98719.866P 0.0100.0260.016

2.6 Western blot檢測cAMP、pCREB、CREB蛋白相對表達水平

Western blot檢測結(jié)果顯示，麻醉組大鼠cAMP、pCREB蛋白相對表達水平均低于對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，2組大鼠CREB蛋白相對表達水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(圖1、圖2)。

β-actin為內(nèi)參對照

*：與麻醉組比較，P<0.05

3 討論

術(shù)后認知功能障礙是麻醉后一種常見的并發(fā)癥，但其發(fā)生與麻醉方式、計量、時間的關(guān)系并不十分明確，其發(fā)病機制也有待進一步研究。神經(jīng)細胞凋亡、半胱天冬酶的激活、神經(jīng)變性、Aβ的沉積、cAMP-CREB-AKT通路的抑制都與阿爾茲海默癥的發(fā)生相關(guān)，都參與了腦功能的調(diào)節(jié)[7]，其中CREB是細胞核內(nèi)的轉(zhuǎn)錄因子蛋白的重要成員，參與了cAMP-CREB-AKT偶聯(lián)信號通路的激活，通過對ser133位點磷酸化的調(diào)控使其發(fā)揮調(diào)控作用，增強了神經(jīng)元鈉/鉀-ATP泵的活性，達到增強神經(jīng)元興奮性，提高學(xué)習(xí)記憶能力[8]，此外該通路還能促進神經(jīng)元間突觸聯(lián)系形成，增加特異性突觸偶聯(lián)加強中樞神經(jīng)系統(tǒng)的傳導(dǎo)、儲存。有研究表明抑制CREB表達，對大鼠長期記憶起到顯著抑制作用，但短期記憶仍相對完整[9-10]，這是因為磷酸化CREB (p-CREB)能在mRNA調(diào)控下，轉(zhuǎn)錄并編碼蛋白，其中一部分對維持學(xué)習(xí)和長期記憶有明顯作用[11]。本研究發(fā)現(xiàn)吸入麻醉組患者麻醉后血液中cAMP濃度下降、定向力、記憶力、語言能力MMSE評分下降且差異顯著，計算能力評分差異不顯著，這就證實七氟醚、氧化亞氮等吸入性麻醉藥物確實能降低體內(nèi)cAMP濃度，并直接影響定向力、記憶力、語言能力，也就是說麻醉藥物可能導(dǎo)致了體內(nèi)cAMP濃度改變，cAMP-CREB-AKT偶聯(lián)信號通路可能參與到了腦功能的調(diào)控。同時，吸入麻醉組血液中cAMP濃度較另兩組下降、麻醉后定向力、記憶力、語言能力MMSE評分下降且差異顯著，由此可見七氟醚、氧化亞氮等吸入性麻醉藥物可能是下調(diào)cAMP的關(guān)鍵因素，其效果較其他麻醉方式更顯著，且患者年齡越大，麻醉時間越長，cAMP的下降及腦功能損害也越嚴重。動物實驗發(fā)現(xiàn)麻醉組大鼠找到平臺的潛伏期比對照組找到平臺時間長，穿越平臺的次數(shù)及運動距離卻比對照組少且麻醉組各項指標變化呈時間相關(guān)性，提示吸入麻醉所致的腦功能損害隨時間推移損害加重。Western blot檢測結(jié)果顯示麻醉組cAMP、pCERB蛋白相對表達水平均低于對照組，這可能與CAMP/CREB信號通路減弱，導(dǎo)致pCREB促進新生神經(jīng)細胞的增殖與發(fā)育成熟的過程相關(guān)[12-13]。綜上所述七氟醚聯(lián)合氧化亞氮急診吸入麻醉致腦功能下降與受麻醉者的年齡以及接受麻醉時間相關(guān)，而致腦功能下降的原因可能是增加了核內(nèi)第二信使CAMP的水解，從而導(dǎo)致其介導(dǎo)的CREB蛋白發(fā)生磷酸化水平降低。故在臨床治療過程中，對于不同的受麻醉群體，應(yīng)當(dāng)盡量選擇更合理的麻醉方式，尤其老年患者應(yīng)盡量縮短其麻醉時間[14]。而麻醉后腦功能障礙是否能通過人為對cAMP-CREB-AKT偶聯(lián)信號通路的干預(yù)而發(fā)生逆轉(zhuǎn)也是值得研究的方向。

[參考文獻]

[1] Zhou Q,Zhou P,Wang AL,et al.The primed SNARE-complexin-synaptotagmin complex for neuronal exocytosis[J].Nature,2015,525(7567):62.doi.10.1038/nature23484.

[2] Y Tang,X Yu,B Zhou,D Lei,et al.Short-term cognitive changes after surgery in patients with unilateral mesial temporal lobe epilepsy associated with hippocampal sclerosis[J].J Clin Neurosci,2014,21(8):1413-1418.doi:10.1016/j.jocn.2013.12.018.

[3] Brightwell JJ,Smith CA,Neve RL,et al.Long-term memory for place learning is facilitated by expression of camp response element-binding protein in the dorsal hippocampus[J].Learn Mem,2007,14(3):195-199.doi.10.1101/lm.395407.

[4] Li YF,Huang Y,Amsdell SL,et al.Antidepressant and anxiolytic-like effects of the phosphodiesterase-4 inhibitor rolipram on behavior depend on cyclic amp response element binding protein-mediated neurogenesis in the hippocampus[J].Neuropsychopharmacology,2009,34(11):2404-2419.doi:10.1038/npp.2009.66.

[5] Otmakhov N,Khibnik L,Otmakhova N,et al.Forskolin-induced Itp in the cal hippocampal region is nmda receptor dependent[J].Neurophysiol,2004,91(5):1955-1962.doi:10.1152/jn.00941.2003.

[6] Lonze BE,Riccio A,Cohen S,et al.Apoptosis,axonal growth defects,and degeneration of peripheral neurons in mice lacking creb[J].Neuron,2002,34(3):371-385.doi:10.1016/S0896-6273(02)00686-4.

[7] Vlisides P,Xie Z.Neurotoxicity of general anesthetics:an update[J].Curr Pharm Des,2012,18(38):6232 -6240.doi:10.2174/138161212803832344.

[8] Guo J,Wang H,Wang Q,et al.Expression of pCREBand activity dependent miR132 in temporal lobe epilepsy[J].Int J Clin Exp Med,2014,7(5):1297-1306.

[9] Carlezon WA Jr,Duman RS,Nestler EJ.The many faces of creb[J].Neurosci,2005,28(8):436-445.

[10] Brightwell JJ,Smith CA,Countryman RA,et al.Hippocampal overexpression of mutant creb blocks loner term,but not short-term memory for a socially transmitted food preference[J].Learn Mem,2005,12(1):12-17.doi:10.1101/lm.85005.

[11] Fujioka T,Fujioka A,Duman RS.Activation of maturation of newborn neurons in adult hippocampus camp signaling facilitates the morphological[J].Neurosci,2004,24(2):319-328.doi:10.1523/JNEUROSCI.1065.03.2004.

[12] Dong Y,Wu X,Zhang G,et al.Isofluranefacilitates synaptic NMDA receptor endocytosis in mice primary neurons[J].Curr Mol Med,2013,13(4):488-498.doi:10.2174/1566524011313040003.

[13] Liu J,Wang P,Zhang X,et al.Effects of different concentration and duration time of isoflurane on acute and long-term neurocognitve function of young adult C57BL/6 mouse[J].Int J Clin Exp Pathol,2014,7(9):5828-5836.

[14] 張 英,陳 杰,文欣榮,等.2種麻醉方式對老年腔隙性梗死患者術(shù)后知期認識功能的影響[J].局解手術(shù)學(xué)雜志,2016,25(11):841-843.doi:10.11659/jjssx.06E016017.