不同力學(xué)刺激對T2DM小鼠骨中TGF-β/Smad途徑及骨形成的影響

陳祥和, 彭海霞, 孫 朋, 李世昌

(1. 揚州大學(xué) 體育學(xué)院，江蘇 揚州 225127；2. 華東師范大學(xué) “青少年健康評價與運動干預(yù)”教育部重點實驗室，上海 200241)

Ⅱ型糖尿病(type 2 diabetes mellitus, T2DM)是一種內(nèi)分泌代謝疾病，其發(fā)病與胰島素抵抗、胰島β細胞功能受損有關(guān)[1]。T2DM抑制成骨細胞(osteoblast, OB)分化產(chǎn)生及骨形成[2]。在生命醫(yī)學(xué)領(lǐng)域內(nèi)，探究T2DM抑制OB分化產(chǎn)生和骨形成分子調(diào)控機制的相關(guān)研究較多，但其信號調(diào)控網(wǎng)絡(luò)仍不完善。轉(zhuǎn)化生長因子(transforming growth factor-β, TGF-β) /Smad是調(diào)控骨形成的重要途徑，該途徑被激活后可促進T2DM小鼠OB分化產(chǎn)生及骨形成，改善骨量和骨形態(tài)結(jié)構(gòu)[3]。運動是改善骨代謝的重要手段，但不同方式的運動對骨產(chǎn)生的力學(xué)刺激方式(分為直接作用力和間接作用力，即地面對骨的反作用力和肌肉對骨的牽拉力)存在較大差異。研究發(fā)現(xiàn)，直接作用力促進骨形成的作用效果顯著優(yōu)于間接作用力[4]。雖然有關(guān)運動改善T2DM骨代謝的研究較多[5-7]，但相關(guān)研究主要集中在骨密度、骨生物力學(xué)等骨表型指標上，有關(guān)不同力學(xué)刺激影響T2DM小鼠骨中TGF-β/Smad信號途徑相關(guān)分子表達及骨形成的研究尚未見報道。本文利用游泳和下坡跑模擬對骨產(chǎn)生的間接作用力和直接作用力，對T2DM小鼠進行運動干預(yù)；探究T2DM小鼠骨中TGF-β/Smad途徑中相關(guān)分子表達和骨形成的變化以及不同力學(xué)刺激對TGF-β/Smad途徑中相關(guān)分子表達和骨形成的影響。

1 研究材料與方法

1.1實驗動物造模及分組40只4周齡的C57BL/6雄性小鼠購于上海西普爾-必凱公司(生產(chǎn)證號：SYXX(滬)2015-0011)，初始體質(zhì)量為(19±0.24) g，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機分為正常對照組(ZC，10只)和T2DM造模組(30只)。T2DM造模組小鼠6周高脂膳食(繁殖鼠料質(zhì)量分數(shù)為54.6%、豬油質(zhì)量分數(shù)為16.9%、蔗糖質(zhì)量分數(shù)為14.0%、酪蛋白質(zhì)量分數(shù)為10.2%、預(yù)混料質(zhì)量分數(shù)為2.1%、麥芽糊精質(zhì)量分數(shù)為2.2%，購自上海斯萊克公司)喂養(yǎng)結(jié)束后空腹12 h，然后一次性注射80 mg/kg鏈脲佐菌素(Streptozotocin，STZ)，TC組小鼠注射檸檬酸-檸檬酸鈉溶液。STZ注射結(jié)束2周后，小鼠空腹12 h后檢測其血糖濃度，凡血糖濃度≥8 mmol/L的為T2DM小鼠[8]，27只造模成功并隨機分為T2DM對照組(TC，n=9)、T2DM游泳組(TS，n=9)和T2DM下坡跑組(TD，n=9)。正常小鼠喂食普通飼料，T2DM小鼠繼續(xù)喂食高脂膳食，均自由飲水，晝夜比為1…1(動物倫理編號：M20150311)。

1.2實驗動物訓(xùn)練方案利用游泳和下坡跑分別對TS組和TD組小鼠進行訓(xùn)練，方案如下。游泳：將小鼠放于42 cm(長)×40 cm(寬)×36 cm(深)的容器中進行訓(xùn)練，50 min/d，共計8周。第1周為適應(yīng)性訓(xùn)練，前2天每天訓(xùn)練30 min，第3、第4天每天訓(xùn)練40 min，第5、第6天每天訓(xùn)練50 min，第2周開始進行正常訓(xùn)練。下坡跑：速率為0.8 km/h，持續(xù)時間為50 min，坡度為-9°，6 d/周，共計8周。第1周為適應(yīng)性訓(xùn)練，前2天每天訓(xùn)練30 min，第3、第4天每天訓(xùn)練40 min，第5、第6天每天訓(xùn)練50 min，第2周開始進行正常訓(xùn)練。

1.3實驗動物取材取小鼠左后肢(去除肌肉等軟組織)，以備Micro CT檢測股骨遠端骨密度(bone mineral density, BMD)；取小鼠右側(cè)后肢骨用于股骨濕重和骨形態(tài)大小、相關(guān)細胞因子mRNA(股骨)和蛋白(脛骨)表達檢測；取骨髓間充質(zhì)干細胞(bone marrow mechel stem cell, BMSCs)進行細胞原代培養(yǎng)并誘導(dǎo)其向OB分化，利用Alizarin Red染液對其骨形成能力進行檢測；取顱骨以備進行Alizarin Red染色。

1.4指標檢測

1.4.1 骨中相關(guān)細胞因子mRNA表達的檢測 取右側(cè)股骨，提取RNA并將其反轉(zhuǎn)為cDNA。按定量試劑盒標準步驟對TGF-β/Smad信號途徑及其下游靶基因mRNA表達進行檢測。引物序列利用Primer premer軟件進行設(shè)計，并由上海生工生物工程有限公司合成(表1)。

表1 引物序列一覽

1.4.2 骨中相關(guān)蛋白表達的檢測 取右側(cè)脛骨，研磨后提取骨中蛋白，按二辛可寧酸(Bicinchoninic acid，BCA)法檢測樣本的蛋白濃度，結(jié)束后利用PBS將所有樣本的蛋白水平調(diào)整到同一水平；然后進行變性、電泳、轉(zhuǎn)膜處理，結(jié)束后利用麗春紅進行染色，并按目的條帶相對分子質(zhì)量的大小對聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜進行裁剪，經(jīng)磷酸鹽緩沖液(Phosphate buffer，PBS)清洗后用質(zhì)量分數(shù)為5%的脫脂奶粉封閉條帶1～2 h，利用已稀釋好的Ⅰ抗(按1∶1 000的比例進行稀釋)4 ℃孵育過夜；然后進行TBST清洗，并利用Ⅱ抗于室溫孵育2 h，TBST洗膜；最后，利用Alpha凝膠成像系統(tǒng)對PVDF膜進行顯影拍照，利用Fluorchem FC2-WB軟件進行數(shù)據(jù)分析。

1.4.3 BMSCs分化產(chǎn)生OB的骨形成能力檢測 小鼠斷頸椎處死后于體積分數(shù)為75%的酒精中滅菌，利用剪刀、鑷子和紗布將小鼠后肢骨上軟組織清除干凈，然后轉(zhuǎn)至無菌臺中操作。在體積分數(shù)為75%的酒精中浸泡2～3 min，利用已滅菌的PBS清洗2遍。利用已滅菌剪刀剪除股骨和脛骨兩端，暴露骨髓腔，用10 mL注射器吸10 mL培養(yǎng)基并配以1 mL注射器的針頭，將骨髓沖到50 mL離心管中。完畢后，制備單細胞懸液。取1.5 mL EP管，將適量單細胞懸液加至1.5 mL EP管中，并加入紅細胞裂解液，靜止5 min后利用血細胞計數(shù)板進行計數(shù)。結(jié)束后，按50萬個/孔接于24孔板中。置于培養(yǎng)箱中，2～3 d換1次液(視細胞的生長狀況而定)，6 d后向培養(yǎng)基中加入維生素C(1000×)和β-甘油磷酸(100X)誘導(dǎo)BMSCs向OB分化，2～3 d換1次液，在分化的第14天，利用體積分數(shù)為4%的PFA固定OB，然后采用Alizarin Red染液染色，最后利用相機拍照。

1.4.4 顱骨骨形成能力的檢測 顱骨經(jīng)PBS清洗后，在體積分數(shù)為4%的多聚甲醛中于4 ℃下固定24 h。結(jié)束后，分別用體積分數(shù)為0.1%的Triton-X100和PBST于4 ℃下透化24 h，結(jié)束后利用Alizarin Red染液進行染色，約30 min。染色結(jié)束，利用相機拍照，并利用Photoshop軟件截取人字縫位置，觀察骨形成能力的變化。

1.4.5 BMD檢測 取右側(cè)股骨，利用體積分數(shù)為4%的PFA固定24 h，然后用Skyscan Micro-CT系統(tǒng)(型號: 1076)按每幀18 μm的規(guī)格對股骨遠端進行掃描。結(jié)束后，利用CT An軟件獲取BMD數(shù)據(jù)。

1.4.6 股骨濕重和骨形態(tài)大小的檢測 取右側(cè)股骨并利用電子稱對股骨濕重進行稱量。利用游標卡尺對股骨長度、遠端矢/冠狀軸寬度、中間矢/冠狀軸寬度、近端矢/冠狀軸寬度等骨形態(tài)大小指標進行測量。

1.5數(shù)據(jù)統(tǒng)計利用Excel、GraphPad Prism 5和SPSS 18.0對實驗檢測的數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計、分析(ZC組和TC組進行獨立樣本t檢驗，TC組、TS組和TD組進行單因素方差分析)，P<0.05和P<0.01分別表示差異具有顯著性和差異具有非常顯著性。

2 研究結(jié)果

2.1不同力學(xué)刺激對T2DM小鼠骨中相關(guān)因子mRNA表達的影響由表2可知：與ZC組相比，TC組TGF-β(P<0.01)、Smad2(P<0.05)、Smad3(P<0.05)、Smad4(P<0.01)、Runx2(P<0.05)和Osx(P<0.01)mRNA表達顯著下調(diào)。與TC組相比，TS組TGF-β(P<0.05) 和Osx(P<0.01)mRNA表達顯著上調(diào)；TD組TGF-β(P<0.05)、Smad2(P<0.05)、Runx2(P<0.01)和Osx(P<0.01)mRNA表達顯著上調(diào)。與TS組相比，TD組Smad2(P<0.05)和Osx(P<0.05)mRNA表達顯著上調(diào)。

表2 不同力學(xué)刺激對相關(guān)因子mRNA表達的影響

注： 與ZC組相比，*表示P<0.05，**表示P<0.01；與TC組相比，★表示P<0.05，★★表示P<0.01；與TS組相比，●表示P<0.05；表3～表5同此

2.2不同力學(xué)刺激對T2DM小鼠骨中細胞因子蛋白表達的影響由圖1和表3可知：與ZC組相比，TC組p-Smad2(P<0.01)、p-Smad3(P<0.05)和Smad4(P<0.05)蛋白表達顯著下調(diào)；與TC組相比，TS組p-Smad2(P<0.01)和p-Smad3(P<0.05)蛋白表達上調(diào)，TD組p-Smad2(P<0.05)、p-Smad3(P<0.05)和Smad4(P<0.05)蛋白表達顯著上調(diào)；與TS組相比，TD組p-Smad2(P<0.05)、p-Smad3(P<0.05)和Smad4(P<0.05)蛋白表達亦顯著上調(diào)。

2.3不同力學(xué)刺激對T2DM小鼠OB和顱骨成骨能力的影響由圖2～圖3可見：與ZC組相比，TC組OB和顱骨的骨形成能力下降；與TC組相比，TS組OB的骨形成能力增強，TD組OB和顱骨的骨形成能力增強；與TS組相比，TD組OB和顱骨的骨形成能力增強。

圖1 不同力學(xué)刺激對T2DM小鼠骨中相關(guān)蛋白表達的影響

表3 不同力學(xué)刺激對相關(guān)因子蛋白表達的影響

圖2 不同力學(xué)刺激對T2DM小鼠OB的Alizarin Red染色結(jié)果的影響

圖3 不同力學(xué)刺激對T2DM小鼠顱骨Alizarin Red染色結(jié)果的影響

2.4不同力學(xué)刺激對T2DM小鼠股骨BMD的影響由表4可知：與ZC組相比，TC組松質(zhì)骨BMD(P<0.01)和皮質(zhì)骨BMD(P<0.01)顯著下降；與TC組相比，TD組松質(zhì)骨BMD(P<0.01)顯著升高。

表4 不同力學(xué)刺激對股骨BMD的影響

2.5不同力學(xué)刺激對T2DM小鼠股骨濕重和骨形態(tài)的影響由圖4和表5可知：與ZC組小鼠相比，TC組股骨濕重(P<0.05)、股骨長度(P<0.05)、遠端矢狀面寬度(P<0.05)和遠端冠狀面寬度(P<0.01)均顯著下降；與TC組相比，TS組股骨濕重(P<0.01)顯著增加，TD組股骨濕重(P<0.01)、遠端冠狀軸寬度(P<0.01)和遠端矢狀軸寬度(P<0.01)均顯著升高；與TS組相比，TD組遠端矢狀軸寬度(P<0.05)顯著增加。

圖4 不同力學(xué)刺激對T2DM小鼠股骨的影響(×1)

表5 不同力學(xué)刺激對股骨濕重和骨形態(tài)大小的影響

3 討論

3.1不同力學(xué)刺激對T2DM小鼠骨中TGF-β/Smad途徑相關(guān)分子表達的影響骨形成具有增加骨量、改善骨組織形態(tài)結(jié)構(gòu)等作用[9]。TGF-β/Smads途徑中的多肽因子——TGF-β， 通過與膜上絲氨酸/蘇氨酸激酶受體(transforming growth factor-βreceptor II, TβR-II)結(jié)合并將其激活，然后活化TβR-I，進而磷酸化胞內(nèi)Co-Smads(Smad2/3)。其與Smad4結(jié)合形成磷酸化信號傳導(dǎo)復(fù)合體后迅速入核，調(diào)控靶蛋白(Runx2、Osterix(Osx)等)表達，促進OB分化產(chǎn)生和骨形成，改善骨量和骨形態(tài)結(jié)構(gòu)[10-11]。T2DM會抑制OB分化產(chǎn)生及骨形成，研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β/Smads途徑在此過程中具有重要的調(diào)控作用[3]。Ghiraldini等[12]和Ehnert等[13]證實，T2DM病人骨折或骨折后修復(fù)延遲與骨中TGF-β表達下調(diào)密切有關(guān)。另有研究證實，T2DM大鼠骨量下降與骨中TGF-β/Smads途徑被抑制有關(guān)[14]。與ZC組相比，TC組TGF-β1、Smad2/3/4、Runx2和Osx mRNA及p-Smad2、p-Smad3和Smad4蛋白表達均顯著下調(diào)。說明T2DM小鼠骨中TGF-β/Smad途徑及其靶基因表達被顯著抑制，這與前人的研究結(jié)果一致。這與T2DM小鼠機體內(nèi)胰島素濃度降低，胰島素樣生長因子( insulin-like growth factor, IGF-1 )表達下調(diào)進而抑制骨中TGF-β/Smad信號途徑表達有關(guān)[15]。

運動作為促骨形成的有效方式，在改善T2DM人或動物骨量、骨組織形態(tài)結(jié)構(gòu)等指標上的作用已被證實[5-7]。有關(guān)TGF-β/Smad信號途徑介導(dǎo)T2DM小鼠骨形成運動適應(yīng)的相關(guān)研究尚鮮有報道。在本文中，TS組TGF-β1和Osx的mRNA及p-Smad2和p-Smad3的蛋白表達上調(diào)，TD組TGF-β1、Smad2、Runx2和Osx mRNA表達及p-Smad2、p-Smad3和Smad4蛋白表達上調(diào)；與TS組相比，TD組Smad2和Osx的mRNA表達及p-Smad2、p-Smad3和Smad4蛋白表達亦上調(diào)。這表明，下坡跑可顯著激活T2DM小鼠骨中TGF-β/Smad信號途徑，且其效果優(yōu)于游泳。分析以上結(jié)果的差異，與2種運動方式對骨產(chǎn)生的力學(xué)刺激方式不同密切相關(guān)[4]。下坡跑對T2DM小鼠骨產(chǎn)生的直接作用力可激活I(lǐng)GF-1表達，其表達上調(diào)可激活TGF-β/Smad信號途徑[16]。直接作用力亦可通過上調(diào)E-選擇素配體1(E-selectin ligand 1, ESL-1)表達進而激活TGF-β/Smad途徑及其靶基因Runx2、Osx等[17]。當MKP2/3表達下調(diào)后[18]，其基因序列上蘇氨酸和酪氨酸的脫磷酸化會活化Smad3，進而激活TGF-β/Smad途徑及Runx2和Osx表達[19]。有研究發(fā)現(xiàn)，直接的作用力亦可通過上調(diào)T2DM小鼠骨中miR-34a[20]和miR-27b[21]表達來激活TGF-β/Smad途徑及其靶基因。

3.2不同力學(xué)刺激對T2DM小鼠骨形成能力的影響OB由BMSCs分化產(chǎn)生，其能力增強后可改善BMD和骨組織形態(tài)結(jié)構(gòu)[22]。T2DM可以抑制OB分化產(chǎn)生及骨形成，但目前這方面的相關(guān)研究較少。Park等[23]和徐飛等[24]的研究均證實，T2DM小鼠分化產(chǎn)生的OB數(shù)量及骨形成下降。與ZC組相比，TC組OB骨形成能力下降，且顱骨骨形成能力亦顯著下降。這說明T2DM會抑制小鼠骨形成能力，這與前人的研究結(jié)果一致。分析其原因，這與T2DM小鼠骨中TGF-β/Smads通路被抑制有關(guān)[10]。T2DM小鼠骨中BMP-2、BMP-4和BMP-7[25-26]表達下調(diào)及金屬轉(zhuǎn)運蛋白1(metal transfer protein 1,DMT1)、過氧化物酶體增殖激活物受體γ輔激活因子1(peroxidase body growth activated receptor gamma auxiliary 1, PGC-1α)等的表達變化[27]亦會抑制OB和顱骨骨形成能力密切相關(guān)。

運動可改善T2DM骨代謝，但有關(guān)不同力學(xué)刺激影響T2DM小鼠骨形成能力的相關(guān)研究尚鮮有報道。與TC組相比，TS組和TD組OB和顱骨骨形成能力均升高；與TS組相比，TD組OB和顱骨骨形成能力亦高。說明8周運動顯著提高了T2DM小鼠OB和顱骨骨形成能力，且下坡跑的作用效果優(yōu)于游泳。這與游泳和下坡跑對T2DM小鼠骨產(chǎn)生的力學(xué)刺激方式密切相關(guān)[4]。下坡跑對T2DM小鼠骨產(chǎn)生的直接作用力通過激活TGF-β/Smads的途徑及其下游靶基因Runx2和Osx表達，促進成骨前體細胞向OB分化，增加骨形成能力[28]；并且，IGFs和BMP-2表達上調(diào)，Smad1/5/8磷酸化后與Smad4形成磷酸化基團入核激活下游靶基因Runx2和Osx表達，促進OB分化產(chǎn)生及骨形成能力[29-31]。直接作用力增強T2DM小鼠骨形成能力與脂肪細胞分泌減少的脂肪酸(FFAs)抑制ROS-ERK/P38 途徑，進而上調(diào)Runx2、ColA1和骨鈣素等的表達有關(guān)[32]。

3.3不同力學(xué)刺激對T2DM小鼠股骨BMD的影響B(tài)MD是評價骨代謝的最經(jīng)典指標[33]，T2DM會使其顯著下降[34]，這方面的相關(guān)研究較多，在此不再贅述。與ZC組相比，TC組小鼠股骨松質(zhì)骨和皮質(zhì)骨BMD均顯著下降。分析其原因可知，這與T2DM小鼠骨中TGF-β/Smad途徑被抑制后骨形成能力下降，骨中Ⅰ型膠原蛋白、骨鈣蛋白等有機質(zhì)合成減少，鈣、磷等礦物質(zhì)出現(xiàn)沉積障礙有關(guān)[35]。運動可顯著增加T2DM小鼠的BMD。Thongchote 等[36]的研究發(fā)現(xiàn)，60 min/d、5 d/周、12周的自主跑輪運動可以顯著提高T2DM小鼠股骨BMD。Frajacomo等[37]的研究也發(fā)現(xiàn)，與游泳組相比，抗阻訓(xùn)練顯著提高了雄性T2DM小鼠股骨BMD。在本文中，TS組松質(zhì)骨和皮質(zhì)骨BMD變化不顯著，說明游泳對改善T2DM小鼠BMD的作用不明顯。而TD組松質(zhì)骨BMD顯著升高，皮質(zhì)骨BMD變化不明顯，說明下坡跑可以促進T2DM小鼠松質(zhì)骨BMD提高，而對皮質(zhì)骨作用不顯著。這與運動對骨的作用影響最先表現(xiàn)在松質(zhì)骨上有關(guān)。分析不同運動對T2DM小鼠BMD的結(jié)果差異可知，下坡跑對T2DM小鼠骨產(chǎn)生的直接作用力可激活TGF-β/Smad途徑和BMPs/Smad途徑，從而提高OB的骨形成能力，使得分泌產(chǎn)生的Ⅰ型膠原蛋白、骨鈣蛋白( steocalcin, OCN)、骨橋蛋白(bone sialoprotein, BSP)等為鈣、磷等無機質(zhì)沉積提供場所，使得BMD顯著增加[38-40]。直接作用力還可通過激活T2DM小鼠骨中Wnt/β-catenin信號途徑[41]、抑制破骨細胞(osteoclast, OC)分化產(chǎn)生及其骨吸收功能[42]使BMD增加。

3.4不同力學(xué)刺激對T2DM小鼠股骨濕重和骨形態(tài)的影響骨濕重和骨形態(tài)大小是宏觀上評價骨代謝的重要指標，T2DM骨代謝紊亂會導(dǎo)致骨濕重和骨形態(tài)大小顯著下降[43-45]。在本文中，TC組小鼠股骨長度和濕重均顯著下降，這與前人的研究結(jié)果一致，這說明T2DM會導(dǎo)致小鼠骨濕重和骨形態(tài)大小顯著下降。這與本文中T2DM小鼠骨形成能力下降后松質(zhì)骨和皮質(zhì)骨BMD下降有關(guān)[46]。運動可提高骨濕重和骨形態(tài)大小，但有關(guān)其作用于T2DM小鼠的相關(guān)研究較少。在本文中，與TC組相比，TS組股骨濕重顯著增加，TD組濕重、中間矢狀軸寬度、遠端冠狀軸寬度和遠端矢狀軸寬度均顯著升高，說明下坡跑和游泳均可顯著提高股骨濕重，這是因為游泳和下坡跑均可促進T2DM小鼠骨形成，提高BMD并增加骨濕重[47]。下坡跑改善T2DM小鼠骨濕重和骨形態(tài)大小的作用優(yōu)于游泳，這與直接作用力激活TGF-β/Smad途徑，促進OB合成分泌Col1、OCN等有機質(zhì)，利于鈣、磷等礦物質(zhì)沉積有關(guān)[38]。直接作用力亦可通過抑制T2DM小鼠骨中Sclerostin和Dkk1表達、激活Wnt/β-catenin途徑、促進OB分化產(chǎn)生及骨形成能力等途徑使骨濕重和骨形態(tài)大小增加[48]。

4 結(jié)論

T2DM小鼠骨形成被顯著抑制，而下坡跑對T2DM小鼠骨產(chǎn)生的直接作用力可通過激活TGF-β/Smad途徑來提高骨形成能力，增加BMD，改善骨濕重和形態(tài)結(jié)構(gòu)，且其效果優(yōu)于游泳產(chǎn)生的間接作用力。

[1] OLIVEIRA J M,REBUFFAT S A,GASA R,et al.Targeting type 2 diabetes:Lessons from a knockout model of insulin receptor substrate 2[J].Canadian Journal of Physiology & Pharmacology,2014,92(8):613-620

[2] 黃冬梅,陸付耳.胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)障礙與胰島素抵抗的形成[J].生理科學(xué)進展,2003,34(3):212-216

[3] FREUDE T,BRAUN K F,HAUG A,et al.Hyperinsulinemia reduces osteoblast activityinvitrovia upregulation of TGF-β[J].Journal of Molecular Medicine,2012,90(11):1257-1266

[4] 陳祥和,李世昌,嚴偉良,等.不同方式運動對生長期雄性小鼠骨形成和骨吸收代謝影響的研究[J].西安體育學(xué)院學(xué)報,2015,32(2):205-211

[5] GUSHIKEN M,KOMIYA I,UEDA S,et al.Heel bone strength is related to lifestyle factors in Okinawan men with type 2 diabetes mellitus[J].Journal of Diabetes Investigation,2015,6(2):150-157

[6] BELLO M,SOUSA M C,NETO G,et al.The effect of a long-term,community-based exercise program on bone mineral density in post-menopausal women with pre-diabetes and type 2 diabetes [J].Journal of Human Kinetics,2014,43(13):43-48

[7] 趙劍.有氧運動對2型糖尿病大鼠骨密度和骨生物力學(xué)指標的影響[D].上海:上海體育學(xué)院,2010:15

[8] KANAZAWA I,YAMAGUCHI T,YAMAUCHI M,et al.Serum undercarboxylated osteocalcin was inversely associated with plasma glucose level and fat mass in type 2 diabetes mellitus[J].Osteoporosis International,2011,22(1):187-194

[9] ARYAL A C S,MIYAI K,IZU Y,et al.Nck influences preosteoblastic/osteoblastic migration and bone mass[J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America,2015,112(50):15432-15437

[10] SHI Y,MASSAGUE J.Mechanisms of TGF-beta signaling from cell membrane to the nucleus[J].Cell,2003,113(6):685-700

[11] YASUI T,KADONO Y,NAKAMURA M,et al.Regulation of RANKL-induced osteoclastogenesis by TGF-beta through molecular interaction between Smad3 and Traf6[J].Journal of Bone & Mineral Research,2011,26(7):1447-1456

[12] GHIRALDINI B,CONTE A,CASARIN RC,et al.Influence of glycemic controlon perimplant bone healing:12-month outcomes of local release of bone-related factors and implant stabilization in type 2 diabetics[J].Clinical Implant Dentistry & Related Research,2016,18(4):801-809

[13] EHNERT S,FREUDE T,IHLE C,et al.Factors circulating in the blood of type 2 diabetes mellitus patients affect osteoblast maturation-description of a novel in vitro model[J].Experimental Cell Research,2015,332(2):247-258

[14] PACIOS S,KANG J,GALICIA J,et al.Diabetes aggravates periodontitis by limiting repair through enhanced inflammation[J].FASEB Journal,2012,26(4):1423-1430

[15] CASELLI A,OLSON TS,OTSURU S,et al.IGF-1-mediated osteoblastic niche expansion enhances long-term hematopoietic stem cell engraftment after murine bone marrow transplantation[J].Stem Cells,2013,31(10):2193-2204

[16] 宋會平.血液成分與骨組織的內(nèi)在聯(lián)系及組織工程學(xué)評價[D].廣州:南方醫(yī)科大學(xué),2008:36

[17] YANG T,GRAFE I,BAE Y,et al.E-selectin ligand 1 regulates bone remodeling by limiting bioactive TGF-β in the bone microenvironment[J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America,2013,110(18):7336-7341

[18] SHEN K,KENG YF,WU L,et al.Acquisition of a specific and potent PTP1B inhibitor from a novel combinatorial library and screening procedure[J].Journal of Biological Chemistry,2001,276(50):47311-47319

[19] 李文龍,王晨輝,魏傳宇,等.MKP2和MKP3抑制TGF-beta/Smad轉(zhuǎn)錄活性[J].科學(xué)技術(shù)與工程,2010,10(13):1671-1674

[20] LAVERY C A,KUROWSKA-STOLARSKA M,HOLMES W M,et al.MiR-34a-/-mice are susceptible to diet-induced obesity[J].Obesity,2016,24(8):1741-1751

[21] WANG J M,TAO J,CHEN D D,et al.MicroRNA miR-27b rescues bone marrow-derived angiogenic cell function and accelerates wound healing in type 2 diabetes Mellitus[J].Arteriosclerosis,Thrombosis,and Vascular Biology,2014,34(1):99-109

[22] YOU L,PAN L,CHEN L,et al.MiR-27a is essential for the shift from osteogenic differentiation to adipogenic differentiation of mesenchymal stem cells in postmenopausal osteoporosis[J].Cellular Physiology and Biochemistry,2016,39(1):253-265

[23] PARK J S,BAE S J,CHOI S W,et al.A novel 11beta-HSD1 inhibitor improves diabesity and osteoblast differentiation[J].Journal of Molecular Endocrinology,2014,52(2):191-202

[24] 徐飛,董永輝,黃鑫,等.2型糖尿病對小鼠骨代謝的影響[J].中國骨質(zhì)疏松雜志,2014,20(3):238-241

[25] ZHANG M,SARA J D,WANG F L,et al.Increased plasma BMP-2 levels are associated with atherosclerosis burden and coronary calcification in type 2 diabetic patients[J].Cardiovascular Diabetology,2015,14(7):59-64

[26] YOUN J Y,ZHOU J,CAI H.Bone morphogenic protein 4 mediates NOX1-dependent eNOS uncoupling,endothelial dysfunction,and COX2 induction in type 2 diabetes mellitus[J].Molecular Endocrinology,2015,29(8):1123-1133

[27] YU N,ZHANG Y Y,NIU X Y,et al.Evaluation of shear wave velocity and human bone morphogenetic protein-7 for the diagnosis of diabetic kidney disease[J].PLoS One,2015,10(3):e119713

[28] OHATA Y,OZONO K.Bone and stem cells.The mechanism of osteogenic differentiation from mesenchymal stem cell[J].Clinical Calcium,2014,24(4):501-508

[29] 曾偉光,鄺建,陳亮,等.2型糖尿病成骨細胞功能與血清IGFs水平的關(guān)系[J].廣東醫(yī)學(xué),2001,22(12):1131-1132

[30] FU C,ZHANG X,YE F,et al.High insulin levels in KK-Ay diabetic mice cause increased cortical bone mass and impaired trabecular micro-structure[J].International Journal of Molecular Sciences,2015,16(4):8213-8226

[31] LI J,ZHANG Y,ZHAO Q,et al.MicroRNA-10a influences osteoblast differentiation and angiogenesis by regulating beta-catenin expression[J].Cell Physiology & Biochemistry,2015,37(6):2194-2208

[32] DONG X,BI L,HE S,et al.FFAs-ROS-ERK/P38 pathway plays a key role in adipocyte lipotoxicity on osteoblasts in co-culture[J].Biochimie,2014,101(12):123-131

[33] LI J,HE W,LIAO B,et al.FFA-ROS-P53-mediated mitochondrial apoptosis contributes to reduction of osteoblastogenesis and bone mass in type 2 diabetes mellitus [J].Scientific Reports,2015,31(5):127-135

[34] YAMAGUCHI T.Bone fragility in type 2 diabetes mellitus[J].World Journal of Orthopedics,2010,1(1):3-9

[35] SHARP L A,LEE Y W,GOLDSTEIN A S.Effect of low-frequency pulsatile flow on expression of osteoblastic genes by bone marrow stromal cells[J].Annals of Biomedical Engineering,2009,37(3):445-453

[36] THONGCHOTE K,SVASTI S,TEERAPORNPUNTAKIT J,et al.Running exercise alleviates trabecular bone loss and osteopenia in hemizygous beta-globin knockout thalassemic mice [J].American Journal of Physiology Endocrinology & Metabolism,2014,306(12):1406-1417

[37] FRAJACOMO F T,FALCAI M J,FERNANDES C R,et al.Biomechanical adaptations of mice cortical bone submitted to three different exercise modalities[J].Acta Ortopedica Brasileira,2013,21(6):328-332

[38] LANDIM B T,BRITO V G,do AMARAL C C,et al.Osteogenic markers are reduced in bone-marrow mesenchymal and femoral bone of young spontaneously hypertensive rats[J].Life Sciences,2016,146(12):174-183

[39] 陳祥和,李世昌,孫朋,等.下坡跑對生長期去卵巢小鼠骨BMP-2、Smad1/5和Runx2表達的影響[J].中國運動醫(yī)學(xué)雜志,2013,32(7):609-614.

[40] LI H,JIANG L S,DAI L Y.High glucose potentiates collagen synthesis and bone morphogenetic protein-2-induced early osteoblast gene expression in rat spinal ligament cells[J].Endocrinology,2010,151(1):63-74

[41] 楊念恩.不同方式運動對生長期小鼠骨合成代謝和Wnt信號通路的影響[D].上海:華東師范大學(xué),2014:25

[42] 陳祥和,李世昌,孫朋,等.下坡跑對生長期雌性去卵巢小鼠成骨細胞分化和骨形成的影響[J].中國運動醫(yī)學(xué)雜志,2014,33(2):130-134

[43] NAKAI M,COOK L,PYTER LM,et al.Dietary soy protein and isoflavones have no significant effect on bone and a potentially negative effect on the uterus of sexually mature intact Sprague-Dawley female rats[J].Menopause,2005,12(3):291-298

[44] CAMERINO C,ZAYFOON M,RYMASZEWSKI M,et al.Central depletion of brain-derived neurotrophic factor in mice results in high bone mass and metabolic phenotype[J].Endocrinology,2012,153(11):5394-5405

[45] BURKEMPER K M,GARRIS D R.Influences of obese (ob/ob) and diabetes (db/db)genotype mutations on lumber vertebral radiological and morphometric indices:Skeletal deformation associated with dysregulated systemic glucometabolism [J].BMC Musculoskeletal Disorders,2006,7(5):10-16

[46] HAFEZ A,SQUIRES R,PEDRACINI A,et al.Col1α1 regulates bone microarchitecture during embryonic development[J].Journal of Developmental Biology,2015,3(4):158-176.

[47] RUBIN M R.Bone cells and bone turnover in diabetes mellitus[J].Current Osteoporosis Reports,2015,13(3):186-191

[48] 吳學(xué)倫.2型糖尿病患者血清Sclerostin和Dkk1水平與骨密度相關(guān)性研究[D].石家莊:河北醫(yī)科大學(xué),2014:65