尚畫雨, 張 荷, 夏 志, 周 越, 王瑞元

(1. 成都體育學(xué)院 運動醫(yī)學(xué)與健康學(xué)院，四川 成都 610041；2. 北京體育大學(xué) 運動人體科學(xué)學(xué)院，北京 100084；3. 井岡山大學(xué) 體育學(xué)院，江西 吉安 343009)

骨骼肌是人體運動系統(tǒng)的動力來源。長時間和(或)大負荷運動，特別是離心運動后，骨骼肌纖維會出現(xiàn)損傷(exercise-induced muscle damage,EIMD)，可造成延遲性肌肉酸痛(delayed onset muscle soreness,DOMS)和肌力下降，從而影響人體的運動和日常生活。一直以來，EIMD都是運動生理學(xué)和運動醫(yī)學(xué)研究的重點課題。研究表明，骨骼肌細胞凋亡[1]、自噬[2]與壞死[3]在EIMD過程中均有出現(xiàn)，其中細胞自噬是關(guān)鍵的細胞降解過程，可選擇性清除受損線粒體等細胞器以延緩細胞衰老[4-5]以及抑制細胞凋亡[6]，并通過線粒體自噬而作用于線粒體質(zhì)量控制(mitochondrial quality control,MQC)。

線粒體自噬(mitophagy)是指在活性氧(reactive oxygen species,ROS)、細胞衰老、營養(yǎng)缺乏等應(yīng)激作用下，細胞內(nèi)的線粒體出現(xiàn)去極化損傷，損傷的線粒體被特異性包裹進入自噬體中，并與溶酶體融合后降解，從而維持細胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定[7]，自噬體特征蛋白為微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(microtubule-associated protein 1 light chain 3,LC3)。為適應(yīng)機體代謝需求，自噬引起的線粒體選擇性減少與線粒體生物發(fā)生相互作用，從而保持線粒體數(shù)量的穩(wěn)定。在酵母和哺乳動物細胞中，線粒體分裂要早于線粒體自噬，損傷的線粒體分裂為易被包裹的片斷后被選擇性地自噬清除，從而控制線粒體的質(zhì)量[8]。此外，正常情況下已損傷的線粒體可與鄰近的、完整的線粒體融合，并恢復(fù)其功能。然而，當線粒體損傷程度超過其修復(fù)能力時，線粒體自噬啟動，清除受損線粒體[9]。以上研究提示，線粒體自噬與線粒體生物發(fā)生、線粒體動態(tài)變化、線粒體修復(fù)共同參與MQC，對線粒體數(shù)量與功能的維持具有重要作用。

目前，對骨骼肌線粒體自噬的相關(guān)研究較鮮見，對骨骼肌細胞中線粒體自噬的變化情況及其誘導(dǎo)機制的認識尚不明確。線粒體自噬的直接動力來自于線粒體自噬蛋白及其相關(guān)的受體蛋白，研究線粒體自噬蛋白及其相關(guān)蛋白在運動后不同時相的變化尤為必要，可在進一步證明大負荷運動誘發(fā)線粒體自噬的同時，有助于探明骨骼肌線粒體結(jié)構(gòu)和數(shù)量的變化是否與線粒體自噬的發(fā)生有某種關(guān)聯(lián)。目前的研究表明，在哺乳動物體內(nèi)，除Nix、Bnip3和FUNDC1是與低氧環(huán)境關(guān)系密切的線粒體自噬途徑外，介導(dǎo)包括骨骼肌線粒體自噬途徑的主要為PINK1/Parkin[10-11]。其中PINK1(PTEN-induced putative kinase protein 1)位于Parkin(Parkinson protein 2,E3 ubiquitin protein ligase)上游，PINK1/Parkin途徑介導(dǎo)了受損線粒體表面結(jié)構(gòu)或功能蛋白的多聚泛素化，并以此作為被自噬體選擇包裹的標志，在哺乳動物細胞自噬依賴的對去極化線粒體的降解過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用[12-14]。然而，目前尚未見從PINK1/Parkin途徑探究大負荷運動誘導(dǎo)骨骼肌線粒體自噬機制的相關(guān)報道。因此，本實驗擬通過建立大負荷運動誘導(dǎo)的骨骼肌損傷動物模型，觀察線粒體自噬蛋白PINK1/Parkin及其介導(dǎo)的自噬體膜標志物L(fēng)C3的表達變化，明確是否發(fā)生了線粒體自噬；再進一步分析骨骼肌線粒體結(jié)構(gòu)和數(shù)量的變化是否與線粒體自噬的發(fā)生有某種關(guān)聯(lián)，且這種關(guān)聯(lián)是否通過PINK1/Parkin途徑誘發(fā)；此外，從分子水平上探討大負荷運動誘導(dǎo)骨骼肌線粒體自噬的機制。

1 材料與方法

1.1實驗動物及分組8周齡雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠48只，體質(zhì)量為(212.19±6.64) g(動物等級為SPF級，使用許可證號為SCXK(京)2012-0001，北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供)。用標準大鼠飼料分籠飼養(yǎng)于北京體育大學(xué)科研實驗中心動物房內(nèi)，獲得北京體育大學(xué)運動科學(xué)實驗倫理委員會批準，保持室內(nèi)相對濕度為40%～70%，溫度為20～26 ℃，室內(nèi)12 h明暗自動切換，自由攝食、飲水。

所有大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后隨機分為對照組(control,C)和運動組(exercise,E)。其中，E組根據(jù)運動后不同時間點又分為運動后即刻組(E0)、運動后12 h組(E12)、運動后24 h組(E24)、運動后48 h組(E48)和運動后72 h組(E72)，每組8只。

1.2運動方案使用小動物電動跑臺對大鼠進行運動訓(xùn)練。所有運動組大鼠在正式實驗前進行適應(yīng)性跑臺訓(xùn)練 3 d，具體方案如下：第1天跑臺坡度為0°，速度為16 m/min，運動時間為5 min；第2天跑臺坡度為0°，速度為16 m/min，運動時間為10 min；第3天休息。適應(yīng)訓(xùn)練后的第2天開始正式實驗，運動方案參照Armstrong[15]的離心運動模型，采取持續(xù)性下坡跑，跑臺坡度為- 16°，速度為16 m/min，運動時間為90 min。

1.3取材及樣品制備按照實驗設(shè)計時間點，將大鼠分批稱重后于腹腔內(nèi)注射體積分數(shù)為10%的水合氯醛(3.5 mL/kg)進行麻醉，腹主動脈取血后迅速分離大鼠比目魚肌，剪取約1 mm×1 mm×1 mm的小塊比目魚肌放入預(yù)冷至4 ℃的體積分數(shù)為2.5%的戊二醛固定液中，用于電鏡檢測；再切取100 mg新鮮的比目魚肌放入離心管內(nèi)稱重后，按照碧云天動物組織線粒體分離試劑盒(C3606)說明書差速離心提取骨骼肌線粒體，隨后加入適量的線粒體儲存液，重懸線粒體以待測線粒體酶活性，另加入適量臨用前添加了PMSF的線粒體裂解液裂解線粒體，以測線粒體蛋白表達；最后，用錫紙包裹剩余的比目魚肌并將其置于液氮中，之后轉(zhuǎn)至-80 ℃冰箱中保存，備用。

1.4測試指標與方法

1.4.1 采用透射電子顯微鏡觀察骨骼肌線粒體超微結(jié)構(gòu)的變化 將比目魚肌從戊二醛固定液中取出，首先用0.1 mol/L的磷酸緩沖液沖洗，再用體積分數(shù)為1%的鋨酸固定，然后用0.1 mol/L的磷酸緩沖液再次沖洗，之后進行脫水處理(乙醇溶液的體積分數(shù)為50%、70%、90%、100%)，然后用環(huán)氧樹脂Spurr將其包埋，再將其縱切制成超薄切片，待樣品干燥后采用透射電鏡觀察線粒體的超微結(jié)構(gòu)。

對于每一張組織切片，先在低倍視野(×500～×1 000)下確定觀察區(qū)域，之后在高倍視野(×2 000-×8 000)下觀察其超微結(jié)構(gòu)，主要觀察線粒體的分布、大小、形態(tài)以及嵴的結(jié)構(gòu)、自噬體的形成變化。隨機拍攝肌膜下和肌原纖維間照片各10張，每組每個部位下骨骼肌線粒體照片共30張[16]。使用IPP6.0圖像分析軟件測定線粒體的數(shù)量。

1.4.2 酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測比目魚肌線粒體CS的含量 CS是線粒體數(shù)量的定量酶標。采用大鼠檸檬酸合成酶(CS) ELISA分析試劑盒(美國USCNLIFE公司)檢測酶的含量。檢測步驟嚴格按照ELISA試劑盒說明書進行。

1.4.3 蛋白質(zhì)免疫印跡(Western Blot)方法測定比目魚肌PINK1及線粒體Parkin、LC3的蛋白含量 將稱取的各組(每組n=6)比目魚肌置于研缽中，加入液氮，將組織研磨成粉末，然后按照1 mg組織加入10 μL裂解液的比例進行裂解，再置于離心機內(nèi)(參數(shù)：4 ℃、12 000g)離心10 min，取上清液。用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度后統(tǒng)一調(diào)整，使上樣量保持一致。然后，以4∶1比例加入5倍上樣緩沖液，在98 ℃下煮沸5 min后分裝樣品保存。

取樣品加樣：樣品體積20 μL/孔，蛋白的質(zhì)量濃度1.5 μg/μL。隨后進行SDS-PAGE電泳，電泳后轉(zhuǎn)至聚偏氟乙稀(polyvinylidene fluoride,PVDF)膜，封閉經(jīng)一二抗孵育后放入凝膠成像系統(tǒng)(美國 BIO-RAD 公司)中顯像。所用抗體為：Anti-PINK1和Anti-Parkin及Anti-LC3及Anti-COXⅣ(英國 Abcam 公司)、Anti-GAPDH(美國 Santa Cruz 公司)、Goat Anti-Mouse IgG(H+L),HRP和Goat Anti-Rabbit IgG(H+L),HRP(北京中杉金橋生物技術(shù)公司)。使用Gel-pro軟件分析蛋白條帶灰度值，蛋白表達量用“目的蛋白/內(nèi)參”計算，即骨骼肌目的蛋白PINK1/內(nèi)參GAPDH、骨骼肌線粒體目的蛋白(Parkin、LC3)/內(nèi)參COXⅣ。

1.5統(tǒng)計學(xué)分析使用IPP圖片分析軟件對所獲得的電鏡圖片進行定量分析。使用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件對組間數(shù)據(jù)進行單因素方差分析(One-way ANOVA)，數(shù)據(jù)以“均數(shù)±標準差”(mean±SD)表示。進行方差分析之前先進行方差齊性檢驗，若方差齊性，則采用LSD法進行事后檢驗；若方差不具齊性，則將原始數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換至齊性后再作統(tǒng)計。對于不能轉(zhuǎn)換至齊性的數(shù)據(jù)直接用Tamhane’s T2的統(tǒng)計結(jié)果進行分析。P<0.05認為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

圖1 運動后不同時相線粒體超微結(jié)構(gòu)與自噬體的變化

2.1骨骼肌線粒體超微結(jié)構(gòu)變化本實驗使用透射電鏡觀察了一次大負荷運動后不同時相骨骼肌線粒體超微結(jié)構(gòu)的變化，如圖1所示。由圖1可見：C組大鼠骨骼肌中的線粒體小，且均勻分布于Z線兩側(cè)，肌膜下的線粒體較少；線粒體雙膜結(jié)構(gòu)清晰完整，嵴結(jié)構(gòu)飽滿密集，多呈細長桿狀和橢圓形，大小均一。經(jīng)過一次大負荷運動，運動后即刻組的骨骼肌線粒體分布不均勻，在肌膜下大量積聚[17]，此時線粒體開始變大、腫脹，大小不一，嵴結(jié)構(gòu)不清晰。運動后12 h，Z線部分斷裂，肌膜下線粒體大量積聚，線粒體腫脹，變圓，部分膜結(jié)構(gòu)不清晰，嵴變清晰但少而稀，此時線粒體損傷最為嚴重。運動后24 h，Z線較為清晰，肌膜下線粒體數(shù)量減少，線粒體形態(tài)有所恢復(fù)，雖然依舊很大很圓，但膜結(jié)構(gòu)較清晰，嵴變得多而密。運動后48 h，線粒體再次出現(xiàn)損傷表現(xiàn)，但線粒體損傷程度小于運動后12 h的表現(xiàn)，運動后72 h線粒體的形態(tài)已經(jīng)基本恢復(fù)到正常水平。進一步觀察后還發(fā)現(xiàn)，C組大鼠骨骼肌細胞內(nèi)未觀察到明顯的自噬體(雙層膜結(jié)構(gòu))，經(jīng)過一次大負荷運動后，骨骼肌細胞內(nèi)有大量自噬體形成，出現(xiàn)了大量的處于不同成熟階段的自噬體[18](如圖1中箭頭所指)：在運動后即刻至12 h出現(xiàn)了早期的自噬小泡包裹尚可識別的線粒體，運動后24 h至48 h出現(xiàn)了后期的自噬小泡包裹薄層狀結(jié)構(gòu)，運動后72 h未觀察到明顯的自噬體。

各組大鼠肌膜下線粒體數(shù)量的計量學(xué)統(tǒng)計結(jié)果顯示，與C組相比，E組各時相肌膜下線粒體數(shù)量均呈現(xiàn)上升趨勢，其中運動后24 h、72 h肌膜下線粒體數(shù)量明顯升高(P<0.05)[17](表1)。

表1 運動后不同時相骨骼肌膜下線粒體的數(shù)量

注： 與C組相比,*表示P<0.05,表2同此

2.2骨骼肌線粒體CS含量的變化實驗結(jié)果顯示(表2)，大負荷運動后不同時相大鼠比目魚肌線粒體中CS含量呈現(xiàn)先減少后增加的趨勢。與C組相比，線粒體CS含量在運動后0 h明顯減少(P<0.05)，運動后12 h有所增加，運動后24 h再次減少至最低(P<0.05，分別減少了45.8%、41.2%和50.1%)，運動后48 h和72 h逐漸增加，于運動后72 h達到最高，但尚未恢復(fù)至C組水平。

表2 運動后不同時相骨骼肌線粒體CS的含量

2.3骨骼肌PINK1和線粒體中Parkin、LC3蛋白表達的變化實驗結(jié)果顯示(圖2～圖4)，大負荷運動后，不同時相骨骼肌PINK1和線粒體中Parkin、LC3蛋白表達總體上均呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢。首先，骨骼肌PINK1在運動后即刻至12 h逐漸升高，12 h組較C組顯著升高了1.55倍(P<0.05)，此時出現(xiàn)最高峰，此后逐漸下降。其次，線粒體中Parkin蛋白表達在運動后即刻、12 h和24 h均顯著性升高(P<0.01或P<0.05)，比C組分別增高了1.62倍、1.34倍和1.54倍，并持續(xù)維持在高水平，最高峰出現(xiàn)在運動后即刻；運動后48 h和72 h逐漸降低，運動后72 h恢復(fù)至C組水平，此時明顯低于運動后即刻、12 h和24 h水平(P<0.01或P<0.05)。LC3-Ⅱ/Ⅰ比值在運動后即刻、12 h和48 h較C組差異均具有顯著性(P<0.01或P<0.05)，比C組分別升高了1.14倍、1.76倍和82.7%，最高峰出現(xiàn)在運動后12 h，此時明顯高于運動后即刻水平(P<0.05)，運動后24 h至72 h逐步回落，運動后72 h仍略高于C組。

圖2 運動后不同時相骨骼肌PINK1蛋白相對表達量的變化

圖3 運動后不同時相骨骼肌線粒體Parkin蛋白相對表達量的變化

圖4 運動后不同時相骨骼肌線粒體LC3蛋白相對表達量的變化

3 分析與討論

3.1大負荷運動對大鼠骨骼肌線粒體結(jié)構(gòu)和數(shù)量的影響骨骼肌損傷形態(tài)學(xué)研究是EIMD發(fā)生機制探索的基礎(chǔ)。研究表明，劇烈的、非習(xí)慣負荷運動，尤其是離心運動[19-22]可引起骨骼肌線粒體超微結(jié)構(gòu)的變化。前期研究發(fā)現(xiàn)：一次離心運動后即刻肌纖維超微結(jié)構(gòu)的改變程度較小，運動后1～2 d變化程度逐漸加劇，并見炎癥細胞浸潤[20]；此外，4周離心運動可導(dǎo)致骨骼肌線粒體在肌膜下聚積，大小不一；肌纖維內(nèi)線粒體腫脹，嵴稀少，呈空泡化，表現(xiàn)出嚴重的結(jié)構(gòu)異常[21]。李世成等[22]指出,骨骼肌線粒體結(jié)構(gòu)損傷在離心運動后12～24 h最為嚴重，呈現(xiàn)明顯的線粒體腫脹、嵴紊亂等。故本實驗參照Armstrong等[15]的運動方案對大鼠進行一次持續(xù)性下坡跑，致使肌纖維損傷發(fā)生，復(fù)制出EIMD模型，選取運動后即刻(0 h)、12 h、24 h、48 h和72 h這5個時相點，并提取離心運動最易損傷的慢肌(比目魚肌)進行研究。筆者發(fā)現(xiàn)，大負荷運動后比目魚肌線粒體出現(xiàn)明顯腫脹、肌膜下積聚等超微結(jié)構(gòu)異常變化，出現(xiàn)了大量的處于不同成熟階段的具有雙層膜結(jié)構(gòu)的自噬體，且運動后的這種變化具有明顯的時相性：運動后即刻骨骼肌輕微損傷，線粒體開始變大、腫脹，嵴小部分缺損；隨著時間延長，損傷程度加深，運動后12 h的損傷最為嚴重，線粒體多見空泡變性、腫脹、嵴部分缺損、紊亂；運動后24 h有所緩解，至48 h出現(xiàn)“二次損傷”表現(xiàn)，但此時線粒體的損傷程度小于運動后12 h的表現(xiàn)；運動后72 h接近恢復(fù)至正常水平。此外，筆者發(fā)現(xiàn)運動后有大量自噬體形成，在運動后即刻和12 h表現(xiàn)為早期的自噬小泡包裹尚可識別的線粒體，在運動后24 h和48 h表現(xiàn)為后期的自噬小泡包裹薄層狀的結(jié)構(gòu)。本實驗結(jié)果與李世成等[22]的文獻報道一致，提示一次大負荷運動可引起骨骼肌細胞發(fā)生自噬現(xiàn)象。

此外，研究證實EIMD的發(fā)生與骨骼肌細胞內(nèi)線粒體功能改變緊密相關(guān)，因此，研究運動對線粒體機能的影響越來越受人們的重視。筆者在前期研究中發(fā)現(xiàn)，一次大負荷運動后，線粒體的氧化磷酸化功能受損，表現(xiàn)為電壓依賴性陰離子通道(voltage-dependent anion channel,VDAC)和細胞色素C(cytochrome,Cyt C)蛋白表達均顯著上調(diào)[21]。有報道指出，不同運動方式和負荷還能使線粒體數(shù)量和質(zhì)量發(fā)生變化，其中有氧耐力運動可以引起線粒體數(shù)量和體積的增加[23]，而一次或重復(fù)大負荷運動則會導(dǎo)致線粒體嚴重受損，線粒體數(shù)量減少[24-25]。在目前的離體及在體實驗中，已將檸檬酸合成酶(citrate synthase,CS)作為反映線粒體數(shù)量變化的客觀指標[26-27]。研究證實，線粒體功能破壞，如呼吸鏈受抑制或者mtDNA損耗均不會對CS造成影響，因此，CS的含量變化是定量線粒體的理想標志[26-27]。本實驗結(jié)果顯示，大負荷運動后線粒體內(nèi)CS的含量呈減少的趨勢，在運動后24 h減少至最低(P<0.05)，此研究結(jié)果與董貴俊等[24]的報道基本一致，提示一次大負荷運動可顯著下調(diào)骨骼肌線粒體的數(shù)量。以上研究結(jié)果表明，大負荷運動可致使骨骼肌線粒體受損，數(shù)量減少，導(dǎo)致細胞氧化磷酸化功能障礙。

3.2大負荷運動誘導(dǎo)大鼠骨骼肌損傷的可能機制研究證實，運動或骨骼肌收縮為骨骼肌乃至整個機體帶來積極的健康效益的同時也產(chǎn)生的許多負面效應(yīng)，如ROS的產(chǎn)生、非功能或損傷細胞組件(線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和核糖體等)的聚集、衰老或錯誤折疊蛋白的累積等[28]，這些代謝廢物可通過細胞自噬轉(zhuǎn)運至溶酶體內(nèi)消化降解，從而完善肌細胞質(zhì)量控制[29]。為了維持細胞的正常生理活動狀態(tài)，受損或多余的線粒體需要被及時清除，這主要通過自噬途徑實現(xiàn)(即線粒體自噬)[30]。在正常的生理條件下，線粒體自噬現(xiàn)象相對穩(wěn)定，但生理與病理狀態(tài)會誘發(fā)其增強或者減弱。

PINKl/Parkin介導(dǎo)的線粒體自噬是近年來研究的熱點，但對其在運動誘導(dǎo)線粒體自噬中扮演的角色仍知之甚少。Vainshtein等[31]認為，一次力竭性運動后，骨骼肌線粒體融合分裂和自噬能力增強，表現(xiàn)為Parkin、Drp1表達上調(diào)。樊申元等[32]研究發(fā)現(xiàn)，帕金森小鼠PINK1 mRNA表達明顯下調(diào)，而8周耐力訓(xùn)練可上調(diào)其PINK1 mRNA、Parkin蛋白含量及LC3-Ⅱ/Ⅰ比值，從而改善神經(jīng)線粒體功能。崔迪等[33]對小鼠進行6周高脂膳食干預(yù)后，小鼠骨骼肌中的PINK1/Parkin、Nix/Bnip3信號在轉(zhuǎn)錄及翻譯水平上均存在不同程度的異常，但耐力訓(xùn)練可改善線粒體自噬水平，穩(wěn)定線粒體功能，而且PINK1/Parkin信號相對于Nix/Bnip3信號的變化在骨骼肌中更加敏感。崔迪等[34]還發(fā)現(xiàn)，P53抑制劑致使健康小鼠骨骼肌PINK1的轉(zhuǎn)錄異常高水平可通過耐力訓(xùn)練得到改善。以上說明，適度的運動訓(xùn)練可在一定程度上激活自噬水平，這有利于維持骨骼肌穩(wěn)態(tài)以及介導(dǎo)運動適應(yīng)；當不良應(yīng)激作用于機體時，自噬水平的過度激活可能會導(dǎo)致線粒體和細胞功能異常。

本研究觀察了一次大負荷運動后大鼠比目魚肌PINK1和線粒體中Parkin、LC3在不同時相的蛋白表達情況，結(jié)果顯示三者均呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢。自噬因子PINK1的蛋白表達水平和研究中線粒體損傷的情況基本一致。大負荷運動引起線粒體上降解PINK1的蛋白酶體催化作用被抑制，使得PINK1在線粒體上大量聚集，在12 h左右出現(xiàn)聚集的高峰，而此時正是本模型的骨骼肌細胞和線粒體損傷最為嚴重的時間點。而此后的時相蛋白酶體作用開始活躍，減少了PINK1在線粒體上的累積，線粒體的結(jié)構(gòu)逐漸恢復(fù)，這與骨骼肌損傷恢復(fù)過程的時程也是基本吻合的。

此外，胞漿蛋白Parkin在線粒體中的表達在運動后即刻至24 h顯著上調(diào)(P<0.01或P<0.05)，最高峰出現(xiàn)在運動后即刻，隨后48 h和72 h逐漸降低，提示一次大負荷運動可誘導(dǎo)Parkin線粒體轉(zhuǎn)位增加。Kim等[35]指出，無論是PINK1和Parkin共表達還是Parkin定位于線粒體上表達都會引起線粒體大量聚集。綜合上述結(jié)果推測，正常情況下，Parkin游離于胞漿，一次大負荷運動導(dǎo)致線粒體損傷后，PINK1隨即開始在線粒體上表達，經(jīng)過一系列作用加強了Parkin泛素連接酶的活性，使得大量Parkin從胞漿轉(zhuǎn)移至線粒體，二者可能參與了肌膜下線粒體的聚集過程。然而，PINK1如何募集Parkin到線粒體的分子機制仍不明確，另外大負荷運動誘導(dǎo)Parkin轉(zhuǎn)位從而啟動線粒體自噬的分子機理也有待進一步研究。

此前通過電鏡觀察到線粒體超微結(jié)構(gòu)的變化及線粒體自噬體的形成，僅能初步證明大負荷運動誘導(dǎo)線粒體自噬的發(fā)生，需要進一步結(jié)合自噬體標記分子的蛋白水平表達才能確定大負荷運動是否誘發(fā)了線粒體自噬。因此，采用Western Blot方法檢測自噬體標記物L(fēng)C3在線粒體中的表達。結(jié)果顯示，LC3-Ⅱ/Ⅰ比值在運動后顯著上調(diào)，最高峰出現(xiàn)在運動后12 h，此后24 h至72 h逐步回落。由此可以看出，本研究結(jié)果與電鏡下觀察到的結(jié)果相符，表明大負荷運動可引起大鼠骨骼肌細胞內(nèi)線粒體自噬體的積聚。結(jié)合線粒體形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化可知，一次大負荷運動后即刻，線粒體開始變大、腫脹，嵴結(jié)構(gòu)不清晰，此時也已經(jīng)出現(xiàn)了線粒體自噬蛋白PINK1、Parkin和LC3表達上調(diào)，說明PINK1在線粒體上大量聚集，Parkin、LC3也定位至線粒體。運動后12 h發(fā)現(xiàn)線粒體結(jié)構(gòu)嚴重破壞，此時的蛋白表達也發(fā)生相應(yīng)的變化。透射電鏡觀察到線粒體在運動后即刻和12 h左右是損傷最為嚴重的時間點，此時PINK1、Parkin和LC3也分別出現(xiàn)表達的高峰。此后的時相蛋白酶體作用開始活躍，減少了PINK1在線粒體上的累積，胞漿中Parkin的轉(zhuǎn)位及自噬的發(fā)生相繼減少，線粒體的結(jié)構(gòu)逐漸恢復(fù)，這與骨骼肌損傷恢復(fù)過程的時程是基本吻合的。本實驗結(jié)果表明，一次大負荷運動誘導(dǎo)了骨骼肌線粒體自噬的發(fā)生。

細胞死亡的方式主要可以分為三大類，即細胞凋亡、細胞壞死和細胞自噬性死亡。目前，對于EIMD機理的研究主要基于以上3種死亡方式：①大負荷運動可能通過上調(diào)Omi的表達，促進XIAP與Omi相互結(jié)合，進而激活Caspase-9和Caspase-3的活性，促使細胞凋亡的發(fā)生，這一過程已在前期研究中證實[36]；②肌肉在離心運動中被過度拉伸后會丟失一些肌細胞膜蛋白，從而導(dǎo)致骨骼肌細胞凋亡或壞死[37]；③第3種死亡方式即自噬性死亡，這種細胞死亡方式往往伴有特征性雙層膜包裹的自噬體的形成，而目前國內(nèi)外尚未見相關(guān)報道。本實驗中的Western Blot結(jié)果顯示，大負荷運動后，線粒體與自噬體膜標記物L(fēng)C3結(jié)合增多，說明自噬體對待降解線粒體的識別和結(jié)合不存在障礙，線粒體自噬明顯被激活，而PINK1及其下游Parkin參與其中。大負荷運動誘導(dǎo)線粒體自噬過度增加，增加的自噬體過度地與線粒體結(jié)合，這其中可能還包括很多健康的線粒體，致使線粒體數(shù)量顯著減少，細胞活力不能維持，最終引發(fā)自噬性細胞死亡或凋亡。目前，線粒體自噬性死亡已被認為是細胞死亡的形式之一[38-39]。據(jù)此推測，由大負荷運動引起的線粒體自噬的程度可能是導(dǎo)致線粒體丟失，以及隨后的能量代謝障礙致使骨骼肌細胞損傷的一個重要因素。大負荷運動可導(dǎo)致線粒體受損，因而誘導(dǎo)過度的線粒體自噬性清除，這可能會加重線粒體丟失，使得線粒體供能出現(xiàn)障礙，這一發(fā)現(xiàn)是對EIMD發(fā)生機制的重要探索，但仍有待進一步驗證。基于大負荷運動對于線粒體自噬的影響，選擇有針對性的線粒體自噬抑制劑和其他干預(yù)方式進行保護，有可能為預(yù)防EIMD提供新線索。

本文在細胞水平上發(fā)現(xiàn)了大負荷運動可導(dǎo)致線粒體結(jié)構(gòu)損傷和數(shù)量減少，在分子水平上發(fā)現(xiàn)了大負荷運動能夠誘導(dǎo)線粒體自噬過度發(fā)生，分析了線粒體自噬在運動致線粒體結(jié)構(gòu)數(shù)量丟失中的可能作用。以上結(jié)果表明，對于一次90 min的大負荷運動，隨著骨骼肌對大負荷的耐受性減弱，嵴的密集程度減弱，嵴的結(jié)果被破壞，線粒體數(shù)量減少，功能受損較重，在引發(fā)這些線粒體丟失現(xiàn)象的同時還誘導(dǎo)了線粒體自噬的過度發(fā)生，這可能是大負荷運動導(dǎo)致骨骼肌損傷的重要原因之一。

4 結(jié)論

一次大負荷運動后骨骼肌線粒體結(jié)構(gòu)和數(shù)量均受損，有大量的自噬體形成，導(dǎo)致骨骼肌損傷，原因可能是大負荷運動通過激活PINK1/Parkin信號介導(dǎo)線粒體自噬的過度發(fā)生，從而影響了線粒體的數(shù)量和功能；然而，大負荷運動誘導(dǎo)胞漿Parkin實現(xiàn)線粒體轉(zhuǎn)位及自噬的調(diào)控機制仍不明確，有待于后續(xù)研究進一步闡明。

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