◎ 張 鎣
(廣西輕工業(yè)科學(xué)技術(shù)研究院,廣西 南寧 530031)
眾所周知,維生素是人類必需的一種營(yíng)養(yǎng)素,當(dāng)人體維生素缺乏時(shí)就會(huì)造成新陳代謝紊亂。如今,維生素類食品大量出現(xiàn),人們對(duì)此越來(lái)越重視,維生素檢測(cè)的作用也就越發(fā)突顯。目前,我國(guó)維生素特別是保健食品類維生素檢測(cè)普遍存在檢測(cè)步驟繁瑣、檢測(cè)專屬性不強(qiáng)、檢測(cè)前處理復(fù)雜、檢測(cè)種類不全、無(wú)法準(zhǔn)確反映被檢測(cè)物維生素真實(shí)含量等問(wèn)題。因此,改進(jìn)我國(guó)保健食品維生素檢測(cè)方法,加速統(tǒng)一制定具有我國(guó)特色的保健食品類維生素檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn),以滿足日常維生素檢測(cè)的需要,是相關(guān)人員面臨的重要問(wèn)題。
自從維生素被波蘭化學(xué)家發(fā)現(xiàn)以來(lái),該物質(zhì)就被認(rèn)為對(duì)人體新陳代謝有重要的作用,并將其翻譯為維生素,也就是維持生命的意思。維生素根據(jù)其溶解性質(zhì)被分為水溶性與脂溶性兩大類別。其中維生素A、D、E、K等被稱為脂溶性維生素;維生素B類、葉酸類等被稱為水溶性維生素;此外,也有學(xué)者把?;撬?、膽堿等歸為維生素范疇。
當(dāng)前,保健食品中水溶性維生素測(cè)定方法主要有微生物法、光度法(紫外分光光度法、分子熒光法)、毛細(xì)管電泳法及液相色譜法等。
1.1.1 微生物法
微生物法是利用微生物對(duì)特定維生素的特異性完成對(duì)食品中某種維生素的測(cè)定。例如,有些學(xué)者利用各類不同的乳酸菌對(duì)不同維生素敏感的特點(diǎn),根據(jù)不同菌株的變化曲線測(cè)定配方奶粉中葉酸的含量;也有報(bào)道顯示,有學(xué)者在國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T5009.154-2016的基礎(chǔ)上,通過(guò)改變一些檢測(cè)參數(shù),如調(diào)整菌液濃度、培養(yǎng)時(shí)間、水解時(shí)間等有效提高了微生物檢測(cè)試驗(yàn)的效率[1]。
1.1.2 光度法(紫外分光光度法和分子熒光法)
光度法也是準(zhǔn)確測(cè)定維生素含量的重要手段。利用維生素在紫外光環(huán)境下有較強(qiáng)的吸收性的特性,可以實(shí)現(xiàn)光度法對(duì)維生素C等維生素的檢測(cè)。另有,學(xué)者通過(guò)分光光度法測(cè)定維生素片中B1、B2的含量;兩者的測(cè)定波長(zhǎng)分別為248 nm和261 nm,測(cè)定維生素B1的回收率達(dá)99.8%,維生素B2達(dá)98.7%。還有些學(xué)者實(shí)現(xiàn)了無(wú)紫外干擾的維生素本底校正,其通過(guò)將還原性維生素C利用溶解氧氧化為氧化性維生素C,測(cè)定了水果中的維生素C含量,回收率在97%以上。
1.1.3 電泳法
電泳法在維生素測(cè)定中也有一定的應(yīng)用。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn),在40 V以上的高壓環(huán)境下,通過(guò)以水溶液為緩沖液,可以實(shí)現(xiàn)果蔬內(nèi)維生素的定量分離與檢測(cè),效果良好,準(zhǔn)備分離出維生素B、維生素C、葉酸等多種維生素。也有學(xué)者通過(guò)毛細(xì)電泳法分離出飲料中的維生素,通過(guò)研究電壓、溫度等對(duì)分離效果的影響,達(dá)到了短時(shí)間內(nèi)分離出維生素的目的[2]。
1.1.4 色譜法
各類色譜法在維生素分離測(cè)定中得到了廣泛研究。有學(xué)者通過(guò)對(duì)復(fù)合維生素片的色譜測(cè)定,以甲醇醋酸水溶液為流動(dòng)相,通過(guò)洗脫分離,完成了對(duì)維生素B1~B4復(fù)合維生素片的測(cè)定。也有學(xué)者采取其他流動(dòng)相取得了較好的分離效果。比如,有學(xué)者以SDS作為流動(dòng)相,有學(xué)者以三氟乙酸-乙腈為流動(dòng)相,也有學(xué)者以三氟乙酸-甲醇等為流動(dòng)相,通過(guò)洗脫各種色譜柱的分離實(shí)現(xiàn)了食品、藥品、制劑等各類維生素復(fù)合體中維生素的分離[3]。
1.1.5 液相質(zhì)譜聯(lián)合法
近年來(lái),液相與質(zhì)譜聯(lián)合工藝在維生素測(cè)定中也有相關(guān)的實(shí)踐研究。有學(xué)者在GB5009.197-2003的基礎(chǔ)上,首先以液相色譜法為前提,同時(shí)配以電噴霧離子化對(duì)嬰幼奶粉中的各種維生素進(jìn)行檢測(cè)分離,檢出現(xiàn)值為0.1~0.8 ng/L,取得滿意的效果。也有學(xué)者采用類似的方法分析了人乳中的維生素含量,通過(guò)液相質(zhì)譜法聯(lián)合,通過(guò)MRM定性同位素校正也取得了較好的分離效果。當(dāng)前比較常見的水溶性維生素的檢測(cè)方法,見表1。
表1 比較常見的水溶性維生素的檢測(cè)方法表
由表1可以看出,對(duì)于水溶性維生素檢測(cè)的方法是多樣的,每種方法都有自己的優(yōu)點(diǎn)和不足。其中,光度法作為一種定量分析的方法得到了廣泛應(yīng)用,其簡(jiǎn)單實(shí)效,成本低廉。但無(wú)論是紫外光度法還是分子光度法,都存在一定的缺陷。其中,紫外光度法容易受到檢測(cè)時(shí)樣品原有基質(zhì)的影響而造成標(biāo)定值的不準(zhǔn)確;分子光度法容易受到相似結(jié)構(gòu)的物質(zhì)影響從而使檢測(cè)的前處理工藝復(fù)雜,其針對(duì)性需要提高。除了光度法以外,微生物法也應(yīng)受到足夠的重視。微生物法具有測(cè)定時(shí)靈敏度高的特點(diǎn),在測(cè)定微量或極微量微生物時(shí)具有重要的意義。當(dāng)然,微生物法普遍存在測(cè)定時(shí)間長(zhǎng)、測(cè)定誤差大、測(cè)定結(jié)果重復(fù)性差等不足。近年來(lái),高效液相色譜法和液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)得到了普遍應(yīng)用,此類方法測(cè)定效率高、準(zhǔn)確度好,成為各類維生素檢測(cè)的主流方法,但也存在設(shè)備昂貴的不足,特別是在基層部門,推廣存在一定的障礙。此外,毛細(xì)管電泳法近年來(lái)也有一定的應(yīng)用,作為一種新技術(shù),其具有效率高、檢測(cè)靈敏的特點(diǎn),但存在重現(xiàn)性差的不足,目前使用率較低[4]。
脂溶性維生素一般存在自然環(huán)境下不穩(wěn)定、容易受到光照氧化等因素的影響等不足,其檢測(cè)一直是維生素類檢測(cè)的難點(diǎn)。脂溶性維生素一般包括維生素A、D和E,每一種又有一些分類。其中維生素E別名生育酚,研究證實(shí)其具有促進(jìn)生育的功效;維生素D主要類型有D2和D3,對(duì)骨骼生長(zhǎng)發(fā)育有重要的作用;維生素A別名視黃醇,能促進(jìn)皮膚細(xì)胞的生長(zhǎng),同時(shí)對(duì)視覺功能也有一定的積極作用。當(dāng)前,科學(xué)家一直在研究更好、更準(zhǔn)確的測(cè)定脂溶性維生素的方法,目前常見的脂溶性維生素方法主要有光度法、比色法、HPLC法和萃取法等。
1.2.1 光度法
脂溶性維生素檢測(cè)中紫外光度法得到一定的應(yīng)用。有學(xué)者對(duì)尿素霜中的尿素和維生素A進(jìn)行比對(duì)測(cè)定,發(fā)現(xiàn)二者回收率分別為99.41%和99.73%,檢測(cè)波長(zhǎng)為328、428 nm,二者沒有相互干擾;又有學(xué)者對(duì)酸奶中的維生素A采用紫光光度法進(jìn)行測(cè)定,經(jīng)過(guò)皂化、揮發(fā)除溶劑等前處理后,維生素A的回收率達(dá)99.3%,同時(shí)發(fā)現(xiàn)維生素D對(duì)維生素A的測(cè)定不產(chǎn)生干擾[5]。
1.2.2 比色法
在維生素A測(cè)定中,比色法一般是依據(jù)維生素A和三氯甲烷溶液反應(yīng)產(chǎn)生的化合物在特定波長(zhǎng)范圍內(nèi)具有特異吸收的原理測(cè)定的。因?yàn)榇嬖跍y(cè)定要求條件高、測(cè)定有一定毒性等特點(diǎn),近年來(lái)已很少被采用。
對(duì)于維生素D,比色法一般是在氯仿溶液中,維生素D與三氯化銻反應(yīng)產(chǎn)生的化合物在特定波長(zhǎng)下具有最大吸收性的原理得到測(cè)定結(jié)果;而維生素E與三氯化鐵反應(yīng),在波長(zhǎng)520 nm時(shí)通過(guò)測(cè)定吸光度,從而進(jìn)一步測(cè)定維生素E的含量。這種方法容易受到一些因素的干擾,近年來(lái)使用不多。
1.2.3 熒光法
近年來(lái),部分學(xué)者對(duì)傳統(tǒng)熒光法進(jìn)行改進(jìn),取得了較好的測(cè)定效果。有學(xué)者測(cè)定血清中的維生素D3,通過(guò)前處理乙腈去除血清中的蛋白,然后使用硫酸乙醇溶液進(jìn)行反應(yīng),在特定波長(zhǎng)下進(jìn)行測(cè)定,取得了回收率97%以上的效果。也有學(xué)者對(duì)動(dòng)物肝臟中維生素A熒光法實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了改進(jìn)。通過(guò)對(duì)維生素A的乙醚溶液在氮吹條件下吹干之后利用環(huán)己烷溶解,在特定波長(zhǎng)下進(jìn)行測(cè)定,提高了回收率。還有學(xué)者對(duì)蔬菜中維生素E的測(cè)定方法進(jìn)行優(yōu)化,采用熒光法消除了石油醚的感染,取得了回收率99.1%的效果。
1.2.4 液相色譜法
液相色譜法是當(dāng)前脂溶性維生素檢測(cè)的重要方法。學(xué)者通過(guò)反相或正相進(jìn)行色譜法測(cè)定都取得了良好的效果。一些學(xué)者通過(guò)反相色譜法測(cè)定了強(qiáng)化食品中7種脂溶性維生素,其處理為采用皂化、萃取、水洗定容等工藝,以乙腈-甲醇為流動(dòng)相,在不到30 min的時(shí)間內(nèi)實(shí)現(xiàn)了對(duì)維生素A、D2、D3等7類維生素的測(cè)定;也有學(xué)者同樣以乙腈-甲醇為流動(dòng)相,對(duì)鈣片中的維生素D進(jìn)行測(cè)定,通過(guò)C18譜柱的分離,發(fā)現(xiàn)對(duì)維生素D2和D3測(cè)定效果較好。
正相高效液相色譜法近年來(lái)在脂溶性維生素測(cè)檢測(cè)中也有一定的應(yīng)用。有學(xué)者通過(guò)正相高效液相色譜法實(shí)現(xiàn)了植物油中維生素E的測(cè)定,以正己烷為流動(dòng)相,硅膠柱為分離柱,通過(guò)熒光檢測(cè)器達(dá)到了回收率92%~98%效果;也有學(xué)者通過(guò)該法測(cè)定了乳制品中維生素A的含量,首先通過(guò)皂化等前處理,然后以異丙醇-正己烷為流動(dòng)相,通過(guò)AZR色譜柱分離,經(jīng)比對(duì),測(cè)定效果優(yōu)于反相色譜法。值得指出的是,2010版《中國(guó)藥典》中明確收錄了針對(duì)維生素A的正相高效液相測(cè)定方法。
也有學(xué)者采取了高效液相-質(zhì)譜串聯(lián)方法測(cè)定奶粉中的脂溶性維生素含量,經(jīng)過(guò)皂化、萃取、蒸干、定容等前處理,以甲醇-乙酸胺為流動(dòng)相,對(duì)維生素D2和D3進(jìn)行檢測(cè),均取得了良好的檢出效果。
1.2.5 超臨界流體萃取法
近年來(lái),超臨界流體萃取法在測(cè)定脂溶性維生素中也有一定的應(yīng)用。有學(xué)者通過(guò)該法對(duì)化妝品中的脂溶性維生素進(jìn)行測(cè)定分析,成功分離測(cè)定了維生素D2、D3和維生素A的含量,效果良好。當(dāng)前檢測(cè)脂溶性維生素的主要方法,見表2。
表2 食品中脂溶性維生素的測(cè)定常見方法表
由表2可以看出,當(dāng)前主流測(cè)定脂溶性維生素的測(cè)定方法是高效液相色譜法,而原有的普通光度法、熒光法和比色法存在靈敏度低、檢測(cè)效率低、有毒性等問(wèn)題,已被逐漸棄用。但高效液相色譜法在解決上述問(wèn)題的同時(shí),還存在順?lè)串悩?gòu)不能得到有效分離的問(wèn)題,從而影響特別是維生素A測(cè)定的準(zhǔn)確性[6]。
當(dāng)前,維生素類保健品日益受到廣大消費(fèi)者的重視。維生素檢測(cè)的需求越來(lái)越大,與之相對(duì)應(yīng),我國(guó)目前還沒有中國(guó)特色的保健食品類維生素檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn),這一問(wèn)題已日益突出。各類企業(yè)在進(jìn)行維生素檢測(cè)時(shí)只是對(duì)現(xiàn)有相關(guān)資料進(jìn)行匯總,同時(shí)參考國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行檢測(cè)。由于標(biāo)準(zhǔn)不統(tǒng)一和缺乏權(quán)威性,再加上引入的國(guó)外標(biāo)準(zhǔn)往往和國(guó)情不符,缺乏具體的可操作性,企業(yè)在檢測(cè)維生素時(shí)經(jīng)常無(wú)從入手。面對(duì)這一局面,統(tǒng)一制定具有我國(guó)特色的保健食品類維生素檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)已經(jīng)是一項(xiàng)迫切的任務(wù)。
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