大孔吸附樹脂對鹿托盤蛋白水解液脫鹽及純化的作用

姜薇

【摘 要】為了脫除鹿托盤蛋白水解液中的鹽分并分離出具有較高抗氧化活性的組分，本研究選擇DA201-C大孔樹脂對水解液中多肽的吸附能力進(jìn)行測定。結(jié)果表明：當(dāng)多肽濃度為10 mg/mL，上樣流速1.0 BV/h，樹脂對多肽的脫鹽率達(dá)到98.64±2.45%，其中75%乙醇洗脫組分的抗氧化活性最高，此時鹿托盤多肽對DPPH·和ABTS·+的清除率分別為89.5±1.14%和86.3±1.47%

【關(guān)鍵詞】鹿托盤；大孔吸附樹脂；蛋白水解液；脫鹽；分離純化

中圖分類號：TS251.92 文獻(xiàn)標(biāo)識碼： A 文章編號： 2095-2457（2018）08-0045-002

Effect of Macroporous Adsorption Resin on Desalination and Purification of Deer Trays Protein Hydrolysate

JIANG Wei

（Huangshan College of Tourism， Huangshan， Anhui 245041， China）

【Abstract】In order to remove the salt from the hydrolysates of deer trays and isolate the components with higher antioxidant activity， the DA201-C macroporous resin was used to determine the adsorption capacity of polypeptides in the hydrolysate. The results showed that when the peptide concentration was 10 mg/mL and the sample flow rate was 1.0 BV/h， the desalination rate of the resin to the peptide reached 98.64±2.45%. Among them， the antioxidant activity of the 75% ethanol elution component was the highest. The clearance rates of DPPH· and ABTS·+ by peptides were 89.5±1.14% and 86.3±1.47%， respectively.

【Key words】Deer tray； Macroporous resin； Protein hydrolyzate； Desalting； Separation and purification

每年6月份為梅花鹿或馬鹿的產(chǎn)鹿茸期，鹿茸被收割后會殘留約3cm的根基，并于次年新鹿茸長出前脫落，因其形似一個圓盤，故名鹿托盤、鹿角冒[1]。鹿托盤中含有豐富的膠原蛋白，經(jīng)堿性蛋白酶水解后可獲得具有抗氧化活性的蛋白水解液，因在酶解的過程中需要不斷的添加NaOH溶液來維持水解液pH的穩(wěn)定性，從而導(dǎo)致水解中存在大量的鹽分，鹽分的存在會影響鹿托盤抗氧化肽的應(yīng)用領(lǐng)域。

一般情況下，透析袋常被用來對大分子有機(jī)物進(jìn)行透析除鹽，但是實驗過程要不斷地更換緩沖溶液，具有耗時長、損失高、資源浪費(fèi)等缺點(diǎn)。除此之外，還可以采用納濾膜[2]、凝膠色譜法[3]對蛋白進(jìn)行純化，但它們都比較昂貴僅限于實驗室研究。大孔樹脂除鹽具有低成本、高效并能保證產(chǎn)品活性的優(yōu)點(diǎn)，已被廣泛地用于生物樣品的除鹽[4]。大孔樹脂對有機(jī)物的吸附作用，依靠于其與有機(jī)物疏水基團(tuán)之間的范德華力，而無機(jī)鹽不被大孔樹脂吸附，采用去離子水就能將水解液中的鹽分去除，通過添加合適的解析液就能改變吸附體系的疏水與親水平衡，影響兩者的吸附力大小，從而使具有不同疏水基團(tuán)的有機(jī)物被解析下來[5]。

本文研究鹿托盤多肽濃度、上樣流速對DA201-C大孔樹脂吸附能力的影響，并用不同濃度乙醇溶液進(jìn)行解析，旨在獲得抗氧化活性較高的鹿托盤多肽組分，為鹿托盤多肽的深度開發(fā)利用提供一定的實驗數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

鹿托盤，中韓動物科學(xué)研究所提供；DA201-C大孔吸附樹脂，勤實科技。

1.2 儀器設(shè)備

DDS-307型電導(dǎo)率儀，購于上海右一儀器有限公司；TU-1810型紫外可見分光光度計，購于北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；BSZ-100型自定收集器，購于上海滬西分析儀器廠有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 預(yù)處理

取100g DA201-C大孔樹脂用1L無水乙醇浸泡24 h，真空抽濾回收乙醇，再用無水乙醇洗滌大孔樹脂樹脂至在220nm紫外光區(qū)無吸收峰。處理過的大孔樹脂用去離子水浸泡，并多次換水至大孔樹脂無乙醇味。

1.3.2 靜態(tài)吸附試驗

準(zhǔn)確稱取1g經(jīng)1.3.1處理過的樹脂置于50mL具塞錐形瓶中，再加入10mL鹿托盤蛋白水解液，放入30℃恒溫水浴振蕩器中，振蕩吸附4h，考察不同的多肽濃度（2.5、5、10、20、40mg/mL）對DA201-C大孔樹脂吸附率的影響。水解液中蛋白質(zhì)的初始濃度記為C0，吸附后的蛋白濃度記為C1，根據(jù)公式（1）計算大孔樹脂的吸附率。

吸附率（%）= ×100%（1）

1.3.3 動態(tài)吸附與洗脫試驗

將經(jīng)1.3.1處理過大孔樹脂慢慢裝入φ1.5cm×50 cm的色譜柱中，用去離子水預(yù)沖洗至流出液在220 nm處無吸收峰，固定上樣濃度10mg/mL、上樣體積100mL，考察不同的上樣流速（1.0、1.5、2.0 BV/H）對鹿托盤多肽的吸附效果。收集洗脫液5 mL/管，用電導(dǎo)率儀分析每管的離子濃度；用紫外分光光度計檢測收集液在220nm處的吸光值，用以分析收集液中的蛋白質(zhì)濃度的高低。然后分析不同乙醇溶液（0、25、50、75、100%）的洗脫組分的抗氧化活性。

1.3.5 檢測方法

蛋白濃度的測定采用考馬斯亮藍(lán)法，按照文獻(xiàn)[6]；清除 ABTS·+的測定方法按照文獻(xiàn)[7]；DPPH·清除率檢測方法按照文獻(xiàn)[8]。

2 結(jié)果與分析

2.1 多肽濃度對大孔樹脂吸附效果的影響

由圖1可以看出，當(dāng)鹿托盤多肽濃度小于10mg/mL時，DA201-C大孔吸附樹脂對多肽的吸附率隨多肽濃度的增加而增加。當(dāng)多肽濃度超過10mg/mL時，吸附率隨多肽濃度的增加反而下降。當(dāng)樣品濃度為10mg/mL時，大孔樹脂對樣品的吸附量達(dá)42.27±0.73mg/g，吸附率為84.55±1.45%。

2.2 上樣速度對DA201-C大孔樹脂吸附性能的影響

從圖2可以看出，隨著上樣流速的提高，樣品的流出量增加，即過高的流速降低了鹿托盤多肽與大孔樹脂的接觸時間。大孔樹脂對有機(jī)物的吸附過程一般需要依次經(jīng)歷液膜擴(kuò)散、顆粒內(nèi)擴(kuò)散，最后完成吸附反應(yīng)三個階段，有時三個階段也可能同時進(jìn)行。大孔樹脂與有機(jī)物質(zhì)的吸附反應(yīng)是在一定的溫度和時間內(nèi)，有機(jī)物在溶劑和大孔樹脂中的分配達(dá)到一定的動態(tài)平衡狀態(tài)。如果上樣流速過快，多肽溶液無法完成吸附反應(yīng)的三個階段，而不能被大孔樹脂吸附就隨著溶液流出[5]。因此，我們選取上樣流速為1.0 BV/h。

2.3 乙醇濃度對DA201-C大孔樹脂的吸附及脫鹽分析

大孔樹脂對鹿托盤多肽的吸附作用，依靠于其與多肽疏水基團(tuán)之間微弱的范德華力，通過添加合適的解析液就能改變吸附體系的疏水與親水平衡，從而使具有不同疏水基團(tuán)的多肽被解析下來，由于水解液中的無機(jī)鹽不具有疏水性，而隨著溶液流出洗脫柱，從而與鹿托盤多肽分開[9]。乙醇具有安全無毒、沸點(diǎn)低、易回收、成本低等優(yōu)點(diǎn)，是最常用的解析液，不同濃度的乙醇能改變鹿托盤多肽與大孔樹脂的吸附能力，多肽的疏水性越高需要解析的乙醇濃度就越高，而達(dá)到分離純化的作用[10]。

由圖3可以看出，鹿托盤蛋白水解液中的無機(jī)鹽在用去離子水洗脫前基本就隨著溶劑流出洗脫柱，脫鹽效果較好，此時除鹽率可達(dá)98.64±2.45%。由于鹿托盤蛋白主要以膠原蛋白為主，膠原蛋白經(jīng)酶解后的多肽分子量相對較大，疏水性較大的多肽占有比例較少，因此，25%和50%濃度的乙醇洗脫出的多肽濃度較高。

2.4 不同組分多肽抗氧化活性分析

由圖4可以看出，乙醇濃度75%的洗脫組分對DPPH·和ABTS·+的清除的能力最強(qiáng)，比25%乙醇洗脫組分的抗氧化活性有大幅度提高，此時75%的洗脫組分對DPPH·和ABTS·+的清除率分別為89.5±1.14%和86.3±1.47%

3 結(jié)論

本研究選擇DA201-C大孔樹脂對鹿托盤多肽進(jìn)行脫鹽和分離純化，研究了多肽濃度和上樣流速對大孔樹脂吸附能力的影響。實驗結(jié)果表明多肽濃度為10mg/mL，上樣流速1.0BV/h時大孔樹脂對鹿托盤多肽的吸附性能較好?？寡趸瘜嶒灥贸?，75%乙醇洗脫組分多肽的抗氧化活性最高，此時多肽對DPPH·和ABTS·+的清除率分別為89.5±1.14%和86.3±1.47%。

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