杜俊凱 陳明月 徐之超 白立曦 段鵬

傷口愈合是一個(gè)高度復(fù)雜的生物過程，由三個(gè)重疊的階段組成：炎癥、增殖和重塑。任何一個(gè)或多個(gè)階段的損傷都會(huì)導(dǎo)致修復(fù)障礙[1]。傷口愈合過程需要對(duì)受損組織區(qū)域的細(xì)胞和非細(xì)胞成分進(jìn)行空間和時(shí)間重排。缺氧是組織損傷和創(chuàng)面愈合的主要微環(huán)境因素之一[2]。炎癥階段的特征是血管反應(yīng)和炎癥細(xì)胞的招募。最初的組織損傷誘導(dǎo)血管損傷從而導(dǎo)致急性組織缺氧。通過浸潤(rùn)的炎性和基質(zhì)細(xì)胞增加氧消耗，進(jìn)一步降低組織氧張力最終導(dǎo)致長(zhǎng)期慢性組織缺氧[3]。此外，間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSCs）在正常傷口愈合的炎癥、增殖和重建階段起著重要的作用[4]。由于一些因素可導(dǎo)致傷口很難愈合，故創(chuàng)傷與修復(fù)是外科臨床治療中要面對(duì)的棘手問題。隨著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的發(fā)展，對(duì)于創(chuàng)傷修復(fù)已不僅僅停留于外科操作本身，而是將目光逐漸聚集到傷口愈合的細(xì)胞和分子機(jī)制。

低氧反應(yīng)，主要是由氧穩(wěn)態(tài)的主要轉(zhuǎn)錄因子低氧誘導(dǎo)因子 -1（hypoxia-inducible factor-1，HIF-1）介導(dǎo)的，在幾乎所有的傷口愈合和重塑過程中都被證明是至關(guān)重要的[3]。HIF-1是1992年Semenza等[5]發(fā)現(xiàn)的一種氧依賴轉(zhuǎn)錄激活因子，通過與低氧反應(yīng)元件結(jié)合，調(diào)控下游基因的轉(zhuǎn)錄。研究發(fā)現(xiàn)，在正常皮膚傷口中，HIF-1對(duì)增強(qiáng)適當(dāng)?shù)难装Y和血管生成反應(yīng)極其重要[1]。在影響組織創(chuàng)傷修復(fù)的眾多因素中，組織再生的干細(xì)胞來源不足、促愈合的細(xì)胞因子缺乏及血管化減少是關(guān)鍵的[6]。多潛能間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞（又稱MSCs）是一種細(xì)胞療法的熱門工具，不僅因其多功能性質(zhì)，也因其能植入受損組織，釋放營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，促進(jìn)新血管形成，調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激和誘導(dǎo)抗炎反應(yīng)[7]。一些臨床前和臨床研究已證實(shí)MSCs的移植可以改善傷口愈合[8-9]。脂肪干細(xì)胞（adipose-derived stem cells，ASCs）是來源于脂肪組織的MSCs，具有自我更新及多向分化的干細(xì)胞特性。糖尿病是一種與傷口愈合有關(guān)的全身慢性代謝疾病[10]。本研究擬建立糖尿病小鼠創(chuàng)面損傷模型，探討HIF-1協(xié)調(diào)脂肪干細(xì)胞對(duì)糖尿病小鼠皮膚損傷修復(fù)的作用及機(jī)制。

材料與方法

一、材料

（一）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

8周齡雄性SPF級(jí)C57BJ/L小鼠68只，體質(zhì)量在 16.0 ～ 21.4 g，平均（19.8±1.4）g，購于南京大學(xué)生物醫(yī)藥研究院[SCXK（蘇）2015-0001]。

（二）細(xì)胞來源

從吸脂術(shù)后的脂肪組織中提取ASCs。脂肪組織均來源于西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院整形外科門診行腹部吸脂術(shù)的健康成年女性（獲得患者知情同意），共6名，平均年齡28周歲。

（三）實(shí)驗(yàn)試劑

質(zhì)粒 gWIZ-CA5-HIF-1α（CA5-HIF-1α）、gWIZ-empty vector（EV）、gWIZ-KGF（KGF）均由美國(guó)林肯公司提供。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBR PremixEx Taq試劑盒均來源于日本TaKaRa公司。

二、實(shí)驗(yàn)方法

（一）糖尿病慢性創(chuàng)面模型制備

C57BJ/L小鼠適應(yīng)飼養(yǎng)環(huán)境1周。禁食8 h后，測(cè)定小鼠空腹血糖正常，然后腹腔注射1﹪鏈脲佐菌素（STZ，60 mg/kg）的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液（pH值 = 4.0）。注射3 d后，于清晨空腹抽取尾靜脈血，空腹血糖濃度＞ 16.7 mmol/L則被視為成功建立了糖尿病小鼠模型，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。將糖尿病小鼠背部皮毛剔掉，用無菌打孔器在背部中線兩側(cè)間距1 cm以上各做直徑為1 cm的圓形皮膚全層創(chuàng)口，形成皮膚缺損創(chuàng)面。使用數(shù)碼相機(jī)拍攝小鼠傷口。采用圖像分析軟件Photoshop對(duì)糖尿病小傷口圖像予以處理、分析以及計(jì)算。在治療后第14天隨機(jī)選取各組小鼠3只處死,將創(chuàng)面標(biāo)本切分成兩半，一半用于后期提取總RNA，另一半用于后期提取蛋白，并放于液氮凍存。

（二）質(zhì)粒注射和電穿孔基因轉(zhuǎn)染

本實(shí)驗(yàn)采用定向激活的HIF-1，可以在常氧狀態(tài)下保持其轉(zhuǎn)錄因子活性。這種被稱為CA5-HIF-1α的定向激活的HIF-1（圖1）其包含了392 ～ 520氨基酸編碼區(qū)域的缺失和P567T、P658Q部位的錯(cuò)義突變，使得HIF-1α能在富氧環(huán)境中保持穩(wěn)定。從而提高了其在創(chuàng)傷局部的表達(dá)水平，增加其生物學(xué)活性，促進(jìn)血管生成。將溶于50 μl生理鹽水中的質(zhì)粒DNA注射入傷口兩側(cè)的有兩個(gè)點(diǎn)位置，立即用紗布包住皮上傷口。緊接著，在皮內(nèi)DNA分布的位點(diǎn)插入4個(gè)穿透性電極。電極陣列包括四個(gè)穿透電極，排列成兩個(gè)相鄰的等腰三角形，間距為2.5 mm，插入深度為2 mm。電極插入后以振幅為330 Vcm-1的電極間距給予電刺激。刺激的總持續(xù)時(shí)間為40 ms，間隔時(shí)間為400 ms。電脈沖刺激完成后，從創(chuàng)面組織中取出電穿孔裝置，將其轉(zhuǎn)移至恢復(fù)。

圖1 CA5-HIF-1α示意圖

（三）ASCs體外分離、培養(yǎng)和擴(kuò)增

脂肪抽吸物經(jīng)磷酸鹽緩沖液清洗3遍后，在37 ℃，用0.075﹪的Ⅰ型膠原酶消化，120×g離心60 min。用濃度為10﹪FBS的DMEM培養(yǎng)液使消化終止，然后，1200×g離心10 min，得到高濃度同質(zhì)組織細(xì)胞團(tuán)，再用紅細(xì)胞裂解液處理5 min，去掉摻雜的紅細(xì)胞，過直徑100 μm的蹄網(wǎng)去掉沒有完全消化的組織。所得到的細(xì)胞接著用完全培養(yǎng)基進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)融合度約為70﹪～ 80﹪時(shí)以1 : 3的比例進(jìn)行傳代。選擇第三代細(xì)胞用于所有實(shí)驗(yàn)。在創(chuàng)傷后的48 h內(nèi)，對(duì)每一受體小鼠給予含2×106個(gè)細(xì)胞懸液的生理鹽水。

（四）實(shí)驗(yàn)分組

將糖尿病小鼠隨機(jī)分為空載質(zhì)粒（EV）組，CA5-HIF-1α 轉(zhuǎn) 染（CA5）組，EV+saline組，CA5+saline組，EV+ASCs組，CA5+ASCs組。

（五）創(chuàng)傷愈合面積的的觀察

在 治 療 后 第 0、3、7、10、14、17 和 21 天，使用透明醋酸紙描記創(chuàng)面大小并用圖像分析軟件Photoshop計(jì)算傷口面積（以像素計(jì)算）。創(chuàng)面形成后當(dāng)天（第0天）的傷口面積被取為100﹪，并每天完整記錄傷口愈合情況。

（六）激光多普勒血流成像檢測(cè)血流灌注情況

使用激光波長(zhǎng)是785 nm的氦氖激光掃描多普勒成像設(shè)備（LDI2-IR，moor instruments，Devon，UK）檢測(cè)傷口區(qū)域的血流量，該設(shè)備利用一個(gè)近紅外激光二極管來測(cè)量皮下血液流動(dòng)，這基于多普勒頻儀散射光可檢測(cè)血細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)。成像系統(tǒng)采用低功耗（2 mW）的紅外激光對(duì)組織進(jìn)行順序掃描。對(duì)于每一個(gè)測(cè)量點(diǎn)，都會(huì)產(chǎn)生一個(gè)與組織灌注線性相關(guān)的信號(hào)。在第7、10、14和17天對(duì)含整個(gè)創(chuàng)傷面積的區(qū)域進(jìn)行了一系列測(cè)量，掃描頭高度在20 cm處掃描。記錄所測(cè)量部位數(shù)值取其平均值，單位是灌注指數(shù)（perfusion unit，PU），并使用軟件包Moor LDI V5.2軟件計(jì)算平均血流。

（七）HE染色檢測(cè)血管密度

在治療14 d后，處死小鼠，對(duì)創(chuàng)面進(jìn)行組織學(xué)分析。剪取創(chuàng)面以及創(chuàng)面周緣10 mm左右的全層皮膚。4﹪多聚甲醛固定后，常規(guī)切片。然后，進(jìn)行蘇木素伊紅染色。用熒光顯微鏡觀察新生微血管密度情況并拍照。

（八）熒光定量PCR法檢測(cè)HIF-1α及血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）mRNA表達(dá)

用Trizol提取創(chuàng)傷組織總RNA并測(cè)算濃度，再根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書操作將RNA合成cDNA，按照SYBR PremixEx Taq試劑盒說明書以cDNA作為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)并運(yùn)用LightCycler 480儀器檢測(cè)目的基因表達(dá)。以GAPDH基因?yàn)閮?nèi)參基因，采用 2-ΔΔCt法進(jìn)行結(jié)果分析（表 1）。

表1 HIF-1α、VEGF、GAPDH 基因的引物

（九）Western blot法檢測(cè)VEGF蛋白表達(dá)

按照試劑說明書提取并收集各組小鼠創(chuàng)傷組織的蛋白，然后運(yùn)用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定并計(jì)算蛋白濃度，再進(jìn)行聚丙烯酰胺（SDS-PAGE）凝膠電泳。電泳完成后，經(jīng)濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜（250 mA，120 min）。接下來，使用封閉液將PVDF膜進(jìn)行封閉。再用一抗稀釋液（anti-VEGF、1 : 1000；anti-GAPDH、1 : 1000）于 4 ℃搖床過夜孵育 PVDF膜。次日，用含0.1﹪吐溫的TBST于搖床上洗膜3次，每次10 min。二抗稀釋液室溫孵育1 h后，再用含0.1﹪吐溫的TBST于搖床上洗膜3次，每次10 min。最后，用成像儀拍照。用GAPDH作為內(nèi)參，并進(jìn)行3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法

采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，本研究的傷口面積、創(chuàng)面血流量、HIF-1α和VEGF mRNA、VEGF蛋白水平實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以± s表示，用 Bonferroni或Tukey post hoc分析法對(duì)組間傷口面積、創(chuàng)面血流量、HIF-1α mRNA及VEGF mRNA及蛋白水平進(jìn)行單因素方差分析。以P＜ 0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1.CA5-HIF-1α基因注射劑量的選擇：使用電穿孔基因轉(zhuǎn)染將不同劑量CA5-HIF-1α基因（50，125，250 μg）注射糖尿病小鼠創(chuàng)傷局部后，PCR檢測(cè)HIF-1α mRNA表達(dá)水平，以選擇最優(yōu)的注射劑量。隨著注射劑量的不斷增加，局部HIF-1α mRNA表達(dá)水平在一定范圍內(nèi)與劑量成正相關(guān)，但高劑量（250 μg）組局部目的基因水平卻有所減低，且CA5-HIF-1α 基因注射劑量為 125 μg時(shí)，局部 HIF- 1α mRNA 表 達(dá) 水平較高（10.40±0.22）（F= 19.48，P= 0.025），故本研究選擇125 μg的劑量進(jìn)行后續(xù)的研究（圖 2）。

2.定向激活HIF-1基因促進(jìn)糖尿病小鼠皮膚創(chuàng)傷修復(fù)：角化細(xì)胞生長(zhǎng)因子（keratinocyte growth factor，KGF）是創(chuàng)傷修復(fù)中重要細(xì)胞因子[11]，為評(píng)估定向激活HIF-1在創(chuàng)傷修復(fù)中的效率，本研究使用相同質(zhì)粒載體（gWIZ）、相同濃度（125 μg/ 50 μl）的 KGF 基 因 和 CA5-HIF-1α 基 因?qū)μ悄虿⌒∈笃つw創(chuàng)傷模型進(jìn)行基因治療，結(jié)合電刺激。結(jié)果顯示，于給藥后第 3、7、10、14天，CA5-HIF-1α基因治療組小鼠的傷口面積小于空載對(duì)照組（F= 41.37、32.16、27.29、25.16，P= 0.028、0.034、0.038、0.042），并優(yōu)于 KGF組，且在17 d各組小鼠傷口基本愈合（表2）。

圖2 不同處 理組小鼠HIF-1α mRNA表達(dá)水平的比較

圖3 CA5-HIF-1α基因治療組（CA5組）與空白對(duì)照組（EV組）小鼠創(chuàng)面血流量比較

3.定向激活HIF-1基因增加糖尿病小鼠創(chuàng)面血流量：為了探討定向激活HIF-1基因?qū)μ悄虿⌒∈髣?chuàng)面組織灌注的作用，本研究使用無創(chuàng)的LDPI檢測(cè)皮膚血流。于CA5-HIF-1α基因治療后的第7、10、14、17天評(píng)估傷口的血流情況。CA5-HIF-1α基因治療組小鼠傷口灌注于第10天增加，治療后第14天空白對(duì)照組和基因治療組的皮膚血流均達(dá)到最大值，且第10天和第17天基因治療組小鼠的皮膚血流（253.06±8.34、250.59±10.13）均大于空白對(duì) 照 組（158.31±9.98、169.73±7.28）（F=21.53、26.08，P=0.038、0.032，圖 3）。

4.HIF-1α基因聯(lián)合ASCs治療促進(jìn)糖尿病小鼠皮膚創(chuàng)傷修復(fù)：研究發(fā)現(xiàn)，ASCs具有促進(jìn)創(chuàng)面愈合作用[12]。于是，本研究進(jìn)一步探討了HIF-1α基因聯(lián)合ASCs治療對(duì)糖尿病小鼠皮膚創(chuàng)傷修復(fù)的影響。結(jié)果顯示，在治療后3 ～ 14 d，HIF- 1α基因單獨(dú)治療、ASCs單獨(dú)治療及二者聯(lián)合組的傷口面積小于對(duì)照組（F= 39.58、44.09、34.67，P=0.031、0.028、0.037），且 HIF-1α 基因和 ASCs聯(lián)合治療組的傷口面積最小，提示聯(lián)合治療的效果最優(yōu)（表 3）。

5.HIF-1α基因聯(lián)合ASCs治療增加糖尿病小鼠創(chuàng)面血流量：本研究還觀察了HIF-1α基因聯(lián)合ASCs治療對(duì)糖尿病小鼠創(chuàng)面組織灌注的影響。在治療后的第7、10、14、17天使用無創(chuàng)的激光多普勒血流成像評(píng)估傷口的血流情況。本研究還發(fā)現(xiàn)HIF-1α基因單獨(dú)治療、ASCs單獨(dú)治療及二者聯(lián)合組的皮膚血流于第10天增加，且ASCs聯(lián)合治療組血流增加幅度最大，于第14天，所有糖尿病小鼠的皮膚血流均達(dá)到最大值，且第10天和第17天HIF-1α 基 因 單 獨(dú) 治 療（262.05±9.34、248.45±11.13）、ASCs單 獨(dú) 治 療（215.33±10.75、185.82±10.47）及 二 者 聯(lián) 合 組（322.54±12.27、292.49±9.57）小鼠的皮膚血流均大于空白對(duì)照組（161.30±5.64、134.57±8.67）（F= 29.15、17.38，P= 0.026、0.034,圖 4）。

表2 不同處理組經(jīng)定向激活HIF-1基因治療后糖尿病小鼠傷口面積的比較（像素，± s）

表2 不同處理組經(jīng)定向激活HIF-1基因治療后糖尿病小鼠傷口面積的比較（像素，± s）

注：與同一時(shí)期的EV組比較，*P ＜ 0.05

治療后時(shí)間第0天 第3天 第7天 第10天 第14天 第17天 第21天EV 組 9 125.48±117.53 9 062.00±225.75 8 534.42±189.35 5 634.59±198.06 2 308.15±245.36 462.42±22.61 12.65±0.03 KGF 組 8 962.06±184.37* 8 351.02±164.56* 7 724.10±205.61* 4 396.48±175.69* 1 785.17±231.58* 198.13±14.02* 13.26±0.02*CA5 組 9 067.26±247.03* 7 828.92±294.28* 7 285.97±118.24* 4 050.41±301.97* 1 292.35±101.14* 69.61±18.57* 9.25±0.25*F值 39.25 41.37 32.16 27.29 25.16 45.49 28.17 P值 0.031 0.028 0.034 0.038 0.042 0.024 0.037分組

表3 不同處理組經(jīng)HIF-1α基因聯(lián)合ASCs治療后糖尿病小鼠傷口面積的比較（像素± s）

表3 不同處理組經(jīng)HIF-1α基因聯(lián)合ASCs治療后糖尿病小鼠傷口面積的比較（像素± s）

注：與同一時(shí)期的EV+Saline組比較，*P ＜ 0.05

治療后時(shí)間第0天 第3天 第7天 第10天 第14天 第17天 第21天EV+Saline 9 080.12±120.41 8 989.25±175.03 8 320.72±176.05 5 590.61±208.28 2 473.08±163.82 405.76±16.78 42.13±0.05 CA5+Saline 9 117.46±241.58* 7 656.92±177.03* 7 163.83±128.24* 4 238.23±228.36* 1 316.52± 90.75*186.36±17.95* 26.08±0.13*EV+ASCs 9 134.50±254.33* 7 593.64±192.12* 7 233.08±146.86* 4 097.58±227.91*1 488.53± 86.25*160.48±18.72* 31.45±0.28*CA5+ASCs 8 994.27±184.72* 6 745.25±203.16* 6 159.35±168.72* 3 682.06±257.30* 997.64±183.71*108.67±10.58* 19.25±0.36*F值 27.15 39.58 44.09 34.67 29.52 35.05 31.68 P值 0.046 0.031 0.028 0.037 0.043 0.035 0.041分組

6.HIF-1α基因聯(lián)合ASCs治療增加糖尿病小鼠血管密度：本研究也探討了HIF-1α基因聯(lián)合ASCs治療對(duì)糖尿病小鼠創(chuàng)面血管密度的影響。HE染色結(jié)果顯示，HIF-1α基因單獨(dú)治療、ASCs單獨(dú)治療及其聯(lián)合治療后，糖尿病小鼠創(chuàng)面的血管密度明顯增加，且聯(lián)合治療后的小鼠血管密度增加最明顯（圖 5）。

圖4 不同處理組小鼠創(chuàng)面血流量比較

圖5 熒光顯微鏡下觀察各組小鼠皮膚創(chuàng)面的血管密度（HE染色 ×50）

7.HIF-1α基因聯(lián)合ASCs治療誘導(dǎo)糖尿病小鼠VEGF mRNA及蛋白表達(dá)上調(diào)：為進(jìn)一步探討HIF-1α基因聯(lián)合ASCs治療對(duì)糖尿病小鼠皮膚創(chuàng)傷修復(fù)的作用機(jī)制，本研究采用熒光定量PCR法和Western blot方法分別對(duì)治療后14 d的糖尿病小鼠創(chuàng)面組織VEGF mRNA及蛋白水平進(jìn)行檢測(cè)。HIF-1α基因單獨(dú)治療、ASCs單獨(dú)治療及二者聯(lián)合治療組VEGF mRNA及蛋白表達(dá)水平分別為2.03±0.14、2.16±0.13、3.41±0.18 和 1.75±0.12、1.82±0.06、2.96±0.14高 于 對(duì) 照 組（1.05±0.02、1.03±0.05）（F= 34.08、29.53，P= 0.019、0.021），且聯(lián)合治療組VEGF mRNA及蛋白表達(dá)水平最高，提示HIF-1α基因及ASCs治療對(duì)糖尿病小鼠皮膚創(chuàng)傷修復(fù)的作用可能與其上調(diào)VEGF蛋白的表達(dá)水平有關(guān)（圖 6、7）。

圖6 不同處理組小鼠的VEGF表達(dá)水平的比較

圖7 不同處理組小鼠VEGF蛋白表達(dá)Western blot 檢測(cè)

討 論

糖尿病患者的傷口愈合受損（例如糖尿病足潰瘍）是全球主要的醫(yī)療和公共衛(wèi)生問題之一。超過50﹪的非創(chuàng)傷性下肢截肢是由糖尿病的傷口潰瘍引起的。此外，患有足部潰瘍的糖尿病患者預(yù)后較差，死亡率也更高[13]。目前還沒有有效的治療策略，主要原因是導(dǎo)致傷口修復(fù)失敗的分子發(fā)病機(jī)制尚未得到充分的了解。

HIF-1是一種核轉(zhuǎn)錄因子，在哺乳動(dòng)物的生長(zhǎng)發(fā)育、生理和病理反應(yīng)過程中舉足輕重。

研究報(bào)道，激活HIF-1基因能夠減少遺傳性糖尿病小鼠的傷口愈合時(shí)間[14]。那么，激活HIF-1基因能否改善STZ誘導(dǎo)的慢性糖尿病小鼠的創(chuàng)傷修復(fù)呢。HIF-1是細(xì)胞內(nèi)持續(xù)性表達(dá)的蛋白,在正常氧濃度條件下，細(xì)胞內(nèi)HIF-1不穩(wěn)定，半衰期不到10 min，很快通過氧依賴降解結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)的泛素蛋白酶體降解，而失去生物學(xué)活性[15]。為了讓HIF-1α在非缺氧環(huán)境下持續(xù)發(fā)揮生物學(xué)活性，起到高效、持久的促血管生成作用，本研究使用CA5-HIF-1α的定向激活的HIF-1，它能在富氧環(huán)境中保持穩(wěn)定。本研究結(jié)果顯示，CA5-HIF-1α質(zhì)粒注射到糖尿病小鼠后，能夠減少傷口面積和促進(jìn)創(chuàng)面血流量，進(jìn)而加速創(chuàng)面愈合，這與Zhang等[16]報(bào)道的激活HIF-1基因能夠促進(jìn)糖尿病小鼠的傷口愈合相一致。

ASCs是一種MSCs，由于相對(duì)于其他組織的MSCs，其相對(duì)豐富的脂肪組織及其可獲取性，表現(xiàn)出一定的治療潛力。Kato等[12]發(fā)現(xiàn)，ASCs移植可促進(jìn)Zucker糖尿病大鼠的創(chuàng)面愈合。基于此經(jīng)驗(yàn)，本研究接著探討聯(lián)合HIF-1α基因治療/ASCs細(xì)胞治療方法對(duì)糖尿病小鼠創(chuàng)面愈合的影響。本研究發(fā)現(xiàn)，HIF-1α基因治療和ASCs細(xì)胞治療聯(lián)合治療糖尿病小鼠可加速創(chuàng)面愈合以及增加創(chuàng)面血流量和血管密度，且聯(lián)合治療的創(chuàng)面愈合速度及創(chuàng)面血流量和血管密度都大于單獨(dú)基因治療或單獨(dú)細(xì)胞治療，提示聯(lián)合HIF-1α基因治療和ASCs細(xì)胞治療優(yōu)于單獨(dú)治療。

接著，本研究進(jìn)一步探討了聯(lián)合HIF-1α基因治療和ASCs細(xì)胞治療改善糖尿病小鼠創(chuàng)傷修復(fù)的作用機(jī)制。研究報(bào)道，血管生成在創(chuàng)面愈合的增殖階段具有重要作用[16]。HIF-1α是血管生成過程中的主要調(diào)節(jié)因子。缺氧激活的HIF-1α可誘導(dǎo)促血管生成生長(zhǎng)因子如VEGF的表達(dá)[17]。ASCs能通過自分泌或旁分泌的途徑來上調(diào)一些促進(jìn)脈管生成的細(xì)胞因子的表達(dá)如VEGF、血管生成素、bFGF、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子、胰島素樣生長(zhǎng)因子等,其中VEGF是一種主要血管生成因子[20]。那么，聯(lián)合HIF-1α基因治療和ASCs細(xì)胞治療改善糖尿病小鼠創(chuàng)傷修復(fù)的作用機(jī)制是否與其調(diào)控VEGF表達(dá)有關(guān)呢？本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，HIF-1α基因聯(lián)合ASCs治療組的VEGF mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著高于單獨(dú)治療組和對(duì)照組，且HIF-1α基因單獨(dú)組和ASCs單獨(dú)治療組VEGF mRNA及蛋白表達(dá)顯著高于對(duì)照組，提示VEGF表達(dá)上調(diào)可能參與HIF-1α基因及ASCs細(xì)胞聯(lián)合治療對(duì)糖尿病小鼠皮膚創(chuàng)傷修復(fù)的促進(jìn)作用。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)定向激活HIF-1基因協(xié)調(diào)脂肪干細(xì)胞可促進(jìn)糖尿病小鼠創(chuàng)傷修復(fù)。利用與創(chuàng)傷修復(fù)有關(guān)的分子生物學(xué)及干細(xì)胞學(xué)的研究基礎(chǔ)，通過人工干預(yù)，局部導(dǎo)入促血管生成基因，并增加外周血促血管生成干細(xì)胞數(shù)量，充分發(fā)揮基因以及細(xì)胞治療在創(chuàng)傷修復(fù)中的協(xié)同促進(jìn)作用，以達(dá)到加速創(chuàng)傷修復(fù)的目的，以期為創(chuàng)傷修復(fù)的基因治療和干細(xì)胞聯(lián)合治療在臨床上的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

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