李瓊書(shū) 成先義 胡源 陳潔瑩 鞏秀 肖東 胡祥 劉未斌

乳腺癌是女性最常見(jiàn)的腫瘤之一，全世界每年約50萬(wàn)人病死于乳腺癌。國(guó)內(nèi)主要城市10年來(lái)乳腺癌發(fā)病率上升了37﹪，高于世界平均增長(zhǎng)水平[1-2]。目前，乳腺癌的治療方法主要是采取手術(shù)為主，輔以化療、放療及內(nèi)分泌治療等綜合治療方式[3-4]。但乳腺癌患者五年生存率仍低于20﹪[5]。另外，對(duì)于三陰性（雌激素受體ER、黃體酮受體PR和表皮生長(zhǎng)因子受體HER2表達(dá)陰性）乳腺癌的治療缺乏有效的靶向治療手段[6]。因此尋找和建立有效的乳腺癌輔助治療手段是亟待解決的科學(xué)問(wèn)題。隨著分子生物學(xué)、基因工程技術(shù)及免疫學(xué)的飛速發(fā)展，以免疫治療為基礎(chǔ)的生物治療已成為乳腺癌治療的第五大模式，并顯示出良好的應(yīng)用前景。目前，腫瘤抗原特異性T細(xì)胞受體 （T-cell receptors，TCR）基因被相繼分離出來(lái)，使通過(guò)轉(zhuǎn)導(dǎo)TCR基因產(chǎn)生抗原特異性T細(xì)胞成為可能，也為得到有治療價(jià)值的T細(xì)胞提供了有利的手段。研究已證實(shí)，靶向癌癥睪丸抗原（cancer-testis antigen，CT）如NYESO-1，MAGE-A3，CEA 和 gp100 的 TCR 基因修飾T細(xì)胞在治療滑膜肉瘤、多發(fā)性骨髓瘤以及黑色素瘤等腫瘤中已取得了較好的臨床療效[7-10]，證明腫瘤抗原特異性TCR基因修飾T細(xì)胞具有較強(qiáng)的抗腫瘤效果，是比較有前景的抗腫瘤免疫治療手段。

胎盤(pán)特異性基因1（placenta-specific 1，PLAC1）是CT抗原中的新一員。CT抗原家族最典型的特征是在正常組織的表達(dá)僅限于生殖細(xì)胞，或（和）胎盤(pán)滋養(yǎng)層組織，但在腫瘤組織的表達(dá)呈廣泛性。研究已證實(shí)，PLAC1在多種腫瘤尤其在乳腺癌中異常活化和高表達(dá)[11-13]。在臨床樣本分析檢測(cè)中表明，PLAC1在82﹪的乳腺癌患者中高表達(dá)；在乳腺癌細(xì)胞MCF-7和BT-549中通過(guò)siRNA干擾了PLAC1的表達(dá)后抑制了細(xì)胞增殖、遷移和侵襲[11]。這些結(jié)果提示，PLAC1在乳腺癌發(fā)生發(fā)展中扮演了重要作用，是乳腺癌的重要癌基因，可作為乳腺癌抗腫瘤免疫治療的新靶點(diǎn)。但是，目前為止，還沒(méi)有PLAC1抗原特異性的TCR基因修飾T細(xì)胞被研究開(kāi)發(fā)用于抗腫瘤免疫治療。

本研究通過(guò)基因工程的方法，將PLAC1特異性的人類白細(xì)胞抗原分型為A2（HLA-A2）限制性的TCR基因?qū)隩細(xì)胞，研究PLAC1特異性TCR基因修飾T細(xì)胞對(duì)乳腺癌細(xì)胞的體內(nèi)、外抗腫瘤作用，為乳腺癌患者的個(gè)體化治療、表達(dá)PLAC1抗原的腫瘤治療開(kāi)辟新思路。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)材料

乳腺癌細(xì)胞系MCF-7 和 MDA-MB-231，以及病毒包裝細(xì)胞系HEK293T購(gòu)自美國(guó)模式菌種收集中心（ATCC）；RPMI 1640 培養(yǎng)液和胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；青霉素和鏈霉素購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司；CD8+T 細(xì)胞分選試劑盒和T細(xì)胞活化、擴(kuò)增試劑盒購(gòu)自德國(guó)美天旎公司；人AB血清、聚凝胺和雌二醇購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；白細(xì)胞介素2（IL-2）購(gòu)自美國(guó)Peprotech公司；重組慢病毒 載 體PLAC1-TCR-pCDH-EF1-MCS-T2A-Puro、慢病毒空載體pCDH-EF1-MCS-T2A-Puro、 pLP1、pLP2和 pLP-VSVG為深圳市北科生物科技有限公司研發(fā)中心保存；Lipofectamine 2000購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；FITC-CD8抗體、PerCP-Cy5.5-CD3抗體、PE-HLA-A2抗體和Matrigel 基質(zhì)膠購(gòu)自美國(guó)BD公司；兔抗人PLAC1抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam公司；兔IgG購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司，PE-羊抗兔IgG購(gòu)自北京全式金生物公司；PE標(biāo)記的 HLA-A2/PLAC1（28-36）-multimer購(gòu)自英國(guó)Proimmune公司；IFN-γ ELISA檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)R&D Systems公司；WST-1 購(gòu)自德國(guó)Roche公司；4 ～ 6周齡的雌性BALB/c 裸鼠購(gòu)自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心；IX71倒置熒光顯微鏡購(gòu)自日本Olympus公司；酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)BioTek公司；流式細(xì)胞儀FACS Calibur購(gòu)自美國(guó)BD公司。

二、實(shí)驗(yàn)方法

1.細(xì)胞培養(yǎng)：乳腺癌細(xì)胞系MCF-7和 MDAMB-231以及慢病毒包裝細(xì)胞系HEK293T用含10﹪胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，添加100 U/ml青霉素和100 U/ml鏈霉素。置于37 ℃CO2體積分?jǐn)?shù)為5﹪的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。對(duì)CD8+T細(xì)胞的分離培養(yǎng)，取基因分型為HLA-A2健康志愿者外周抗凝血（肝素鈉）100 ml（實(shí)驗(yàn)經(jīng)健康志愿者知情同意并經(jīng)過(guò)北京大學(xué)深圳醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審批），通過(guò)淋巴細(xì)胞分離液離心提取PBMC，計(jì)數(shù)PBMC總量為（1 ～ 2）×108個(gè)。用CD8+T細(xì)胞分選試劑盒根據(jù)說(shuō)明書(shū)分選CD8+T細(xì)胞為（1 ～ 2）×107個(gè)，采用T細(xì)胞活化、擴(kuò)增試劑盒以及含有10﹪ AB血清和400 U/ml IL-2的RPMI 1640培養(yǎng)液進(jìn)行擴(kuò)增。通過(guò)流式檢測(cè)CD8+T細(xì)胞的免疫表型。

2.PLAC1特異性TCR重組慢病毒載體的構(gòu)建：為了產(chǎn)生PLAC1特異性T細(xì)胞克隆，前期采用了與Sommermeyer等[14]類似的方法：采用HLA-A2 志愿者的DC細(xì)胞負(fù)載PLAC1抗原肽之后遞呈自身CD8+T細(xì)胞，使表達(dá)抗原特異性TCR的T細(xì)胞大量擴(kuò)增，分選和克隆PLAC1抗原特異性TCR的α/β鏈序列。采用連接肽T2A連接TCR的α和β鏈，產(chǎn)生PLAC1特異性TCR基因序列（TCRα-T2A-TCRβ）。將 PLAC1特異性 TCR 基因序列通過(guò)EcoR I和BamH I酶切位點(diǎn)整合入慢病毒表達(dá)載體pCDH-EF1-MCS-T2A-PURO（圖1b），從而產(chǎn)生重組慢病毒載體PLAC1-TCR-pCDH-EF1-MCS-T2A-Puro。

3.PLAC1特異性TCR基因修飾T細(xì)胞：培養(yǎng)HEK293T細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，0.25﹪胰酶消化，將細(xì)胞鋪于100 mm的小皿，每個(gè)皿1 × 106個(gè)細(xì)胞。24 h后，細(xì)胞密度達(dá)到80﹪融合，采用Lipofectamine 2000按照說(shuō)明書(shū)操作將3.0 μg PLAC1-TCR-pCDH-EF1-MCS-T2A-Puro 重組質(zhì)粒（或3.0μg pCDH-EF1-MCS-T2A-Puro空載體）、3.0 μg包裝質(zhì)粒pLP1、3.0 μg pLP2和3.0μg pLP-VSVG轉(zhuǎn)染細(xì)胞，4 h后吸棄含有質(zhì)粒-脂質(zhì)體復(fù)合物的培養(yǎng)基，換成正常完全培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。48 h后，收取含有病毒的培養(yǎng)上清液，通過(guò)超濾濃縮，0.22 μm的濾膜過(guò)濾除菌。將收取的含有TCR基因的慢病毒侵染CD8+T細(xì)胞，添加聚凝胺（終濃度5 μg/ml）增強(qiáng)感染效率，得到TCR轉(zhuǎn)基因T細(xì)胞，稱為T(mén)CR-T細(xì)胞，以對(duì)照病毒侵染的CD8+T細(xì)胞作為對(duì)照細(xì)胞，稱為NC-T細(xì)胞。采用PE標(biāo)記的HLA-A2/PLAC1（28-36）-multimer通過(guò)流式細(xì)胞儀FACS Calibur檢測(cè)TCR在CD8+T細(xì)胞中的正確表達(dá)率。

4.免疫熒光檢測(cè)乳腺癌細(xì)胞系PLAC1的表達(dá)：采用生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MCF-7和 MDA-MB-231細(xì)胞，胰酶消化后鋪96孔板，每孔接種2×104個(gè)細(xì)胞，次日，棄培養(yǎng)板上清液，采用PBS洗孔板3次，向每孔中加入100 μl 4﹪多聚甲醛室溫固定20 min，PBS洗 3次，2﹪ BSA 封閉 30 min，將兔抗人PLAC1抗體以及兔IgG進(jìn)行1 : 300稀釋，每孔加50 μl，4 ℃冰箱中孵育過(guò)夜。次日，吸棄上清液，PBS洗3次，加入 PE 標(biāo)記的山羊抗兔二抗，室溫下孵育 1 h，PBS 洗 3 次，每孔加 100 μl PBS，于Olympus倒置熒光顯微鏡下觀察結(jié)果并進(jìn)行圖像采集。

5.流式檢測(cè)細(xì)胞表型及PLAC1特異性TCR表達(dá)：通過(guò)細(xì)胞計(jì)數(shù)收集細(xì)胞（1 × 106），F(xiàn)ACS 液（含有0.1﹪ NaN3和2﹪ FBS的PBS緩沖液）洗2 次，用 FACS 溶液冰上封閉 30 min，600×g，4 ℃離心5 min，棄上清液；用FACS液將 FITC-CD8抗體、PerCP-Cy5.5-CD3抗體和PE-HLA-A2抗體進(jìn)行100倍稀釋；將PE-HLA-A2/PLAC1 (28-36)-multimer進(jìn)行10倍稀釋，以每管100 μl的體積加入細(xì)胞樣本，置于冰上孵育30 min。FACS 液洗2次，通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD8+T細(xì)胞中CD3+CD8+的表達(dá)比例，PLAC1特異性TCR表達(dá)效率以及乳腺癌細(xì)胞HLA-A2的表達(dá)。

6.WST-1法檢測(cè)TCR-T細(xì)胞對(duì)乳腺癌細(xì)胞的細(xì)胞毒作用：根據(jù)文獻(xiàn)[15-16]報(bào)道，采用WST-1法檢測(cè)TCR-T細(xì)胞對(duì)乳腺癌細(xì)胞的殺傷效應(yīng)。收集培養(yǎng)至第14天的TCR-T細(xì)胞以及NC-T細(xì)胞作為效應(yīng)細(xì)胞，分別以對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MCF-7和MDAMB-231細(xì)胞為靶細(xì)胞。調(diào)整靶細(xì)胞密度為1×105個(gè)/ml，加入96孔平底細(xì)胞培養(yǎng)板中，100 μl/孔；次日，細(xì)胞貼壁后按效靶比5 : 1、10 : 1和20 : 1加入不同濃度的TCR-T細(xì)胞或NC-T細(xì)胞100 μl，以單獨(dú)靶細(xì)胞及單獨(dú)的不同濃度的效應(yīng)細(xì)胞作為對(duì)照組，每組設(shè)3個(gè)重復(fù)孔。共培養(yǎng)3 h后，加入WST-1溶液 20 μl/孔，繼續(xù)培養(yǎng) 4 h，輕輕振蕩 1 min，酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm波長(zhǎng)處各孔的吸光度（A值）。按下列公式計(jì)算細(xì)胞的增殖抑制率= [1-（實(shí)驗(yàn)組A值-效應(yīng)細(xì)胞A值）/靶細(xì)胞A值 ] × 100﹪。

7.ELISA檢測(cè)TCR-T細(xì)胞與乳腺癌細(xì)胞共培養(yǎng)后細(xì)胞因子的釋放：按照上述方法將效應(yīng)細(xì)胞TCR-T細(xì)胞或NC-T細(xì)胞分別與靶細(xì)胞MCF-7和MDA-MB-231共培養(yǎng)3 h后，收集共培養(yǎng)上清液，采用IFN-γ ELISA檢測(cè)試劑盒根據(jù)說(shuō)明書(shū)要求檢測(cè)IFN-γ的釋放量。酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm吸光度值。

8.PLAC1特異性TCR基因修飾T細(xì)胞體內(nèi)抗腫瘤研究：實(shí)驗(yàn)經(jīng)北京大學(xué)深圳醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審批。取4 ～ 6周齡雌性裸鼠15只，每只裸鼠按照3 mg/kg體重的量皮下注射雌二醇。2周后，在每只小鼠右腋下皮下注射混有50 μl Matrigel 的5× 106個(gè)乳腺癌細(xì)胞MCF-7建立裸鼠皮下移植瘤模型，成模后，小鼠隨機(jī)分成3組：生理鹽水對(duì)照組，NC-T細(xì)胞組和TCR-T細(xì)胞組。以NC-T細(xì)胞和TCR-T細(xì)胞作為效應(yīng)細(xì)胞，尾靜脈注射1×107個(gè)/次，注射總體積為200 μl，共治療2次，每周進(jìn)行1次。生理鹽水組以注射相同體積的生理鹽水代替。每周用游標(biāo)卡尺監(jiān)測(cè)腫瘤長(zhǎng)徑和短徑2 ～ 3次，計(jì)算腫瘤體積，長(zhǎng)度為a mm，寬度為b mm，腫瘤體積計(jì)算公式 =（π/6）ab2。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法

采用SPSS11.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，T細(xì)胞表型，HLA-A2表達(dá)水平，細(xì)胞增殖抑制率，IFN-γ的釋放水平以及小鼠腫瘤體積均采用± s表示，多組間比較采用F檢驗(yàn)，兩組間比較采用獨(dú)立t檢驗(yàn)。以P＜ 0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、PLAC1特異性TCR基因修飾CD8+ T細(xì)胞的構(gòu)建

磁珠分選HLA-A2志愿者外周血PBMC中的CD8+T細(xì)胞，流式檢測(cè)CD8+T細(xì)胞的表型，分選出的CD8+T細(xì)胞的CD3+CD8+比例達(dá)到（98.89±0.30）﹪（圖1a）。通過(guò)慢病毒載體構(gòu)建（慢病毒載體圖譜見(jiàn)圖1b）、包裝，將可識(shí)別乳腺癌腫瘤抗原PLAC1的HLA-A2限制性的TCR基因?qū)虢?jīng)磁珠分選培養(yǎng)的CD8+T細(xì)胞，得到TCR-T細(xì)胞，以慢病毒空載體包裝、感染的CD8+T細(xì)胞作為對(duì)照細(xì)胞（NC-T細(xì)胞），采用PE-HLA-A2/PLAC1（28-36）-multimer染色，通過(guò)流式檢測(cè)結(jié)果表明TCR-T細(xì)胞中PLAC1特異性TCR表達(dá)率為（24.58±0.82）﹪，NC-T細(xì)胞中不表達(dá)PLAC1特異性 TCR（圖 1c、d）。

二、PLAC1和 HLA-A2 陽(yáng)性表達(dá)的乳腺癌細(xì)胞的鑒定

通過(guò)免疫熒光染色檢測(cè)乳腺癌細(xì)胞中PLAC1的表達(dá)情況，結(jié)果如圖2所示，在MCF-7和 MDA-MB-231細(xì)胞中可見(jiàn)代表PLAC1表達(dá)的紅色熒光分布于整個(gè)細(xì)胞膜，PLAC1表達(dá)呈強(qiáng)陽(yáng)性。以對(duì)照抗體（兔IgG）進(jìn)行染色則未見(jiàn)熒光分布。流式檢測(cè)結(jié)果顯示，MCF-7和 MDA-MB-231（三陰性乳腺癌）細(xì)胞中HLA-A2的表達(dá)效率分別為（93.04±1.36）﹪ 和（98.72±0.12）﹪（圖 3）。 因此，MCF-7和 MDA-MB-231細(xì) 胞 為 HLA-A2和PLAC1 雙陽(yáng)性細(xì)胞（HLA-A2+，PLAC1+），可作為PLAC1特異性TCR-T細(xì)胞的靶細(xì)胞用于后續(xù)抗腫瘤實(shí)驗(yàn)研究。

三、PLAC1-TCR基因修飾CD8+ T細(xì)胞在體外對(duì)乳腺癌細(xì)胞具有殺傷用

圖1 流式鑒定CD8+ T細(xì)胞的免疫表型以及PLAC1特異性TCR的過(guò)表達(dá)效率

圖2 免疫熒光檢測(cè)乳腺癌細(xì)胞系MCF-7和MDA-MB-231中PLAC1的表達(dá)（×100）

圖3 流式檢測(cè)乳腺癌細(xì)胞系MCF-7和MDA-MB-231中HLA-A2血清型的表達(dá)

WST-1法檢測(cè)結(jié)果顯示（表 1、2），與 NC-T 細(xì)胞相比，在同等效靶比下TCR-T細(xì)胞對(duì)MCF-7（HLA-A2+，PLAC1+）和 MDA-MB-231（HLA-A2+，PLAC1+）細(xì)胞的增殖抑制率增強(qiáng)（P＜ 0.01），且隨著效靶比的增加抑制率升高。ELISA結(jié)果顯示（表3、4），與 MCF-7 和 MDA-MB-231 共培養(yǎng)后，TCR-T細(xì)胞的IFN-γ的釋放水平在同等效靶比下高于NC-T細(xì)胞（P＜ 0.01），且隨著效靶比的增加釋放量升高。

表1 WST-1法檢測(cè)NC-T細(xì)胞和TCR-T細(xì)胞與乳腺癌細(xì)胞MCF-7共培養(yǎng)后對(duì)乳腺癌細(xì)胞的抑制率（n =3,﹪， ± s）

表1 WST-1法檢測(cè)NC-T細(xì)胞和TCR-T細(xì)胞與乳腺癌細(xì)胞MCF-7共培養(yǎng)后對(duì)乳腺癌細(xì)胞的抑制率（n =3,﹪， ± s）

效應(yīng)細(xì)胞-靶細(xì)胞效靶比5 : 1 10 : 1 20 : 1 NC-T-MCF-7 4.34±1.80 4.53±2.10 5.93±2.40 TCR-T-MCF-7 17.55±1.90 29.17±0.97 51.50±1.37 t值 4.759 10.056 15.507 P 值 ＜ 0.01 ＜ 0.01 ＜ 0.01

表2 WST-1法檢測(cè)NC-T細(xì)胞和TCR-T細(xì)胞與乳腺癌細(xì)胞MDAMB-231共培養(yǎng)后對(duì)乳腺癌細(xì)胞的抑制率（n =3，﹪± s）

表2 WST-1法檢測(cè)NC-T細(xì)胞和TCR-T細(xì)胞與乳腺癌細(xì)胞MDAMB-231共培養(yǎng)后對(duì)乳腺癌細(xì)胞的抑制率（n =3，﹪± s）

效應(yīng)細(xì)胞-靶細(xì)胞 效靶比5 : 1 10 : 1 20 : 1 NC-T- MDAMB-231 2.19±1.60 4.70±1.80 5.15±2.40 TCR-T- MDAMB-231 15.38±1.60 25.80±1.30 44.34±2.20 t值 5.197 8.561 10.694 P值 ＜ 0.01 ＜ 0.01 ＜ 0.01

表3 ELISA檢測(cè)NC-T細(xì)胞和TCR-T細(xì)胞與乳腺癌細(xì)胞MCF-7共培養(yǎng)后T細(xì)胞IFN-γ的釋放水平（n =3，pg/ml± s）

表3 ELISA檢測(cè)NC-T細(xì)胞和TCR-T細(xì)胞與乳腺癌細(xì)胞MCF-7共培養(yǎng)后T細(xì)胞IFN-γ的釋放水平（n =3，pg/ml± s）

效應(yīng)細(xì)胞-靶細(xì)胞效靶比5 : 1 10 : 1 20 : 1 NC-T-MCF-7 9.06±7.40 15.64±6.58 18.14±6.22 TCR-T-MCF-7 108.98±6.34 207.64±9.16 347.49±4.10 t值 -17.627 -29.476 -76.638 P值 ＜ 0.01 ＜ 0.01 ＜ 0.01

表4 ELISA檢測(cè)NC-T細(xì)胞和TCR-T細(xì)胞與乳腺癌細(xì)胞MDAMB-231共培養(yǎng)后T細(xì)胞IFN-γ的釋放水平（n =3，pg/ml，± s）

表4 ELISA檢測(cè)NC-T細(xì)胞和TCR-T細(xì)胞與乳腺癌細(xì)胞MDAMB-231共培養(yǎng)后T細(xì)胞IFN-γ的釋放水平（n =3，pg/ml，± s）

效靶比5 : 1 10 : 1 20 : 1 NC-T- MDAMB-231 7.34±6.11 10.00±6.41 14.70±6.38 TCR-T- MDAMB-231 65.44±4.51 108.51±6.60 255.25±6.85 t值 -13.25 -18.540 -44.526 P 值 ＜ 0.01 ＜ 0.01 ＜ 0.01效應(yīng)細(xì)胞-靶細(xì)胞

四、PLAC1-TCR基因修飾CD8+ T細(xì)胞在體內(nèi)抑制裸鼠皮下人乳腺癌移植瘤生長(zhǎng)

在裸鼠皮下人乳腺癌移植瘤實(shí)驗(yàn)中，生理鹽水組和NC-T細(xì)胞移植組小鼠的腫瘤生長(zhǎng)迅速，TCR-T細(xì)胞治療組小鼠腫瘤生長(zhǎng)相對(duì)緩慢。在移植后第35天，生理鹽水組、NC-T細(xì)胞組和TCR-T細(xì)胞組小鼠腫瘤的平均體積分別 為（5 636.96±2 879.55） mm3、（5 522.12±3 391.48） mm3和（1 403.85± 1 394.31） mm3，TCR-T細(xì)胞治療組小鼠腫瘤平均體積小于生理鹽水 組（F= 0.1813，P＜ 0.05）和 NC-T 細(xì) 胞 組（F=0.1307，P＜ 0.05）。TCR基因修飾T細(xì)胞在體內(nèi)有抑制乳腺癌進(jìn)展的作用。

討 論

由于大多數(shù)腫瘤抗原在一些正常組織中表達(dá)，導(dǎo)致以TCR為基礎(chǔ)的過(guò)繼性免疫療法難免對(duì)正常組織產(chǎn)生細(xì)胞毒作用[17]。因此，目前過(guò)繼性免疫細(xì)胞治療研究的熱點(diǎn)是使T細(xì)胞靶向正常組織中不表達(dá)的腫瘤特異性抗原。由于CT抗原在多種腫瘤類型中過(guò)度表達(dá)而在正常組織中的表達(dá)僅限于生殖細(xì)胞，而生殖細(xì)胞由于缺乏MHC分子的表達(dá)而不能遞呈抗原，不能被TCR基因修飾的T細(xì)胞識(shí)別，因此CT抗原已成為腫瘤免疫靶向治療的理想靶點(diǎn)。PLAC1作為CT抗原的新成員，在乳腺癌中高度表達(dá)，并且在乳腺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲調(diào)控中扮演重要作用[18]，提示PLAC1是乳腺癌的重要癌基因，可作為乳腺癌抗腫瘤免疫治療的新靶點(diǎn)。另外，HLA-A2血清型是中國(guó)人群中最廣泛表達(dá)的HLA-I類分子[19]，提示HLA-A2限制性和PLAC1特異性TCR基因修飾T細(xì)胞是較有前景的抗腫瘤免疫治療手段。但是，目前為止，還沒(méi)有PLAC1抗原特異性的TCR基因修飾T細(xì)胞被研究開(kāi)發(fā)用于抗腫瘤免疫治療。

為了產(chǎn)生PLAC1特異性T細(xì)胞克隆，本研究前期采用了與Sommermeyer等[14]類似的方法：采用HLA-A2 志愿者的DC細(xì)胞負(fù)載PLAC1抗原肽之后遞呈自身CD8+T細(xì)胞，使表達(dá)抗原特異性TCR的T細(xì)胞大量擴(kuò)增并進(jìn)行分選，再用5'-RACEPCR方法克隆PLAC1抗原特異性TCR的α/β鏈序列。之后利用基因工程的方法，通過(guò)慢病毒載體將可識(shí)別PLAC1的TCR基因?qū)隒D8+T細(xì)胞，產(chǎn)生TCR-T細(xì)胞以及對(duì)照細(xì)胞NC-T細(xì)胞。通過(guò)MHCPLAC1五聚體檢測(cè)TCR-T細(xì)胞中PLAC1特異性TCR的正確表達(dá)率為（24.58±0.82）﹪，NC-T細(xì)胞中不表達(dá)PLAC1特異性TCR，成功將PLAC1特異性TCR基因?qū)隩細(xì)胞。

由于通過(guò)以上方法產(chǎn)生的PLAC1特異性TCR是HLA-A2限制性的，因此，為了研究TCR基因修飾T細(xì)胞的體外抗腫瘤活性，首先通過(guò)免疫熒光和流式檢測(cè)非侵襲性乳腺癌細(xì)胞MCF-7和三陰性乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231中PLAC1和HLA-A2的表達(dá)情況，結(jié)果表明MCF-7 和MDA-MB-231細(xì)胞為HLA-A2和PLAC1雙陽(yáng)性細(xì)胞，與Liu 等結(jié)果一致[13,18]。之后以TCR-T細(xì)胞或?qū)φ占?xì)胞NC-T細(xì)胞作為效應(yīng)細(xì)胞，分別以MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞作為靶細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞殺傷實(shí)驗(yàn)。WST-1結(jié)果證實(shí)，在同等效靶比下，TCR-T細(xì)胞對(duì)MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞的增殖抑制率高于NC-T細(xì)胞（P＜ 0.05），且隨著效靶比的增加抑制率升高。ELISA結(jié)果顯示與MCF-7和MDA-MB-231共培養(yǎng)后，TCR-T細(xì)胞IFN-γ的分泌水平高于NC-T細(xì)胞（P＜ 0.05）。這些結(jié)果表明，PLAC1特異性 TCR基因修飾T細(xì)胞對(duì)乳腺癌細(xì)胞具有高效的殺傷作用。由于PLAC1廣泛高表達(dá)于乳腺癌細(xì)胞中，本研究中未能找到PLAC1弱表達(dá)或者不表達(dá)的乳腺癌細(xì)胞系作為對(duì)照，這是本研究的不足之處，在以后的研究中將會(huì)繼續(xù)研究PLAC1特異性TCR基因修飾T細(xì)胞抗腫瘤的特異性。

在裸鼠皮下人乳腺癌移植瘤實(shí)驗(yàn)中，與生理鹽水組和NC-T細(xì)胞組相比，TCR-T細(xì)胞移植后抑制了乳腺癌模型小鼠腫瘤的生長(zhǎng)，證實(shí)了TCR-T細(xì)胞在體內(nèi)具有抗腫瘤作用。由于研究已報(bào)導(dǎo)，T細(xì)胞可以滲透到黑素瘤移植瘤小鼠的腫瘤中[20]發(fā)揮作用，并且本研究的結(jié)果也表明TCR基因修飾T細(xì)胞與乳腺癌細(xì)胞共培養(yǎng)后能特異性釋放IFN-γ，因此，推測(cè)PLAC1特異性TCR 基因修飾T細(xì)胞也可能浸潤(rùn)到了乳腺癌移植瘤的腫瘤部位從而殺死腫瘤細(xì)胞，并且通過(guò)釋放IFN-γ調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境從而抑制腫瘤生長(zhǎng)。

綜上所述，本研究的體內(nèi)、外實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明PLAC1特異性的TCR基因修飾T細(xì)胞對(duì)乳腺癌具有較強(qiáng)的抗腫瘤作用；PLAC1可作為乳腺癌治療的潛在靶標(biāo)；PLAC1特異性TCR基因修飾T細(xì)胞治療是PLAC1表達(dá)陽(yáng)性乳腺癌治療的新策略。

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