何展，王航，韓笑，馬天天，杭奕，俞慧飛，衛(wèi)芳芳，孫靜，楊永春，程昌勇，宋厚輝

浙江農(nóng)林大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，浙江 臨安 311300

單核細(xì)胞增多性李斯特菌 (簡(jiǎn)稱單增李斯特菌)是一種人畜共患的食源性胞內(nèi)寄生菌。在歐美西方國(guó)家暴發(fā)單增李斯特菌病的概率很高，并且每次都引起高死亡率[1]。單增李斯特菌病在免疫力低下的人群、孕婦及胎兒中多發(fā)，主要癥狀表現(xiàn)為敗血癥、腦膜炎、單核細(xì)胞增多和胎兒流產(chǎn)等[2-3]。單增李斯特菌的感染過(guò)程都需要毒力因子的參與，其中關(guān)鍵步驟包括：宿主細(xì)胞粘附和侵襲，細(xì)胞內(nèi)增殖和運(yùn)動(dòng)以及細(xì)胞間傳播[4]。在單增李斯特菌中PrfA是毒力因子，可維持細(xì)菌胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)；內(nèi)化素 (InlA和InlBv) 介導(dǎo)細(xì)菌對(duì)宿主細(xì)胞的黏附、內(nèi)化；溶血素 (LLO) 和磷脂酰肌醇磷脂酶 (PlcA) 裂解吞噬體膜；磷脂酶(PlcA和PlcB) 參與細(xì)菌的逃逸過(guò)程[5-7]。

氨基肽酶作為一種水解酶，可能參與單增李斯特菌毒力因子修飾，進(jìn)而與細(xì)菌感染過(guò)程存在某種關(guān)聯(lián)。氨基肽酶是針對(duì)寡肽、多肽和蛋白質(zhì)釋放N-末端氨基殘基的酶，不僅能夠完全降解蛋白質(zhì)和多肽，使得組分氨基酸被重新利用；而且用于蛋白質(zhì)翻譯后加工，使得蛋白質(zhì)在到達(dá)正確的空間位置或處于必需的生理發(fā)育環(huán)境前無(wú)法被激活[8]。多數(shù)氨基肽酶屬于金屬蛋白酶，其基因中存在 H-E-X-X-H (His-Glu-X-X-His) 活性位點(diǎn)序列對(duì)于催化和配位金屬離子是必需的。金屬蛋白酶活性由一個(gè)或兩個(gè)二價(jià)離子 (通常是鋅) 介導(dǎo)，這些離子激活水分子以進(jìn)行底物肽鍵的親核攻擊，進(jìn)而起到降解、加工、抑制等作用[9]。金屬蛋白酶對(duì)機(jī)體也具有多樣性的功能，例如基質(zhì)金屬蛋白酶 (MMPs) 是參與細(xì)胞外基質(zhì)降解的酶，其生物學(xué)功能不僅僅是蛋白水解功能，還包括誘導(dǎo)復(fù)合信號(hào)傳導(dǎo)以及誘導(dǎo)獨(dú)立于蛋白水解活性的癌細(xì)胞遷移等[10-11]。

單增李斯特菌中l(wèi)mo1603和lmo1711被注釋為編碼氨基肽酶的基因。此前本實(shí)驗(yàn)室已證實(shí)Lmo1603具有氨基肽酶的性質(zhì)，但Lmo1711是否具有氨基肽酶活性尚未知曉。本研究表達(dá)并純化得到了高純度 Lmo1711蛋白，以氨基酸-對(duì)硝基苯胺作為底物鑒別出Lmo1711具有氨基肽酶的活性和對(duì)于底物的選擇性；而加入不同金屬離子產(chǎn)生的酶活性差異表明這些金屬離子對(duì)Lmo1711活性增強(qiáng)效果不同。以上結(jié)果證實(shí)了Lmo1711屬于氨基肽酶M29家族成員，具有高度的金屬離子依賴性，為進(jìn)一步探討lmo1711在單增李斯特菌體內(nèi)發(fā)揮的作用和功能奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、質(zhì)粒以及引物

本試驗(yàn)中所用到的菌株及質(zhì)粒包括：?jiǎn)卧隼钏固鼐鷧⒖季?EGD-e、大腸桿菌 DH5α和Rosetta、重組蛋白原核表達(dá)載體 pET30a(+)，以上菌株和質(zhì)粒均為本試驗(yàn)室保存。單增李斯特菌培養(yǎng)于BHI (Brain heart infusion，BHI) 培養(yǎng)基，DH5α和Rosetta菌株培養(yǎng)于LB培養(yǎng)基中。本試驗(yàn)所涉及菌株的培養(yǎng)條件均為37 ℃ (靜置或振蕩) 培養(yǎng)，試驗(yàn)涉及引物為 (下劃線表示酶切位點(diǎn))：lmo1711-fwd:5'-CGG GGTACCATGACAGTATTTAGTGAAAAGT TAGAAAAGTATGC-3'；lmo1711-rev: 5'-CGCGGATCC TTAGAACGCCCA GTCGCCTTTA-3'。

1.1.2 試劑

BHI培養(yǎng)基購(gòu)自O(shè)xoid公司；LB培養(yǎng)基購(gòu)自上海生工生物工程有限公司；KOD plus Neo PCR試劑盒購(gòu)自 Toyobo公司；PCR產(chǎn)物純化和回收試劑盒購(gòu)自上海萊楓生物科技有限公司；限制性核酸內(nèi)切酶購(gòu)自NEB公司；質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自天根生化科技有限公司；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒購(gòu)自碧云天公司；鎳柱親和層析柱購(gòu)自北京韋氏博慧色譜科技有限公司；氨基酸-對(duì)硝基苯胺均購(gòu)自Sigma-Aldrich公司；本試驗(yàn)所用化學(xué)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 Lmo1711蛋白生物信息學(xué)分析

根據(jù) Uniprot網(wǎng)站預(yù)測(cè)，單增李斯特菌Lmo1711全長(zhǎng)410 aa，分子量45 kDa，無(wú)信號(hào)肽，屬于M29.002家族。而MEROPS網(wǎng)站分析，M29家族氨基肽酶典型特征是鈷離子依賴性，并且保守位點(diǎn)是 Glu-Glu-His-Tyr-His-Asp。利用 CLC Sequence Viewer 6軟件將單增李斯特菌的Lmo1711氨基酸序列同其他細(xì)菌氨基肽酶序列進(jìn)行比較，分析關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)或區(qū)域，同時(shí)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)；在 Swiss Model Workspace中以肺炎鏈球菌Streptococcus pneumonia ePepS為模板，對(duì)Lmo1711的空間結(jié)構(gòu)進(jìn)行模擬比對(duì)。

1.2.2 Lmo1711重組原核蛋白表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)下載lmo1711基因序列(GenBank 登錄號(hào)NC_003210.1)，導(dǎo)入Vector NTI軟件設(shè)計(jì)出針對(duì)lmo1711完整ORF引物，命名為lmo1711-fwd和lmo1711-rev。lmo1711與本實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)庫(kù)中的pET30a模擬構(gòu)建重組質(zhì)粒。通過(guò)PCR對(duì)目的基因擴(kuò)增，然后對(duì)載體和目的片段用KpnⅠ和BamH Ⅰ進(jìn)行雙酶切反應(yīng)，酶切產(chǎn)物以 T4DNA連接酶過(guò)夜連接，最后將酶連產(chǎn)物熱擊轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞。通過(guò)PCR篩選得到攜帶重組質(zhì)粒 (根據(jù)實(shí)驗(yàn)室命名規(guī)則，命名為pSL350) 的重組菌株，經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證正確后用于下一步的蛋白表達(dá)。

1.2.3 Lmo1711重組蛋白的原核表達(dá)與純化

將測(cè)序正確的重組表達(dá)質(zhì)粒 pSL350通過(guò)熱擊法轉(zhuǎn)入大腸桿菌Rosetta感受態(tài)細(xì)胞。取5 mL Rosetta-pSL350菌液轉(zhuǎn)接至500 mL LB (Kana)，待OD600為 0.6–0.8時(shí)，加入 IPTG (Isopropyl β-D-1- thiogalactopyranoside，異丙基-β-D-硫代半乳糖苷，工作濃度1 mmoL/L) 低溫誘導(dǎo)12 h。離心收集菌體，50 mmol/L PBS洗滌菌體2次，置于冰上超聲破碎后離心取上清與2.5 mL鎳柱4 ℃翻轉(zhuǎn)結(jié)合6 h。用30–300 mmol/L咪唑洗脫雜蛋白并收集目標(biāo)蛋白。收集到的目的蛋白進(jìn)行SDS-PAGE分析驗(yàn)證蛋白純度與大小。目的蛋白濃度用BCA試劑盒進(jìn)行測(cè)定。

1.2.4 Lmo1711氨基肽酶活性分析

試劑準(zhǔn)備：Lmo1711蛋白；25 mmol/L Tris-HCl (pH 7.4)；100 mmol/L氨基酸對(duì)硝基苯胺aa-pNA，本試驗(yàn)中選用 3種底物，分別是Arg-pNA、Leu-pNA、Lys-pNA。將各反應(yīng)成分混合后以200 μL體積 (Lmo1711工作濃度0.1 μmol/L，aa-pNA工作濃度0.1–10 mmol/L) 加入96孔板，振蕩混勻后，立即放入酶標(biāo)儀進(jìn)行檢測(cè)，游離的對(duì)硝基苯胺吸收峰值為405 nm。反應(yīng)溫度37 ℃，間隔時(shí)間1 h，連續(xù)讀數(shù)12 h。

1.2.5 Lmo1711氨基肽酶活性的金屬離子依賴性分析

為了驗(yàn)證Lmo1711是否具有金屬依賴性，選取 Co2+、Zn2+、Mn2+、Cd2+等氨基肽酶常見(jiàn)輔助金屬離子，以相同工作濃度 (0.5 mmol/L)加入反應(yīng)體系，底物為 Leu-pNA，測(cè)定產(chǎn)物濃度。反應(yīng)溫度37 ℃，間隔時(shí)間5 min，連續(xù)讀數(shù)60 min。

2 結(jié)果

2.1 單增李斯特菌 Lmo1711屬于氨基肽酶M29家族

單增李斯特菌M29家族的代表性成員有：氨基肽酶T(AmpT)、氨基肽酶Ⅱ(AmpⅡ)、PepS氨基肽酶、氨基肽酶S(AmpS)，它們分別屬于001、002、004和005亞族，其中Lmo1603屬于AmpT。通過(guò)氨基酸序列比對(duì)，推測(cè)Lmo1711保守活性位點(diǎn)是 Glu250、Glu316、His345、Tyr352、His378、Asp380 (圖1A)。進(jìn)化樹(shù)分析發(fā)現(xiàn)，Lmo1711與之前報(bào)道的AmpT Lmo1603親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，而與來(lái)自嗜熱菌中的氨基肽酶Ⅱ(AmpⅡ M29.002) 進(jìn)化關(guān)系最近，與 UniProt網(wǎng)站預(yù)測(cè)結(jié)果一致 (圖1B)。以PepS (PDB:4ICQ) 為模板利用SWISS-MODEL Workspace對(duì)Lmo1711蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行模擬，發(fā)現(xiàn)兩者的空間折疊結(jié)構(gòu)高度相似，即Lmo1711的催化結(jié)構(gòu)域亦是二聚體的非對(duì)稱結(jié)構(gòu)。此外，Lmo1711與同屬于 M29家族的AmpS(PDB：1ZJC)、AmpT(PDB:2AYI)、AmpⅡ等結(jié)構(gòu)非常類似，所有保守活動(dòng)區(qū)域均處于該結(jié)構(gòu)域中 (圖 2)。根據(jù)以上生物信息學(xué)分析，推測(cè)單增李斯特菌lmo1711基因編碼的蛋白質(zhì)與M29家族其他的氨基肽酶可能存在相似的性質(zhì)。

2.2 成功構(gòu)建Lmo1711重組表達(dá)載體

利用PCR擴(kuò)增出EGD-elmo1711目的片段，結(jié)果顯示在1 347 bp處出現(xiàn)了明顯條帶 (圖3A)，與理論大小一致。PCR產(chǎn)物與蛋白表達(dá)載體pET30a(+)重組。轉(zhuǎn)化后挑取若干單菌落接種于LB Kana培養(yǎng)基。以EGD-e為陽(yáng)性對(duì)照，利用菌液PCR驗(yàn)證得到符合目的條帶大小的陽(yáng)性質(zhì)粒，目的條帶大小仍在1 347 bp (圖3B)。將測(cè)序正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入E. coliRosetta，得到 Lmo1711蛋白表達(dá)菌株。

2.3 成功表達(dá)與純化Lmo1711重組蛋白

通過(guò)UniProt網(wǎng)站以及Vector NTI軟件分析預(yù)測(cè)Lmo1711蛋白大小在44.96 kDa，與His-tag融合后的大小在49.3 kDa。采用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)誘導(dǎo)蛋白表達(dá)，在蛋白純化后用SDS-PAGE分析，顯示純化蛋白有明顯的單一條帶，大小與預(yù)測(cè)值一致 (圖3C)。以上結(jié)果證實(shí)已成功獲得重組Lmo1711蛋白，可用于體外酶活試驗(yàn)。

2.4 Lmo1711具有氨基肽酶的活性

Lmo1711能夠水解不同種類的氨基酸-對(duì)硝基苯胺，而且對(duì)不同的底物水解強(qiáng)度也存在差異。Lmo1711水解Leu-pNA的能力要強(qiáng)于水解Arg-pNA和Lys-pNA (圖4A，4B)。證實(shí)Lmo1711作為氨基肽酶對(duì)底物具有選擇性，且優(yōu)先水解Leu-pNA。

2.5 Lmo1711具有金屬離子依賴性

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，多種金屬離子均能夠增強(qiáng)Lmo1711的水解能力，且對(duì)酶活的增強(qiáng)存在較大的差異。加入Co2+后 Lmo1711的活性極顯著增強(qiáng)，約 4 min后就超出酶標(biāo)儀測(cè)量量程 (圖4D)；加入其他金屬離子Lmo1711的活性也得到不同程度的提升 (圖 4C)。Co2+在0.5 mmol/L基礎(chǔ)上稀釋100倍后加入反應(yīng)體系，仍可以顯著增強(qiáng)Lmo1711的水解能力 (圖4E)。由此證實(shí)Lmo1711屬于金屬依賴性氨基肽酶，其中Co2+催化Lmo1711氨基肽酶的水解能力最強(qiáng)。

圖1 M29家族部分氨基肽酶氨基酸序列比對(duì)(“*”為推測(cè)的活性位點(diǎn)) (A) 和進(jìn)化關(guān)系分析 (B)Fig. 1 Amino acid sequence alignment (A) and phylogenetic tree (B) of Lmo1711 and the members of the M29 aminopeptidase family. The predicted active sites are denoted with “*”.

圖2 以M29家族多種氨基肽酶晶體結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)模擬Lmo1711空間結(jié)構(gòu)Fig. 2 Predicted protein structure of Lmo1711 based on the templates with known crystal structures from the members of the M29 aminopeptidase.

圖3 lmo1711的全基因序列(A)、陽(yáng)性克隆驗(yàn)證電泳圖 (B) 及表達(dá)產(chǎn)物SDS-PAGE分析 (C)Fig. 3 Verification of the recombinant Lmo1711 expression strains using PCR (A-B) and protein purification using SDS-PAGE analysis (C).

圖4 Lmo1711對(duì)不同底物的催化能力及金屬離子對(duì)該酶活性的影響Fig. 4 Enzymatic characteristics of the recombinant Lmo1711. (A-B) Kinetic aminopeptidase activity of Lmo1711 using 1 mmol/L or 10 mmol/L Leu-pNA, Arg-Pna or Lys-pNA as the substrate. (C-E) Effects of metal ions (Mg2+, Fe3+,Zn2+, Mn2+ and Co2+) on enzymatic activity of Lmo1711.

3 討論

本研究證實(shí)Lmo1711在體外所具有的氨基肽酶活性和金屬依賴性，而M29家族中眾多嗜熱菌來(lái)源的氨基肽酶也具有類似的性質(zhì)。例如：氨基肽酶T具有廣泛的底物特異性，但會(huì)優(yōu)先水解釋放 Leu、Val、Phe或 Tyr，受到 EDTA或 1,10-鄰菲咯啉抑制劑抑制時(shí)，通過(guò)添加外源 Co2+可恢復(fù)其活性。嗜熱脂肪芽孢桿菌氨基肽酶Ⅱ同樣顯示出對(duì)亮氨-酸對(duì)硝基苯胺 (Leu-pNA) 的顯著偏好[12-13]，而PepS氨基肽酶 (M29.004)[14]與氨基肽酶S(M29.005) 同樣也與Lmo1711性質(zhì)相似[15]。迄今為止，除了細(xì)菌外，還在古生菌 (Archaeobacteria)和植物中鑒定出編碼M29氨基肽酶的基因，然而只有來(lái)自水生棲熱菌、嗜熱棲熱菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌和嗜熱鏈球菌的氨基肽酶才被認(rèn)為是該家族真正的成員[16]?；谶M(jìn)化樹(shù)分析，Lmo1711與氨基肽酶S、氨基肽酶Ⅱ、氨基肽酶T和PepS氨基肽酶同屬M(fèi)29家族，其中與嗜熱菌中的氨基肽酶Ⅱ (AmpⅡ M29.002) 進(jìn)化關(guān)系最為密切，推測(cè)Lmo1711屬于M29.002家族。氨基肽酶通常具有一些保守氨基酸位點(diǎn)，在結(jié)合和催化底物過(guò)程中起關(guān)鍵作用，如金黃色葡萄球菌AmpS的活性位點(diǎn)會(huì)通過(guò)溶劑分子 (可能是氫氧根離子) 和Glu319橋連后先結(jié)合兩個(gè)金屬離子，再借助Glu253和 His348的協(xié)助結(jié)合第 3個(gè)金屬離子，進(jìn)而暴露酶的活性中心[15]。根據(jù)氨基酸序列分析，Lmo1711具有6個(gè)保守氨基酸位點(diǎn)，分別為Glu250、Glu316、His345、Tyr352、His378、Asp380，這些位點(diǎn)可能決定了Lmo1711的酶活特性。

分泌型的細(xì)菌氨基肽酶都是單體，而胞內(nèi)酶則是單體或多聚體[17]。除了金屬蛋白酶TAPBb外，目前尚未發(fā)現(xiàn)M29家族的其他六聚體氨基肽酶，如水生棲熱菌和嗜熱脂肪芽孢桿菌的氨基肽酶 T是二聚體，嗜熱鏈球菌的 PepS是單體[16]。根據(jù)Biozentrum網(wǎng)站預(yù)測(cè)，Lmo1711為同源二聚體，三級(jí)結(jié)構(gòu)為細(xì)長(zhǎng)狀，其N端結(jié)構(gòu)域包括至少7個(gè)α-螺旋片段圍繞中心結(jié)構(gòu)，同時(shí)存在平行 β-折疊片段，C端有 2個(gè) β-折疊片段。TAPBb是致病微生物中最早發(fā)現(xiàn)的M29家族氨基肽酶，其六聚體結(jié)構(gòu)是發(fā)揮該酶活性的基礎(chǔ)[18]。另外，二硫鍵不參與 TAPBb的低聚組裝，因?yàn)槠鋯误w化不依賴于還原劑的存在，這與M29家族的部分成員以及其他氨基肽酶 (例如牛的亮氨酰氨基肽酶晶狀體和氨基肽酶A) 的結(jié)構(gòu)一致[18]。

本研究首次研究并證實(shí)單增李斯特菌 Lmo1711能夠特異性水解 N-末端具有芳香族化合物的多肽，且對(duì) Leu-pNA、Arg-pNA、Lys-pNA等底物具有不同親和力。在金屬離子催化下Lmo1711活性得到顯著增強(qiáng)，尤其以Co2+的激活效果最明顯。Lmo1711的6個(gè)保守位點(diǎn)對(duì)其催化或底物結(jié)合是否起到關(guān)鍵作用以及該蛋白在細(xì)菌體內(nèi)是否參與修飾毒力因子或相關(guān)蛋白的合成、加工及成熟尚未得知，因此我們下一步將針對(duì)Lmo1711在李斯特菌感染宿主過(guò)程中發(fā)揮的生物學(xué)功能及分子機(jī)制開(kāi)展深入研究。

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