胡莉琴，康信聰，沈鵬原，陳田，張家銀，劉東波,3,4

1 湖南農(nóng)業(yè)大學 園藝園林學院，湖南 長沙 410128

2 國家中醫(yī)藥管理局亞健康干預技術(shù)實驗室，湖南 長沙 410128

3 湖南省作物種質(zhì)創(chuàng)新與資源利用重點實驗室，湖南 長沙 410128

4 湖南省植物功能成分利用協(xié)同創(chuàng)新中心，湖南 長沙 410128

石杉堿甲 (Huperzine A，簡稱Hup A) 是一種我國自主研發(fā)的高效、低毒、可逆且高選擇性抑制乙酰膽堿酯酶的石松類生物堿，常用于老年癡呆癥、記憶障礙、重癥肌無力的治療[1-2]。在老年癡呆癥的治療中，與美國FDA批準的同類藥物他克林、多奈哌齊、利斯的明及加蘭他敏相比，Hup A的抗膽堿酯酶活性更高，作用持續(xù)時間更長，口服生物利用度更高，毒性作用更小[3-5]。石杉堿乙(HuperzineB，簡稱Hup B) 抑制活性為石杉堿甲的1/10，但Hup B具有更長的活性持續(xù)時間[6]。

顯著的療效與巨大的商業(yè)價值使得Hup A的價格節(jié)節(jié)攀升，純度為98%的Hup A出口價格已從2012年的200萬元/kg增至400多萬元/kg。雖然Hup A、Hup B在植株內(nèi)含量很低 (最高含量分別為0.090 0%、0.018 3%)，但目前Hup A、Hup B仍主要從野生蛇足石杉 (Huperzia se rrateT.) 等石松類石杉科石杉屬植物中直接提取。蛇足石杉生長條件苛刻、生長周期長[7-8]，過度開采導致該物種瀕臨滅絕，組織培養(yǎng)尚未成功；Hup A人工全合成步驟繁瑣、價格昂貴，無法獲得純光學活性合成物質(zhì)，Hup A至今未能實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化[9]，無法滿足市場用藥需求，制約了Hup A、Hup B的臨床發(fā)展。

自Stierle等首次從短葉紅豆杉Taxus brevifoliaN.的樹皮中分離到一種產(chǎn)紫杉醇的內(nèi)生真菌——安德紫杉菌Taxomyces andreanae[10]以來，內(nèi)生真菌合成與宿主植物相同或相似的次生代謝產(chǎn)物受到了極大的關(guān)注，為解決資源短缺、產(chǎn)量極低的藥物開發(fā)提供了新的思路。迄今，有關(guān)蛇足石杉內(nèi)生真菌的研究已有不少報道，2005年石瑋等[11]從采自安徽青陽的H.se rrata中分離出4株內(nèi)生真菌，分別屬于頂孢霉屬、單軸霉屬、酵母和青霉屬；韓文霞等[12-13]從浙江衢州烏巨山的H.serrate中分離出產(chǎn)Hup A的青霉菌與鐮孢菌。本實驗室從福建南平H.serrate中分離出具有合成Hup A、Hup B能力的內(nèi)生真菌膠胞炭疽tanju (Colletotrichum gloeosporioidesP. tanju)。目前，Hup A、HupB的HPLC方法學考察主要集中于石杉科植物H.serrate[6,14]，對內(nèi)生真菌發(fā)酵液中的Hup A、HupB HPLC檢測方法的考察未見報道。本文建立了內(nèi)生真菌tanju發(fā)酵液中Hup A、Hup B的HPLC測定方法，并以此方法檢測了 tanju菌發(fā)酵過程中次生代謝產(chǎn)物Hup A、Hup B的積累過程。Hup A、Hup B HPLC快速檢測方法的建立為后期內(nèi)生真菌膠胞炭疽合成Hup A、Hup B的機制研究奠定基礎(chǔ)，從而有利于藥物新資源的開發(fā)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

蛇足石杉 (采自福建南平)；內(nèi)生真菌膠胞炭疽 (本實驗室分離)；Hup A 標準品 (Aladdin)；Hup B標準品 (上海源葉生物科技有限公司)；甲醇為色譜純，醋酸銨、氯仿均為分析純 (國藥集團化學試劑有限公司)；Mettler Toledo pH計 (上海梅特勒-托利多儀器有限公司)。

主要儀器和設(shè)備：Agilent-1260 Infinity高效液相色譜；Mettler Toledo XS205型電子分析天平(上海梅特勒-托利多儀器有限公司)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海雅榮生化儀器設(shè)備有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)基的配制

馬鈴薯葡萄糖肉湯 (Potato dextrose broth，PDB) 培養(yǎng)基：去皮馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，加蒸餾水定容至1 L。

PDB加富培養(yǎng)基：去皮馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，酵母粉2 g，蛋白胨2 g，KH2PO41.5 g，MgSO40.5 g，NaCl 0.3 g，加蒸餾水定容至1 L后調(diào)節(jié)pH至6.5。

1.2.2 誘導子的制備

將新鮮的蛇足石杉去除根部，用自來水沖去泥土、腐葉，用超純水洗凈，吹干水分稱重，然后切碎。加入少許水將葉片打成漿汁，用8層紗布過濾，最后用超純水按1∶10的質(zhì)量體積比定容至一定體積，分裝121 ℃高壓蒸汽滅菌30 min，–20 ℃冰箱凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 內(nèi)生真菌tanju發(fā)酵培養(yǎng)和發(fā)酵液中Hup A、Hup B提取

內(nèi)生真菌炭疽 tanju置 PDB培養(yǎng)基中活化3 d，取1 mL菌絲于PDB加富培養(yǎng)基中培養(yǎng)5 d使菌絲量達到最高，加入誘導子5 mL后繼續(xù)培養(yǎng) (空白對照：PDB+5 mL誘導子)。加入誘導子培養(yǎng)至一定時間后采用真空泵分離菌液和菌絲，將分離的100 mL菌液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮至體積為30 mL，加等體積30 mL氯仿萃取1次，再體積減半氯仿再次萃取1次，合并濾液，揮干后加入2 mL色譜甲醇溶解，超聲10 min，混勻后過0.22 μm的微孔濾膜，濾液樣品待測。

1.2.4 HPLC檢測條件

Agilent Eclipse plus-C18色譜柱 (250 mm×4.6 mm, 5 μm)，流動相 0.015 mol/L 乙酸銨-甲醇溶液 (70∶30)，流速1 mL/min，柱溫35 ℃，進樣量10 μL。在波長選擇上，Hup A在308–310 nm均有很好的紫外吸收，而Hup B在308 nm上有良好的紫外吸收，故波長選用308 nm。在此色譜條件下，樣品中的Hup A、Hup B與其他峰能達到基線分離。

1.2.5 對照品制備

Hup A對照品：精密稱取Hup A對照品2.40 mg于25 mL容量瓶中以甲醇溶解并定容，得濃度為0.096 mg/mL對照品溶液，再分別稀釋成 48.0、24.0、12.0、6.0、3.0、1.5 μg/mL 的對照品供試液，待測。

Hup B對照品：精密稱取 Hup B對照品2.50 mg于25 mL容量瓶中以甲醇溶解并定容，得濃度為0.1 mg/mL對照品溶液，再分別稀釋成7.50、5.00、2.50、1.00、0.50、0.25 μg/mL 的對照品供試液，待測。

1.2.6 儀器精密性、樣品穩(wěn)定性、檢測限(LOD)、定量限 (LOQ) 和樣品加標回收率檢測方法

儀器精密：取制備好的Hup A和Hup B標準品，分別以進樣量10 μL連續(xù)進樣6次，計算其相對標準偏差 (RSD)。樣品穩(wěn)定性、LOD、LOQ：取供試樣品1份，將樣品于0、2、4、6、8、12 h進樣10 μL，按“1.2.4” HPLC條件測定峰面積，LOD和LOQ的測定是根據(jù)響應(yīng)的標準偏差以及標準曲線的校準曲線所得到的斜率[15]，LOD和LOQ分別表示為3.3a/S和10a/S(a表示響應(yīng)的標準偏差，S表示回歸線的斜率)。樣品加標回收率：取已測Hup A樣品加入0.4 mL Hup A對照品溶液 (濃度16.5 μg/mL)、取Hup B樣品加入0.4 mL Hup B對照品溶液 (濃度5.5 μg/mL)，得供試品樣液，微孔濾膜濾過，得加樣回收液，進樣10 μL，測定峰面積，回收率計算公式如下：

1.2.7 內(nèi)生真菌tanju發(fā)酵特性研究

在內(nèi)生真菌tanju菌株培養(yǎng)穩(wěn)定期 (菌培養(yǎng)至第5 天) 加入誘導子5 mL，連續(xù)檢測內(nèi)生真菌發(fā)酵液中第6–15天次生代謝產(chǎn)物Hup A、Hup B的含量，每天3個平行；同時檢測誘導子中Hup A、Hup B的含量。內(nèi)生真菌 tanju菌誘導后 Hup A/Hup B的含量=發(fā)酵液中總Hup A/Hup B含量–誘導子中Hup A/Hup B含量。

將從發(fā)酵液分離出的菌絲60 ℃干燥至恒重，冷卻稱重為干重，重復3次取平均值即為其生物量，菌液測定其pH。

2 結(jié)果與分析

2.1 線性關(guān)系的考察

將已制備的Hup A和Hup B對照品按“1.2.4”色譜條件測定，以進樣濃度對峰面積進行回歸，得標準曲線方程為：

其校準圖的相關(guān)系數(shù)r大于0.998 5[16-17]，可知當進樣量位于 1.50?48.00 μg/mL、0.25?7.50 μg/mL之間時，Hup A、Hup B的進樣量與峰面積呈良好線性關(guān)系。

2.2 儀器精密性、樣品穩(wěn)定性、LOD、LOQ和樣品加標回收率結(jié)果

Hup A、Hup B標準品分別連續(xù)進樣6次，其中Hup A標準品的峰面積RSD為0.31%，Hup B標準品的峰面積RSD為1.01%，結(jié)果表明儀器精密性良好。樣品按“1.2.6”測定峰面積，Hup A的峰面積RSD為1.23%；Hup B的峰面積RSD為2.40%，結(jié)果表明，供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。同時，Hup A的檢測限和定量限分別為0.42 μg/mL、0.81 μg/mL；Hup B 的檢測限和定量限分別為0.30 μg/mL、0.62 μg/mL。加樣回收率試驗結(jié)果見表1，結(jié)果表明Hup A的平均回收率為106.83%(RSD=3.34%，n=3)、Hup B的平均回收率為108.06% (RSD=3.60%，n=3)。

2.3 樣品中Hup A、Hup B檢測結(jié)果

將已制備好的樣品按“1.2.4”色譜條件重復分析3次，測得Hup A標準品的保留時間22.517 min(圖1A)，Hup B的保留時間10.413 min (圖1B)，內(nèi)生真菌發(fā)酵液中 Hup A、Hup B的保留時間分別為22.513 min、10.312 min (圖1C)，空白對照中Hup A、Hup B的保留時間分別為22.430 min、10.308 min (圖1D)，結(jié)果顯示發(fā)酵液和空白對照中Hup A、Hup B的保留時間和其對應(yīng)的標準品的保留時間基本一致。通過標準曲線計算誘導子和發(fā)酵液提取物中Hup A、Hup B的含量，測得發(fā)酵液中 Hup A、Hup B的平均濃度分別為19.248 9 μg/mL、6.442 4 μg /mL，誘導子中 Hup A、Hup B平均濃度分別為5.771 0 μg/mL、2.161 0 μg/mL，因此，膠胞炭疽合成Hup A、Hup B產(chǎn)量分別為13.477 9 μg/mL、4.281 4 μg /mL。

2.4 誘導子作用時間對內(nèi)生真菌tanju發(fā)酵液中Hup A、Hup B含量影響曲線

在前期研究中發(fā)現(xiàn)在生長穩(wěn)定期加入誘導子，其次生代謝產(chǎn)物Hup A、Hup B的含量更高，所以本試驗在tanju菌生長至第5天加入誘導子。結(jié)果如圖2所示，內(nèi)生真菌tanju發(fā)酵液中Hup A、Hup B的含量在誘導子加入后均有明顯提高，其含量均先增加后減少，隨后又升高繼而再繼續(xù)減少，發(fā)酵液中 Hup A含量在第 14天達到最高(12.417 0 μg/mL)，Hup B 在第 8天達到最高(4.660 3 μg/mL)。

表1 Hup A和Hup B加樣回收率試驗結(jié)果Table 1 Recoveries of Hup A and Hup B in samples

圖1 Hup A標準品 (A)、Hup B標準品 (B)、內(nèi)生真菌 tanju發(fā)酵液提取物 (C) 和誘導子提取物 (D)的HPLC圖Fig. 1 The HPLC chromatograms of the Hup A standard (A), the Hup B standard (B), sample extracted from endophytic fungi tanju (C) and sample extracted from elicitor (D). The standard content of Hup A is 24.0 μg/mL, and that of Hup B is 5.0 μg/mL.

圖2 內(nèi)生真菌tanju發(fā)酵液中Hup A、Hup B含量的變化Fig. 2 Effects of Hup A and Hup B contents in fermentation broth of endophytic fungus tanju.

2.5 內(nèi)生真菌tanju發(fā)酵培養(yǎng)特性研究

從圖3可以看出，菌株從第1天開始進入對數(shù)生長期，第4天生物量達到最大值，隨后進入穩(wěn)定生長期，第8天后菌株進入衰亡期。在對數(shù)生長前期，隨著菌絲量的迅速增加，對營養(yǎng)物質(zhì)的消耗和胞外降解導致發(fā)酵液pH值由6.50降至4.69，在酸性條件下，內(nèi)生真菌tanju生長狀況良好。隨后由于次生代謝產(chǎn)物的積累，發(fā)酵液 pH值回升，在菌絲生物量達到最高時，發(fā)酵液酸堿度趨于中性，進入衰亡后期培養(yǎng)液 pH值繼續(xù)緩慢上升，Hup A、Hup B積累期間培養(yǎng)液呈弱堿性(圖 3)。

圖3 內(nèi)生真菌tanju發(fā)酵生長曲線Fig. 3 Fermentation curves of endophytic fungi tanju.

3 討論

本文建立了HPLC測定內(nèi)生真菌tanju發(fā)酵液中Hup A、Hup B含量的方法。本課題組曾采用Agilent ZORBAX SB-C18進行Hup A、Hup B的檢測，但受色譜柱殘余硅羥基的影響，Agilent ZORBAX SB-C18對分析物產(chǎn)生強烈吸附而造成色譜峰嚴重拖尾。雖然本實驗室在流動相乙酸銨中加入 1%–3%的三乙胺 (pH 4–5)，可減少 Hup A、Hup B和殘余硅羥基的相互作用，峰形更尖銳、對稱性更高，有效減輕了色譜峰的拖尾現(xiàn)象，但保留時間大大減少，不利于各組分的分離，且易對色譜柱造成不可逆的損傷。因此，本實驗室選用了適合生物堿分離的Agilent Eclipse plus-C18色譜柱，該色譜柱改進了硅膠制造和鍵合技術(shù)，對于難分離的堿性化合物可獲得出色的峰形。本試驗證明該色譜柱在分離Hup A、Hup B時，峰對稱性良好，且與其他物質(zhì)能達到很好的基線分離。

本試驗所分離的內(nèi)生真菌 tanju在分離初期即使未誘導也可合成Hup A和Hup B，但隨著菌株保存時間的延長、傳代次數(shù)的增加，tanju菌在未添加誘導子的情況下，發(fā)酵液中檢測不到 Hup A與Hup B。本課題組在內(nèi)生真菌tanju發(fā)酵的第5天 (生長穩(wěn)定期) 添加誘導子，較生長初期添加誘導子Hup A、Hup B含量高。這可能是由于在早期添加誘導子，誘導子被用于合成初級代謝產(chǎn)物，或者生長早期細胞還沒有合成太多功能酶，誘導子的利用率較低，而在生長穩(wěn)定期添加，生物量有了一定的積累，受誘導子刺激后，即可合成次級代謝產(chǎn)物[18]。然而，Ballica等[19]曾提出誘導子在達指數(shù)生長期之前加入效果最好，可見添加誘導子因種屬不同而有所差別。另外，誘導子的種類、添加時間及濃度對內(nèi)生真菌次生代謝產(chǎn)物產(chǎn)量均有影響[20-22]。

相比直接從H.serrata等石松類植物提取獲得Hup A、Hup B，能夠合成Hup A、Hup B的內(nèi)生真菌具有更大的發(fā)展?jié)摿Γ驗閮?nèi)生真菌培養(yǎng)簡單、周期短，可進一步優(yōu)化培養(yǎng)條件[23]。此外，還可通過多種手段改造、提高菌種性能，例如誘變育種、深入研究Hup A合成關(guān)鍵酶、構(gòu)建Hup A高產(chǎn)工程菌[24-26]。通過內(nèi)生真菌發(fā)酵合成Hup A、Hup B是解決瀕危植物藥物開發(fā)的有效途徑。

[1]Xu HB, Wang XP, Liu GL. Pharmacological studies and clinical application of huperzine A. World Clin Drugs,2014, 35(1): 60–63 (in Chinese).徐紅冰, 王曉平, 劉皋林. 石杉堿甲的藥理研究及臨床應(yīng)用. 世界臨床藥物, 2014, 35(1): 60–63.

[2]Yu HY, Sun YM, Yang YJ. Advances in studies onHuperzia serrata. Chin Tradit Herb Drugs, 2001, 32(3):279–281 (in Chinese).余紅英, 孫遠明, 楊躍進. 草藥蛇足石杉的研究進展.中草藥, 2001, 32(3): 279–281.

[3]Zhu D, Wang J, Zeng Q, et al. A novel endophytic Huperzine A-producing fungus,Shiraiasp. Slf14,isolated fromHuperzia serrata. J Appl Microbiol, 2010,109(4): 1469–1478.

[4]Damar U, Gersner R, Johnstone JT, et al. Huperzine A: a promising anticonvulsant, disease modifying, and memory enhancing treatment option in Alzheimer’s disease. Med Hypotheses, 2017, 99: 57–62.

[5]Yang GY, Wang YY, Tian JZ, et al. Huperzine a for Alzheimer’s disease: a systematic review and meta-analysis of randomized clinical trials. PLoS ONE,2013, 8(9): e74916.

[6]Zhou XL, Yuan JQ, Wang S, et al. Determination of huperzine A and huperzine B inHuperzia s erratacollected at diffefent collecting times by HPLC. China J Tradit Chin Med Pharm, 2013, 28(2): 504–506 (in Chinese).周小雷, 袁經(jīng)權(quán), 王碩, 等. HPLC法測定不同季節(jié)千層塔中石杉堿甲和石杉堿乙含量. 中華中醫(yī)藥雜志,2013, 28(2): 504–506.

[7]Yuan JQ, Zhou XL, Wang S, et al. Simultaneous determination of huperzine A and huperzine B in different parts ofHuperzia s erratafrom different habitats by HPLC. Chin J Pharm Anal, 2012, 32(9):1541–1544, 1549 (in Chinese).袁經(jīng)權(quán), 周小雷, 王碩, 等. HPLC測定不同產(chǎn)地與不同部位千層塔中石杉堿甲和石杉堿乙含量. 藥物分析雜志, 2012, 32(9): 1541–1544, 1549.

[8]Ma XQ, Gang DR.In vitroproduction of Huperzine A, a promising drug candidate for Alzheimer’s disease.Phytochemistry, 2008, 69(10): 2022–2028.

[9]Ma XQ, Tan CH, Zhu DY, et al. A survey of potential huperzine A natural resources in China: the Huperziaceae. J Ethnopharmacol, 2006, 104(1/2):54–67.

[10]Stierle A, Strobel G, Stierle D. Taxol and taxane production byTaxomyces a ndreanae, an endophytic fungus of Pacific yew. Science, 1993, 260(5105):214–216.

[11]Shi W, Luo JP, Ding ZH, et al. Isolation and identification of endophytic fungi ofHuperzia serrata.Chin Tradit Herb Drugs, 2005, 36(2): 281–283 (in Chinese).石瑋, 羅建平, 丁振華, 等. 千層塔內(nèi)生真菌分離鑒定的初步研究. 中草藥, 2005, 36(2): 281–283.

[12]Han WX, Song T, Yang SZ, et al. Identification of alkaloids and huperzine A-producing endophytic fungi isolated from wildHuperzia serrata. J Int Pharm Res,2015, 42(4): 507–512 (in Chinese).韓文霞, 宋濤, 楊時珍, 等. 野生蛇足石杉產(chǎn)生物堿和石杉堿甲內(nèi)生真菌分離鑒定. 國際藥學研究雜志,2015, 42(4): 507–512.

[13]Han WX, Li WZ, Li XF, et al. Detection and identification of high producing Huperzine A by an endophytic fungus fromHuperzia serrata. J Int Pharm Res, 2016, 43(6): 1112–1116 (in Chinese).韓文霞, 李偉澤, 李小峰, 等. 蛇足石杉內(nèi)生真菌產(chǎn)石杉堿甲含量檢測及真菌的鑒定. 國際藥學研究雜志,2016, 43(6): 1112–1116.

[14]Zhang JC, Wei J, Zhong HM, et al. Determination of Huperzine A in the extract ofHuperzia serrataby high performance liquid chromatography. Chin J Chromatogr,2013, 31(1): 79–82 (in Chinese).張敬彩, 魏杰, 鐘虹敏, 等. 高效液相色譜法定量測定中藥千層塔提取物中的石杉堿甲. 色譜, 2013,31(1): 79–82.

[15]Francisco MLD, Resurreccion AVA. Development of a reversed-phase high performance liquid chromatography(RP-HPLC) procedure for the simultaneous determination of phenolic compounds in peanut skin extracts. Food Chem, 2009, 117(2): 356–363.

[16]Li CC, Farn SS, Yeh YH, et al. Development and validation of an anion-exchange HPLC method for the determination of fluoride content and radiochemical purity in [18F]NaF. Nucl Med Biol, 2011, 38(4):605–612.

[17]Ji M, Li Q, Ji H, et al. Investigation of the distribution and season regularity of resveratrol inVitis amur ensisvia HPLC-DAD-MS/MS. Food Chem, 2014, 142: 61–65.

[18]Li JR, Liu MX, Cao MD, et al. Effects ofPenicillum citrinumelicitor on the biosynthesis of taxol in suspension cell cultures ofTaxus chinensis. Bull Bot Res,1998, 18(1): 78–82 (in Chinese).李家儒, 劉曼西, 曹孟德, 等. 桔青霉誘導子對紅豆杉培養(yǎng)細胞中紫杉醇生物合成的影響. 植物研究,1998, 18(1): 78–82.

[19]Ballica R, Ryu DDY. Effects of rheological properties and mass transfer on plant cell bioreactor performance:production of tropane alkaloids. Biotechnol Bioeng,1993, 42(10): 1181–1189.

[20]Wang C, Tan YY, Yang SW, et al. Effects of different inducers on endophytic fungi ofCinnamomum longepaniculatum. J Anhui Agri Sci, 2017, 45(20):14–17, 45 (in Chinese).汪超, 譚韻雅, 楊勝偉, 等. 不同誘導子對油樟內(nèi)生菌次生代謝產(chǎn)物的影響. 安徽農(nóng)業(yè)科學, 2017, 45(20):14–17, 45.

[21]Chen YQ, Zhu WH, Wu YQ, et al. Effects of fungus elicitors on taxol production in suspension cells ofTaxus yunnanensis. Chin J Biotech, 1999, 15(4): 522–524 (in Chinese).陳永勤, 朱蔚華, 吳蘊祺, 等. 幾種真菌誘導子對云南紅豆杉細胞產(chǎn)生紫杉醇的影響. 生物工程學報,1999, 15(4): 522–524.

[22]Li Y, Zhao L, Cui L, et al. Effects of elicitors on growth of adventitious roots and contents of secondary metabolites inTripterygium wilfor diiHook. f. Chin J Biotech, 2015, 31(5): 734–743 (in Chinese).李琰, 趙磊, 崔蕾, 等. 誘導子對雷公藤不定根生長和次生代謝產(chǎn)物含量的影響. 生物工程學報, 2015,31(5): 734–743.

[23]Ji ZD, Tu YS, Chen M, et al. Conditional optimization and kinetic research on producing huperzine A usingHuperzia serratain vitro. Chin Tradit Herb Drugs, 2016,47(3): 488–492 (in Chinese).吉枝單, 涂藝聲, 陳曼, 等. 蛇足石杉離體培養(yǎng)產(chǎn)石杉堿甲的條件優(yōu)化及動力學研究. 中草藥, 2016,47(3): 488–492.

[24]Zhang XM, Wang ZQ, Jan S, et al. Expression and functional analysis of the lysine decarboxylase and copper amine oxidase genes from the endophytic fungusColletotrichum gloeosporioidesES026. Sci Rep, 2017,7(1): 2766.

[25]Yang MQ, You WJ, Wu SW, et al. Global transcriptome analysis ofHuperzia serrateand identification of critical genes involved in the biosynthesis of huperzine A. BMC Genomics, 2017, 18(1): 245.

[26]Du C, Li J, Tang YT, et al. Cloning, prokaryotic expression and characterization of lysine decarboxylase gene fromHuperzia serrata. Chin J Biotech, 2014, 30(8):1299?1307 (in Chinese).杜次, 李菁, 唐云濤, 等. 蛇足石杉賴氨酸脫羧酶基因的克隆、原核表達及其功能分析. 生物工程學報,2014, 30(8): 1299?1307.