李文慧，石大林，賈茹涵，楊靜，張艷艷，陳衛(wèi)，韓躍武

蘭州大學(xué) 生物化學(xué)與分子生物學(xué)實驗室，甘肅 蘭州 730000

世界衛(wèi)生組織 (WHO) 公布，2012年全世界有超過 50萬的宮頸癌新發(fā)病例，其中超過 85%的病例來自發(fā)展中國家。據(jù)全國腫瘤登記中心統(tǒng)計，2011年我國宮頸癌新發(fā)病例87 000人，死亡病例23 000人，近30年來宮頸癌發(fā)病率呈上升趨勢，且發(fā)病高峰趨于年輕化。宮頸癌早期沒有明顯癥狀和體征，及早發(fā)現(xiàn)宮頸癌前病變，并通過治療阻斷癌前病變的發(fā)展，可最大程度降低宮頸癌的發(fā)生率，因此尋找宮頸癌前病變診斷的生物標(biāo)志物具有重要意義。1990年 Tuerk等[1]和Ellington等[2]分別報道了應(yīng)用指數(shù)富集配體系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù) (Sysrematie evolution of ligands by exponential enriehmen，SELEX) 篩選得到能與噬菌體 T4 DNA聚合酶和有機(jī)染料特異性結(jié)合的RNA 片段，并命名為“適配子”或“配體”[3]。該技術(shù)原理是利用大容量的隨機(jī)單鏈寡核苷酸文庫進(jìn)行體外多輪篩選、擴(kuò)增，并最終獲得與非核酸靶分子高親和力、高特異性結(jié)合的寡核苷酸序列[4]。大容量的隨機(jī)單鏈寡核苷酸文庫進(jìn)行體外多輪篩選適配體是折疊成特異性3D結(jié)構(gòu)的具有高親和力的單鏈DNA或RNA，能夠特異性結(jié)合多肽、蛋白質(zhì)[5]、細(xì)胞[6]乃至整個器官的靶分子[7-9]。另外，適配子在一些生理條件下，可通過反義寡核苷酸雜交使其失活，因此可以用于設(shè)計解毒劑[10]。近年來，隨著研究的不斷深入，越來越多實驗結(jié)果表明相比于抗體，適配子具有更強(qiáng)的親和力、熱穩(wěn)定性、靶標(biāo)多樣性、高特異性、可化學(xué)合成等優(yōu)點[11-15]，可以代替抗體用于疾病的診斷、醫(yī)藥學(xué)和工業(yè)等領(lǐng)域[16]。本研究采用SELEX技術(shù)篩選宮頸癌前病變宮頸脫落細(xì)胞特異性適配子庫[17-18]，并通過特異性、親和力分析和細(xì)胞免疫熒光確立高特異性適配子，可作為宮頸癌前病變診斷標(biāo)志物，為宮頸癌前病變分子診斷奠定理論基礎(chǔ)，提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣本

實驗所用樣本均取自液基薄層細(xì)胞檢測結(jié)果為：正常、炎性、上皮內(nèi)低級別病變 (CIN1) 上皮內(nèi)高級別病變 (CIN2、CIN3) 和鱗狀細(xì)胞癌宮頸脫落細(xì)胞，所有樣本由甘肅迪安同享醫(yī)學(xué)檢驗中心提供。

1.1.2 隨機(jī)ssDNA文庫及引物

由Prime Premier 5.0軟件設(shè)計隨機(jī)ssDNA文庫及引物 (表1)[19]，隨機(jī)ssDNA文庫5′端和3′端均為18個堿基固定序列，中間N(54)為54個堿基隨機(jī)序列。上游引物 P1與 ssDNA文庫 5′端固定序列相同，下游引物P2與ssDNA文庫3′端固定序列互補，同時合成5′端FITC熒光標(biāo)記的上游引物 P3。上述均由生工生物工程 (上海)股份有限公司合成。

表1 隨機(jī)ssDNA文庫及引物序列Table 1 Sequences of random ssDNA library and primer

1.2 方法

1.2.1 PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件優(yōu)化

經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定隨機(jī)ssDNA文庫及引物是否構(gòu)建成功并確定其條帶位置，同時確定dsDNA條帶的位置，作為后續(xù)實驗PCR產(chǎn)物目的條帶的參考標(biāo)準(zhǔn)。

以 50 μL 反應(yīng)體系 (模板、引物各 2 μL，2×PCR Master Mix 25 μL，ddH2O 19 μL) 進(jìn)行PCR擴(kuò)增 (95 ℃變性30 s，退火1 min，72 ℃延伸30 s)，經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，ImageJ作灰度分析，確定對稱PCR最佳退火溫度及循環(huán)次數(shù)[20-22]、間接不對稱PCR擴(kuò)增反應(yīng)最佳循環(huán)數(shù)及最佳上下游引物濃度比[23]。

1.2.2 適配子庫篩選

參照文獻(xiàn)采用SELEX技術(shù)進(jìn)行適配子篩選[24]。篩選過程如下：

①細(xì)胞預(yù)處理：脫落細(xì)胞經(jīng)磷酸鹽緩沖液洗滌數(shù)次后用 120目鋼濾過濾，細(xì)胞計數(shù)板計數(shù)，凍存于–80 ℃超低溫冰箱。每次實驗取出細(xì)胞凍存管放置37 ℃水浴鍋1 min，離心收集細(xì)胞。②ssDNA 文庫預(yù)處理：取 ssDNA文庫加入500 μL結(jié)合緩沖液，沸水浴5 min，冰浴10 min。③篩選：向預(yù)處理的ssDNA文庫中加入15 μL 3%BSA以降低非特異性吸附，將其與陰性細(xì)胞 (正常、炎性) 37 ℃孵育結(jié)合，離心取上清，收集與反篩細(xì)胞不結(jié)合的核酸。再將收集的核酸與陽性細(xì)胞 (上皮內(nèi)低級別病變 (CIN1)、上皮內(nèi)高級別病變 (CIN2、CIN3) 和鱗狀細(xì)胞癌) 37 ℃孵育結(jié)合，離心取沉淀，加入洗滌緩沖液洗滌以棄去未與細(xì)胞結(jié)合的核酸，再加入200 μL洗脫緩沖液，離心取上清，收集得到與正篩細(xì)胞結(jié)合的核酸。④次級文庫獲得：收集到的核酸經(jīng)苯酚∶氯仿∶異戊醇法純化后，經(jīng)間接不對稱PCR擴(kuò)增、回收單鏈作為下一輪篩選的次級文庫。⑤測定結(jié)合率：以每輪篩選獲得的次級文庫為模板進(jìn)行間接不對稱PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增得到熒光素標(biāo)記的ssDNA。取200 pmol熒光修飾的ssDNA和1 000 μL結(jié)合緩沖液，沸水浴5 min，冰浴10 min；分別與2×106個/mL陰性細(xì)胞、陽性細(xì)胞37 ℃孵育結(jié)合30 min，熒光分光光度計測定總熒光強(qiáng)度；回收細(xì)胞懸液離心后用洗滌緩沖液洗滌3次，重懸于1 000 μL結(jié)合緩沖液中，熒光分光光度計測定熒光強(qiáng)度值，測3次取平均值；不加熒光修飾的ssDNA為空白對照。根據(jù)ssDNA文庫與細(xì)胞結(jié)合率=熒光強(qiáng)度平均值/總熒光值×100%，分別計算各輪篩選獲得的次級文庫與陽性細(xì)胞及陰性細(xì)胞的結(jié)合率判斷篩選進(jìn)度。⑥整個篩選過程通過不斷增加篩選壓力，如減少加入的ssDNA量、減少孵育時間、增加洗滌次數(shù)，以獲得高親和力、高特異性適配子庫。經(jīng)過10–12輪篩選，次級文庫與靶細(xì)胞結(jié)合強(qiáng)度不再增加，達(dá)到平臺期則篩選終止。篩選條件見表2。⑦將最終獲得的 ssDNA核酸適配子庫送生工生物工程 (上海) 股份有限公司克隆測序，運用DNAMAN軟件進(jìn)行一級結(jié)構(gòu)同源性分析。

1.2.3 高特異性適配子確立

測序后，選擇長度正確且沒有雙峰的適配子，將其轉(zhuǎn)化菌經(jīng)培養(yǎng)、質(zhì)粒抽提，制備熒光素標(biāo)記的ssDNA。

1) 特異性測定：取200 pmol熒光素標(biāo)記的適配子加入1 000 μL結(jié)合緩沖液，沸水浴5 min，冰浴10 min；分別與2×106個/mL陰性細(xì)胞、陽性細(xì)胞37 ℃孵育結(jié)合30 min，離心去上清，洗滌緩沖液洗滌 3次，重懸于 1 000 μL結(jié)合緩沖液中，測定熒光強(qiáng)度值，測3次取平均值。

2) 親和力分析：制備不同濃度熒光素標(biāo)記的適配子，取等體積適配子加入1 000 μL結(jié)合緩沖液，沸水浴 5 min，冰浴 10 min；分別與 2×106個/mL陽性細(xì)胞37 ℃孵育結(jié)合30 min，離心去上清，洗滌緩沖液洗滌3次，重懸于1 000 μL結(jié)合緩沖液中，測定熒光強(qiáng)度值，測3次取平均值。根據(jù)公式Y(jié)=Bmax×X/ (Kd+X)，運用 SigmaPlot 12.1軟件，在非線性分析Regression Wizard公式類型中選擇雙曲線 (Hyperbola) 的類型，對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，結(jié)合SPSS 16.0軟件得出各適配子與宮頸癌前病變宮頸脫落細(xì)胞的平衡解離常數(shù)Kd值。

3) 細(xì)胞免疫熒光：根據(jù)特異性及親和力分析結(jié)果確立高特異性適配子，進(jìn)一步明確該適配子能夠與子宮頸癌前病變宮頸脫落細(xì)胞特異性結(jié)合。分別取 1×106個/mL陰性細(xì)胞、陽性細(xì)胞爬片后經(jīng)4%多聚甲醛固定30 min，0.01 mol/L PBS洗滌3次，每次5 min；抗原修復(fù)液沸水浴10 min，0.01 mol/L PBS洗滌 3次，每次 5 min；1%Triton-X100通透10 min，傾去后加入10%正常山羊血清37 ℃恒溫封閉30 min；傾去封閉液后加入熒光素標(biāo)記的適配子 (由生工生物工程 (上海) 股份有限公司合成)，4 ℃避光過夜；0.01 mol/L PBS洗滌 3次，每次 5 min；抗熒光衰減封片劑 (含DAPI) 封片后觀察。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件優(yōu)化結(jié)果

以文庫為模板，經(jīng)對稱PCR后得到90 bp的dsDNA目的條帶，即 ssDNA文庫及引物構(gòu)建成功。根據(jù)2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定 (圖1)，確定對稱PCR擴(kuò)增反應(yīng)最佳循環(huán)數(shù)為15個循環(huán)；最佳退火溫度為49.5 ℃；間接不對稱PCR擴(kuò)增反應(yīng)最佳循環(huán)數(shù)為35個循環(huán)；最佳上下游引物濃度比為80∶1。

圖1 PCR條件優(yōu)化Fig. 1 Optimization of PCR conditions. (A) The verification result of random ssDNA library, primer and ssDNA PCR products. 1: random ssDNA library; 2?3: primer; 4: ssDNA PCR products. (B) Optimization of symmetry PCR conditions. A?H annealing temperature: 55, 54.5, 53.5, 51.7, 49.5, 47.8, 46.6, 46 ℃; 1?7 cycle times: 5, 8, 10, 12, 15,20, 25. (C) Optimization of indirect asymm PCR conditions. A?D cycle times: 30, 35, 40, 45; 1?5 primer concentration ratio: 10:1, 30:1, 50:1, 80:1, 100:1.

2.2 宮頸上皮內(nèi)癌變宮頸脫落細(xì)胞SELEX篩選

2.2.1 篩選條件

篩選過程中，一方面加入BSA以封閉非特異性結(jié)合位點，去除非特異性結(jié)合從而提高篩選效率；另一方面，剛開始進(jìn)行篩選時，如果ssDNA文庫加入量過少會導(dǎo)致篩選失敗，因此要以較多量的ssDNA和細(xì)胞進(jìn)行前幾輪篩選，隨著篩選的進(jìn)行要不斷增加篩選壓力 (表 2)，使特異性的ssDNA能競爭結(jié)合在細(xì)胞膜表面的特異性物質(zhì)上而特異性較弱的ssDNA被淘汰。

2.2.2 次級文庫鑒定

每輪篩選獲得的次級文庫經(jīng)不對稱PCR擴(kuò)增ssDNA，產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定 (圖2)，可見90 nt目的片段ssDNA，滿足篩選要求，可作為下輪篩選的文庫。

2.2.3 結(jié)合率測定

在12輪篩選過程中，次級文庫與陽性細(xì)胞的結(jié)合率從17%增加至75%；與陰性細(xì)胞的結(jié)合率從83%減少至19% (圖3)。隨著篩選的進(jìn)行，在第9輪后結(jié)合率基本穩(wěn)定達(dá)到平臺期，說明特異性高的適配子得到富集，即篩選結(jié)束。

2.2.4 核酸適配子庫克隆測序及一結(jié)構(gòu)同源性分析

隨機(jī)挑選40個克隆子進(jìn)行測序，結(jié)果發(fā)現(xiàn)大量重序列及2個錯誤序列，最終確定適配子庫共有9條適配子序列 (表3)。DNAMAN 7.0軟件進(jìn)行一級結(jié)構(gòu)同源性分析表明 (圖 4) 所有序列無共同的保守序列，但CIN-Ap2、CIN-Ap3、CIN-Ap4和CIN-Ap9含有保守序列GGGAT，剩下的適配子無同源性，且無共有保守序列。

2.3 高特異性適配子確立

2.3.1 適配子特異性及親和力分析

9條適配子 (除CIN-Ap1) 與陽性細(xì)胞和陰性細(xì)胞結(jié)合力均具有極顯著性差異 (P<0.01)，其中適配子CIN-Ap3、CIN-Ap4、CIN-Ap5、CIN-Ap6的特異性較高。擬合各適配子與陽性細(xì)胞的結(jié)合曲線，計算得到平衡解離常數(shù)Kd值。根據(jù)解離常數(shù)Kd值越小，親和力越大，確定CIN-Ap4、CIN-Ap5具有較高的親和力 (圖 5)。綜合上述結(jié)果，最終確立 CIN-Ap4作為子宮頸癌前病變宮頸脫落細(xì)胞高特異性適配子。

表2 適配子各輪篩選條件Table 2 Screening conditions of aptamer

2.3.2 適配子CIN-Ap4細(xì)胞免疫熒光

采用細(xì)胞免疫熒光法進(jìn)一步驗證適配子CIN-Ap4與陽性細(xì)胞和陰性細(xì)胞結(jié)合力 (圖6)，陽性細(xì)胞組熒光強(qiáng)度遠(yuǎn)高于陰性細(xì)胞組，說明所確立的適配子CIN-Ap4確實能夠與子宮頸癌前病變宮頸脫落細(xì)胞高特異性結(jié)合，可作為子宮頸癌前病變診斷標(biāo)志物，為宮頸癌前病變宮頸分子診斷提供理論基礎(chǔ)和新思路。

圖2 1–12輪篩選獲得的ssDNA次級文庫產(chǎn)物電泳圖Fig. 2 2% agarose gel electrophoresis of ssDNA secondary library. M: marker; 1–12: ssDNA secondary library for each round.

圖3 1–12輪ssDNA次級文庫與宮頸脫落細(xì)胞熒光結(jié)合率Fig. 3 The combination rate of ssDNA secondary library and cervical exfoliation cells for 12 rounds.

表3 適配子序列Table 3 Sequences of aptamers

圖4 適配子同源性比對結(jié)果Fig. 4 Homology comparison.

圖5 適配子特異性及親和力分析結(jié)果Fig. 5 Specificity and affinity analysis of aptamers. (A) Specific analysis. (B) Affinity analysis.

圖6 適配子CIN-Ap4細(xì)胞免疫熒光結(jié)果Fig. 6 Cell immunofluorescence of CIN-Ap4.

3 討論

對稱PCR和不對稱PCR是實驗過程的關(guān)鍵，對 PCR反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化，尤其對不對稱 PCR條件進(jìn)行優(yōu)化，是獲得特異性和親和力均較強(qiáng)的ssDNA適配子的核心。適配子的篩選過程就是不斷重復(fù)PCR的過程，所以PCR是篩選適配子的關(guān)鍵。優(yōu)化PCR條件可以降低非特異性擴(kuò)增，得到高特異性、高純度的PCR產(chǎn)物，為今后篩選目標(biāo)物的適配子奠定一定的基礎(chǔ)。但值得一提的是，我們發(fā)現(xiàn)在開始的幾輪篩選過程中，對稱PCR及不對稱PCR均能獲得較高特異的目的產(chǎn)物。但在后面的幾輪篩選過程中，即使在優(yōu)化的條件下，PCR非特異性產(chǎn)物增多。分析原因可能是篩選之初模板純度高，所以PCR產(chǎn)物特異性高，但經(jīng)過多輪篩選后模板純度降低，故PCR產(chǎn)物特異性降低，尤其是不對稱PCR要經(jīng)過35個如此多的循環(huán)，非特異性產(chǎn)物會更多[25-26]，因此在篩選過程中可采用多次膠回收的方法以提高每一輪ssDNA純度。

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