黃莉敏，張大準(zhǔn)，王艷，張巧，梁偉，張永頂，熊祖應(yīng)

1 北京大學(xué)深圳醫(yī)院 腎內(nèi)科，廣東 深圳 518035

2 深圳市伯勞特生物制品有限公司，廣東 深圳 518054

膜性腎病 (Membranous nephropathy，MN)是一個病理學(xué)概念，根據(jù)病因可分為原發(fā)性膜性腎病 (Primary membranous nephropathy，pMN) 和繼發(fā)于全身其他病因的繼發(fā)性膜性腎病 (Secondary membranous nephropathy，sMN)。兩者臨床表現(xiàn)相似，僅從臨床表現(xiàn)不能進(jìn)行鑒別，但兩者治療方案差異巨大，如何鑒別pMN和sMN一直困擾著國內(nèi)外腎臟病專家[1-2]。2009年，Beck等[3]在pMN患者血清中檢測出抗 M型磷脂酶 A2受體(Phospholipase A2 receptor，PLA2R)抗體，抗體陽性率可達(dá)約70%；而健康人、sMN病人及其他腎病患者血清抗體均陰性，提示抗PLA2R抗體可能是pMN特異性標(biāo)志物。而國內(nèi)外相關(guān)研究也相繼證實(shí)抗PLA2R抗體在膜性腎病中的作用[4]。

目前市場上僅有歐蒙公司能生產(chǎn)該 ELISA試劑盒，本研究通過自主研發(fā)，自制了 PLA2R抗體定量檢測 ELISA試劑盒，并對試劑盒性能進(jìn)行了評價。

1 材料與方法

1.1 研究對象

1.1.1 pMN組

北京大學(xué)深圳醫(yī)院腎內(nèi)科2010年5月至2016年2月住院患者，經(jīng)腎穿刺活檢病理組織檢查，通過光鏡、免疫熒光、電鏡確診為 MN；并通過臨床資料，結(jié)合實(shí)驗(yàn)室檢查，排除腫瘤、藥物、感染及其他自身免疫病等引起的繼發(fā)性膜性腎病。于腎穿刺當(dāng)日清晨留取患者血清標(biāo)本，符合標(biāo)準(zhǔn)的276例pMN患者入組。

1.1.2 非pMN組

隨機(jī)選取同期診斷為其他腎臟病及健康體檢者，共122例入組。包括繼發(fā)性膜性腎病 (sMN)12例，腎功能不全9例，糖尿病患者8例，系統(tǒng)性紅斑狼瘡6例，健康體檢者87名 (年齡在20–70歲之間)。

1.2 方法

1.2.1 樣本收集

所有入組患者于清晨空腹?fàn)顟B(tài)下采集靜脈血，于3 000 r/min、4 ℃離心10 min。分離血清，并分裝于–80 ℃冰箱待用。

1.2.2 抗原及校準(zhǔn)品制備

抗原為HEK293細(xì)胞表達(dá)的重組PLA2R全長蛋白 (由美國 SHENZHEN BLOT BIOTECHWISCONSIN，LLC公司提供，HEK293細(xì)胞表達(dá))。校準(zhǔn)品通過德國歐蒙公司 (E150522BD) 檢測膜性腎病患者血清，選取抗體滴度大于1 500 RU/mL的陽性血清，將陽性血清混合后以陰性血清進(jìn)行不同比例稀釋作候選校準(zhǔn)品原料血清，再通過注冊試劑盒重復(fù)檢測候選校準(zhǔn)品血清3次，選擇與注冊試劑盒校準(zhǔn)品OD值無差異 (P>0.05) 的校準(zhǔn)品候選血清。入選校準(zhǔn)品血清以校準(zhǔn)品稀釋液稀釋 101倍即得自制試劑盒校準(zhǔn)品 (市售試劑盒校準(zhǔn)品滴度2、20、100、500、1 500 RU/mL)。

1.2.3 自制ELISA試劑盒

用0.05 mol/L CB緩沖液稀釋重組PLA2R抗原至1 μg/mL，加入酶標(biāo)板，每孔100 μL，于4 ℃包被過夜。TBS緩沖液洗滌3次，每次5 min。每孔加入1%的 BSA，150 μL/孔，室溫 (18–26 ℃) 封閉30 min。將酶標(biāo)板拍干，置于室溫 (18–26 ℃)、濕度<15%條件下干燥2–4 h，封裝并保存于4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 自制ELISA試劑盒檢測血清抗體滴度

待檢樣本用 Tris+1% BSA稀釋液按 1∶101稀釋 (Sigma公司)，取包被好的酶標(biāo)板條，室溫平衡之后，加入稀釋好的樣本和校準(zhǔn)品以及對照品，每孔100 μL，室溫溫育30 min；然后洗滌3次(TECAN洗板機(jī))，加入1∶6 000稀釋好的HRP標(biāo)記兔抗人IgG (Sigma公司)，每孔100 μL，室溫溫育30 min；洗滌3次，加入底物TMB，每孔100 μL，室溫避光反應(yīng)30 min；加入0.5 mol/L的H2SO4，每孔100 μL終止反應(yīng)。用酶標(biāo)儀(TECAN NanoQuant) 測定450 nm和620–650 nm任一波長處的吸光度值，以450 nm波長處的吸光度值減去620–650 nm 波長處的吸光度值記為各孔的OD值。然后以校準(zhǔn)品的濃度值 2、20、100、500、1 500 RU/mL作為x軸，各校準(zhǔn)品對應(yīng)的OD值作y軸，進(jìn)行曲線回歸擬合，根據(jù)擬合的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算出各待測樣本的濃度。

1.2.5 注冊試劑盒測血清抗體滴度

該檢測試劑盒購自德國歐蒙公司(E150522BD)，實(shí)驗(yàn)操作按試劑盒內(nèi)說明書進(jìn)行。并根據(jù)說明書將血清抗體滴度<14 RU/mL記為陰性，將抗體滴度>20 RU/mL記為陽性。若抗體滴度介于 14–20 RU/mL則為疑似陽性，疑似陽性患者選取同期血清進(jìn)行多次檢測，>20 RU/mL記為陽性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析均用SPSS 19.0，以α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)，P<0.05說明差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.3.1 準(zhǔn)確度

用試劑盒內(nèi)陽性對照直接進(jìn)行檢測，重復(fù)測量 3次后，其平均值記作，根據(jù)公式：測量偏差=(–理論值)/理論值×100%，結(jié)果相對偏差在±15%區(qū)間內(nèi)。

1.3.2 檢測限

用樣本稀釋液作為樣本進(jìn)行檢測，重復(fù)測定20次，得出20次測量結(jié)果的吸光度值 (A值)，計(jì)算其平均值 () 和標(biāo)準(zhǔn)差 (s)，得出+2s所對應(yīng)A值，根據(jù)試劑盒所用校準(zhǔn)品校準(zhǔn)曲線方程，將+2s所對應(yīng)A值代入上述方程中，求出對應(yīng)濃度值，即為檢測限，其結(jié)果不高于2 RU/mL。其中自制試劑盒記為A1，市售試劑盒記為A2。

1.3.3 測量系統(tǒng)線性范圍

將接近線性范圍上限的校準(zhǔn)品用樣本稀釋液倍比稀釋為5種濃度，其中低值樣本需接近線性范圍下限。按試劑盒說明書進(jìn)行操作，將每一濃度樣本重復(fù)檢測2次，計(jì)算其濃度平均值，將結(jié)果平均值和稀釋比例用最小二乘法進(jìn)行直線擬合，并計(jì)算線性相關(guān)系數(shù)R2，結(jié)果線性范圍2–500 RU/mL，線性相關(guān)系數(shù)R2值不低于0.99。

1.3.4 重復(fù)性

用2個濃度水平樣本各重復(fù)檢測10次，計(jì)算10次測量濃度結(jié)果平均值和標(biāo)準(zhǔn)差s，根據(jù)如下公式 (1) 得出變異系數(shù) CV，結(jié)果變異系數(shù)(CV) 不高于 15%。其中自制試劑盒記為 CV1，市售試劑盒記為CV2。

式中，CV：變異系數(shù)；s：10次測量結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)差；：10次測量結(jié)果平均值。

1.3.5 批間差

用3個批號試劑盒分別檢測同一份樣本，各重復(fù)10次，計(jì)算30次測量濃度值平均值和標(biāo)準(zhǔn)差s，根據(jù)公式 (2) 得出變異系數(shù)CV，結(jié)果變異系數(shù) (CV) 不高于15%。其中自制試劑盒記為CV1，市售試劑盒記為CV2。

1.3.6 穩(wěn)定性檢測

朋友是個電影迷，卻從來只喜歡看外國電影。每周六晚，中央臺的“佳片有約”，他雷打不動地看了很多年。為此，他還培養(yǎng)出了女兒，從小一直跟他看電影，也成了一個電影迷。然而，這一兩年，他不看了，明明知道有好電影，明明自己也有閑時間，卻無論如何也提不起興趣。有時候，勉勉強(qiáng)強(qiáng)看半截，就呼呼地睡著了。過后，又捶胸頓足，直呼自己“老了，老了”。

試劑盒在37 ℃恒溫箱放置6 d后，2–8 ℃貯存365 d后，取試劑盒檢測準(zhǔn)確度、檢測限、線性范圍、重復(fù)性，應(yīng)符合以上1.3.1–1.3.5要求。

2 結(jié)果

2.1 自制試劑盒性能評價結(jié)果

自制試劑盒測量偏差如表 1所示，市售試劑盒測量偏差如表2所示，測量偏差均在±15%區(qū)間內(nèi)。兩組測量偏差比較，P>0.05，不認(rèn)為兩組試劑盒的測量偏差存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

檢測限評估結(jié)果見表 3及表 4，試劑盒檢測限均不高于2 RU/mL。

自制試劑盒與市售試劑盒線性范圍2–500 RU/mL，線性相關(guān)系數(shù)R2值均不低于0.99，如圖1所示。

對兩種試劑盒進(jìn)行重復(fù)性檢測，自制試劑盒在100 RU/mL時的批內(nèi)變異系數(shù)為CV1a=5.98%，在500 RU/mL時的批內(nèi)變異系數(shù)為CV1b=4.27%。市售試劑盒在 100 RU/mL時的批內(nèi)變異系數(shù)為CV2a=3.85%，在500 RU/mL時的批內(nèi)變異系數(shù)為CV2b=1.31%。

表1 三個不同批次自制試劑盒準(zhǔn)確度檢驗(yàn)Table 1 A test about accuracy of 3 different batches homemade kits

表2 三個不同批次市售試劑盒準(zhǔn)確度檢驗(yàn)Table 2 A test about accuracy of 3 different batches commercial kits

表3 三個不同批次自制試劑盒檢測限檢驗(yàn)Table 3 A test about detectability of 3 different batches homemade kits

表4 三個不同批次市售試劑盒檢測限檢驗(yàn)Table 4 A test about detectability of 3 different batches commercial kits

圖1 試劑盒線性評估Fig. 1 Liner assessment for ELISA kit. The figture of “LOT:150727, LOT:150803, LOT:150914” represent liner assessment for homomade ELISA kits, while the “E160821AD, E161010BH, E160204AH” are liner assessment for commercial ELISA kits.

檢測自制試劑盒批間差，得出變異系數(shù)CV1=7.95%，市售試劑盒批間差CV2=4.39%。兩種試劑盒3個批間差均在15%以內(nèi)。

試劑盒分別在37 ℃恒溫箱放置6 d后，4 ℃貯存365 d后，取試劑盒檢測準(zhǔn)確度、檢測限、線性范圍、重復(fù)性。結(jié)果見表5，試劑盒在37 ℃恒溫箱放置6 d，2–8 ℃放置365 d后，試劑盒檢測準(zhǔn)確度、檢測限、線性范圍、重復(fù)性均符合要求。

2.2 與國外同類試劑盒對比

用EUROIMMUN Anti-PLA2R ELISA試劑盒和自制試劑盒同時測定 276份 pMN患者血清和122份非pMN組血清，檢測結(jié)果如表6所示。歐蒙試劑盒檢測pMN患者血清敏感度為51.81%，特性度為 100%；自制試劑盒檢測敏感度為50.36%，特異度為 100%。自制試劑盒與市售商品化試劑盒比較，陽性符合率 97.2%，陰性符合率為100%，總體符合率有98.9%，兩種試劑盒的差異不顯著 (P=0.583，P>0.05）。

2.3 血清抗PLA2R抗體陽性組與陰性組基本資料與實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)比較

2010–2016年在我科住院并行腎穿刺活檢病理和臨床診斷，共納入符合標(biāo)準(zhǔn)的pMN患者276例，以自制試劑盒測量抗體滴度，其中抗PLA2R抗體陽性患者139例，陰性患者137例，pMN患者血清抗 PLA2R抗體陽性率為 50.36%。通過統(tǒng)計(jì)學(xué)分析發(fā)現(xiàn)陰性組與陽性組患者血清肌酐無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但陽性組患者年齡、尿蛋白定量高于陰性組患者，陽性組患者血白蛋白低于陰性組(P<0.05)(表7)。進(jìn)一步分析抗PLA2R抗體滴度分別與尿蛋白、血白蛋白的相關(guān)性，通過線性回歸，得到如圖2A、2B所示散點(diǎn)圖，發(fā)現(xiàn)抗PLA2R抗體滴度與尿蛋白呈正相關(guān)，與血白蛋白呈負(fù)相關(guān)。

3 討論

有效鑒別pMN與sMN對于疾病治療具有重要指導(dǎo)意義[5-6]。臨床上，當(dāng)病理診斷是MN時，如果能排除各種繼發(fā)性病因，則可作出 pMN診斷。導(dǎo)致MN的繼發(fā)因素常常復(fù)雜多變，如某些腫瘤繼發(fā)MN，有時甚至在MN發(fā)生后數(shù)月至數(shù)年后才表現(xiàn)出來，這給臨床排除繼發(fā)病因帶來較多困難；再如膜性腎病合并乙型肝炎病毒感染與乙型肝炎病毒引起sMN鑒別，很難通過病理或其他實(shí)驗(yàn)室檢查得以鑒別[7-9]。鑒別pMN和sMN的特異性抗 PLA2R抗體的出現(xiàn)無疑為臨床醫(yī)生帶來新希望。研究發(fā)現(xiàn)，超過70% pMN患者血清PLA2R抗體陽性，而 sMN患者則該抗體很少陽性；且血清抗 PLA2R抗體滴度變化先于尿蛋白變化，與病情呈平行關(guān)系，可指導(dǎo)臨床調(diào)整治療方案[10-14]。

表5 自制試劑盒在不同溫度放置不同時間后的穩(wěn)定性評估Table 5 Homemade kits stability assessment

表6 自制試劑盒與注冊試劑盒檢測結(jié)果Table 6 Comparison of the homemade kit and commercial kit

本課題組研究發(fā)現(xiàn)在特發(fā)性膜性腎病患者中，血清抗體水平與蛋白尿水平呈正相關(guān)，與血清白蛋白水平呈負(fù)相關(guān)，血清抗PLA2R抗體的檢測有利于輔助病情的診斷與疾病嚴(yán)重情況的預(yù)測。本課題組自制 PLA2R抗體試劑盒可定量檢測患者血清抗PLA2R抗體，進(jìn)而鑒別pMN和sMN，該試劑盒具有準(zhǔn)確、快捷的特性，為確診pMN提供證據(jù)。同時可監(jiān)測病人血清PLA2R抗體滴度水平，評估患者病情活動性，從而調(diào)整治療方案。

表7 血清抗PLA2R抗體陽性組與陰性組基本資料Table 7 The baseline data of positive group and negative group

圖2 血清抗PLA2R抗體與24 h蛋白尿 (A) 和血清白蛋白 (B) 的關(guān)系Fig. 2 Relationship between serum anti-PLA2R antibody and 24 h proteinuria (A), serum albumin (B).

評估該試劑盒基本性能發(fā)現(xiàn)，自制試劑盒診斷檢測pMN敏感性50.36%，特異性100%，在4 ℃保存12個月，批間和批內(nèi)穩(wěn)定性良好，能夠滿足臨床需要。比較本試劑盒與目前市面上唯一注冊產(chǎn)品EUROIMMUN Anti-PLA2R ELISA試劑盒符合率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。但由于市售試劑盒購買受條件限制，未進(jìn)行兩個試劑盒的穩(wěn)定性比較，需進(jìn)一步完善。

由于抗PLA2R抗體IgG無國際約定參考測量程序和校準(zhǔn)品，因此我們用適當(dāng)校準(zhǔn)等級傳遞方案，將校準(zhǔn)品溯源至EUROIMMUN Medizinische Labordiagnostika AG的Anti-PLA2R ELISA(IgG)檢測方法。雖然檢測臨床樣本時有 4份血清樣本出現(xiàn)差異，但整體符合率高度一致，部分差異原因可能系兩種試劑盒所選抗原片段部分不同所致。

綜上所述，依據(jù)自制試劑盒檢測病人抗PLA2R抗體滴度水平，不僅可區(qū)別pMN和sMN，還可預(yù)測患者病變活動性，為提高pMN診斷準(zhǔn)確率，提高治愈率創(chuàng)造條件[15-16]。本試劑盒符合行業(yè)內(nèi)相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)，與注冊試劑盒比對結(jié)果高度一致，差異無顯著意義，能滿足臨床應(yīng)用需要。同時，自制試劑盒操作簡便、質(zhì)量穩(wěn)定，填補(bǔ)了國內(nèi)空白，為MN患者提供了一種有效、可靠的檢測方法。本研究也將進(jìn)行更大樣本量的驗(yàn)證，尋求第三方驗(yàn)證，以及臨床前瞻性研究，以進(jìn)一步完善自制試劑盒的性能。

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