副溶血弧菌菌株229基因組測(cè)序及其致病因子的注釋

林毅英，潘力，吳清平，王斌

（1.華南理工大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，廣東廣州 510006）（2.廣東省微生物研究所華南應(yīng)用微生物國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州 510070）

副溶血性弧菌（Vibrio Parahemolyticus），革蘭氏陰性菌，是人類(lèi)常見(jiàn)的食源性腸道條件致病菌，常見(jiàn)于冷凍海鮮類(lèi)食品高消耗的國(guó)家。副溶血弧菌通常存在于海洋水域，附著于魚(yú)、蝦、蟹及其他軟件動(dòng)物的體表生長(zhǎng)[1,2]，人類(lèi)被其感染后會(huì)導(dǎo)致急性腸胃炎[3～5]，有可能出現(xiàn)腹瀉、膿血和脫水等癥狀，甚至死亡。對(duì)于沿海地區(qū)經(jīng)常食用海鮮制品的人們來(lái)說(shuō)，副溶血弧菌導(dǎo)致的食物中毒比率非常高[6]，這類(lèi)疾病的高發(fā)國(guó)家和地區(qū)包括美國(guó)及許多亞洲國(guó)家（如日本、泰國(guó)、馬來(lái)西亞和中國(guó)等）[7,8]。副溶血弧菌在世界范圍內(nèi)的廣泛分布，使得研究其致病因子及致病機(jī)制變得非常重要，以便更好地預(yù)防和治療由其導(dǎo)致的食物中毒、腸胃炎等疾病，也對(duì)檢測(cè)食品中副溶血弧菌污染及食品保鮮具有重要的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

雖然已有研究對(duì)副溶血弧菌的致病因子進(jìn)行報(bào)道，例如 Makino等研究表明副溶血弧菌的致病因子包括溶血素、脲酶、Ⅲ型分泌因子 TTSS、Ⅵ型分泌因子T6SS等[3,9]，但是副溶血弧菌引起腸胃炎的具體致病機(jī)制仍然不清楚。而近年來(lái)，隨著抗生素濫用問(wèn)題的日益加重導(dǎo)致了多重耐藥菌株的出現(xiàn)[8]，這更加劇了副溶血弧菌引起腸胃炎等疾病的風(fēng)險(xiǎn)。因此持續(xù)監(jiān)控海鮮制品捕撈、運(yùn)輸及貨架期過(guò)程中的副溶血弧菌菌株污染情況，揭示新發(fā)現(xiàn)菌株的致病因子就顯得十分重要。副溶血弧菌基因組測(cè)序能夠獲得全基因組水平的基因注釋及功能分析數(shù)據(jù)，能為尋找其致病因子并分析其致病機(jī)制提供可靠的遺傳學(xué)支持?jǐn)?shù)據(jù)。

本研究所用的副溶血弧菌菌株 229，分離于冷凍海洋魚(yú)類(lèi)制品，其臨床感染表現(xiàn)為腹痛、嘔吐、腹瀉及水樣便等癥狀。本研究利用Illumina Hiseq 2000測(cè)序平臺(tái)，制備400 bp測(cè)序文庫(kù)，采用雙末端90 bp測(cè)序技術(shù)，對(duì)其基因組進(jìn)行測(cè)序。所得數(shù)據(jù)經(jīng)質(zhì)量過(guò)濾后，進(jìn)行基因組組裝、功能基因注釋及基因 WEGO功能聚類(lèi)分析，目的在于獲得與副溶血弧菌導(dǎo)致腸胃炎等疾病相關(guān)的致病因子，為研究副溶血弧菌致病性的遺傳學(xué)機(jī)制提供有價(jià)值的數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

副溶血弧菌菌株 229，用于基因組測(cè)序和功能基因注釋，保藏于廣東省微生物所菌株保藏中心，編號(hào)為GMIxtf-229。

1.1.2 培養(yǎng)基

高鹽LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨1%、酵母提取物0.5%、氯化鈉3%、pH 7.0。培養(yǎng)溫度37 ℃。

1.1.3 化學(xué)試劑

Tris-HCl、EDTA、SDS、巰基乙醇、RNaseA 等試劑購(gòu)自北京普博欣生物科技有限公司；瓊脂糖、核酸染料購(gòu)自TaKaRa公司；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒 DNAzol? Reagent，購(gòu)自 ThermoFisher Scientific公司；培養(yǎng)基及組分購(gòu)自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 文庫(kù)構(gòu)建及測(cè)序

副溶血弧菌菌株229在高鹽LB培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng) 12 h后，用細(xì)菌基因組 DNA提取試劑盒DNAzol? Reagent提取其基因組DNA，溶于100 μL去離子水，并加入 20 μg/mL RNaseA以去除殘留的RNA成分。利用Nano-drop分析儀檢測(cè)所得DNA樣品的濃度和質(zhì)量，達(dá)到 OD260/280=1.8～2.0的樣品，用于基因組測(cè)序文庫(kù)的構(gòu)建：首先采用超聲法 Covaris將大片段DNA隨機(jī)打斷，經(jīng)片段長(zhǎng)度選擇（400±25 bp）、平末端修復(fù)、末端加A、接頭連接等，獲得帶有測(cè)序接頭的DNA片段，利用測(cè)序接頭引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增富集DNA片段，電泳回收400±25 bp的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物片段。利用Illumina Hiseq 2000測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行cluster文庫(kù)制備，采用雙末端 90 bp測(cè)序策略，在Illumina Hiseq 2000測(cè)序平臺(tái)上進(jìn)行副溶血弧菌菌株229的基因組測(cè)序。

1.2.2 基因組組裝

原始的測(cè)序數(shù)據(jù)會(huì)存在一定量的低質(zhì)量數(shù)據(jù)，為了使得后續(xù)的分析結(jié)果更加準(zhǔn)確可靠，在進(jìn)行基因組組裝之前對(duì)原始的測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行數(shù)據(jù)過(guò)濾處理。依次采用下列步驟對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量控制：（1）去除帶有接頭污染的reads（默認(rèn)接頭adapter序列與read序列有15 bp的overlap，允許錯(cuò)配數(shù)為1）；（2）去除含N堿基數(shù)目總和達(dá)到一定比例的reads（默認(rèn)10%，設(shè)置為10 bp）；（3）去除質(zhì)量值連續(xù)≤4的堿基數(shù)達(dá)到一定程度的reads（默認(rèn)40%，設(shè)置為36個(gè)）。經(jīng)過(guò)濾后的reads數(shù)據(jù)，利用Velvet 1.2.10軟件進(jìn)行基因組從頭組裝，軟件所用參數(shù)采取默認(rèn)的參數(shù)，并根據(jù)測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行優(yōu)化組裝結(jié)果的優(yōu)化[10]。

1.2.3 基因注釋及功能聚類(lèi)分析

蛋白質(zhì)編碼基因（coding sequence，CDS），利用軟件Glimmer 3.02進(jìn)行預(yù)測(cè)分析[11]，并通過(guò)NCBI非冗余蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行驗(yàn)證。基因 GO功能注釋通過(guò)InterProScan軟件完成，GO功能聚類(lèi)分析通過(guò)WEGO在線程序（http://wego.genomics.org.cn/cgi-bin/wego/index.pl）完成[12]。tRNA 的預(yù)測(cè)由 tRNAscan-SE version 1.3.1軟件完成[13]。菌株229基因組與副溶血弧菌模式菌株10329基因組的同源比對(duì)分析由circos軟件完成。進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建，利用軟件MEGA6完成，采用Neighbor Joining方法建樹(shù)，bootstrap參數(shù)設(shè)置為1000（即構(gòu)建1000棵進(jìn)化樹(shù)，在此基礎(chǔ)上整合得到一個(gè)進(jìn)化樹(shù)）。

1.2.4 致病因子分析

根據(jù)目前文獻(xiàn)報(bào)道的副溶血弧菌的主要致病因子，對(duì)菌株229組裝的基因組及注釋的功能基因進(jìn)行比對(duì)分析，預(yù)測(cè)副溶血弧菌菌株229具有的致病因子，并分析這些致病因子的功能。

2 結(jié)果與討論

2.1 基因組組裝及統(tǒng)計(jì)分析

圖1 副溶血弧菌229基因組contig覆蓋度及蛋白編碼基因CDS長(zhǎng)度的統(tǒng)計(jì)分析Fig.1 The statistics analysis of contig coverage and gene length(the amount of amino acids) in the genome of V.parahaemolyticus strain 229

經(jīng)質(zhì)量控制去除低質(zhì)量及接頭污染的reads，基因組測(cè)序共獲得14,003,024個(gè)90 bp reads，用于基因組組裝的關(guān)鍵參數(shù)k-mer數(shù)值設(shè)置為71 bp。組裝所得基因組的序列文件提交至NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)，獲得序列號(hào)為MRBW00000000。原始測(cè)序raw read數(shù)據(jù)提交至NCBI SRA數(shù)據(jù)庫(kù)，獲得序列號(hào)為PRJNA356138。

基因組測(cè)序和組裝統(tǒng)計(jì)信息如表1，共獲得63個(gè)contigs（＞1000 bp，N50為45,033 bp），最大的contig長(zhǎng)度為716,466 bp，所得基因組長(zhǎng)度為4.97 Mb，GC含量為 43.90%，測(cè)序深度達(dá)到 254×，大多數(shù) contig的覆蓋度達(dá)到 30～60×（圖 1），所得測(cè)序數(shù)據(jù)能夠滿足基因組組裝、功能基因注釋和聚類(lèi)分析的數(shù)據(jù)量要求。利用Glimmer3.02軟件對(duì)組裝的基因組序列進(jìn)行功能基因注釋，共獲得4,940個(gè)功能基因，平均長(zhǎng)度達(dá)到933 bp，多數(shù)基因的氨基酸數(shù)目少于1000個(gè)（圖1），具有功能注釋的基因達(dá)到1270個(gè)，為分析該菌株導(dǎo)致腸胃炎等疾病的致病因子提供了可靠數(shù)據(jù)。根據(jù)功能基因的平均長(zhǎng)度以及預(yù)測(cè)的基因數(shù)目，可以計(jì)算得到副溶血弧菌菌株229的功能基因的序列總長(zhǎng)約為4.61 Mb，占其基因組序列總長(zhǎng)4.97 Mb的92.76%，說(shuō)明副溶血弧菌的基因密度很高，基因組上非編碼序列十分稀少，也說(shuō)明副溶血弧菌基因組具有高度的經(jīng)濟(jì)性，符合微生物生存及進(jìn)化的基本原則：減少基因組冗余序列，降低代謝能耗?；蚪M包含53個(gè)tRNA基因，這是副溶血弧菌蛋白質(zhì)基因表達(dá)的基礎(chǔ)。

表1 副溶血弧菌菌株229的測(cè)序信息Table 1 The sequencing information of V. parahaemolyticus strain 229

2.2 基因功能注釋

圖2 副溶血弧菌229注釋基因的GO功能分析Fig.2 GO functional analysis of annotated genes in the genome of V. parahaemolyticus strain 229

副溶血弧菌基因組中共有1,270個(gè)基因獲得GO功能注釋，利用WEGO軟件對(duì)具有GO注釋的基因進(jìn)行功能聚類(lèi)分析。結(jié)果顯示，以下GO類(lèi)群均富集了10%以上的功能基因：“binding”、“catalytic”、“biological regulation”、 “cellular process”、 “establishment of localization”、“metabolic process”、“pigmentation”等。尤其是以下兩個(gè)GO類(lèi)群富集了大量功能基因（圖2）：Biological process categories "metabolic process" (722 CDSs，55.4%) and "localization” (226 CDSs，17.3%)，這些基因可能有利于副溶血弧菌菌株對(duì)寄主的侵入及其隨后在宿主上的生長(zhǎng)、繁殖及代謝過(guò)程，這些數(shù)據(jù)為研究副溶血弧菌菌株的致病性的機(jī)制提供數(shù)據(jù)支持。

2.3 副溶血弧菌致病因子分析

根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，副溶血弧菌導(dǎo)致腸胃炎等疾病的致病因子包括溶血素（hemolysin）、Ⅲ型因子（Type Ⅲsecretion system，TTSS）和Ⅵ型因子（Type Ⅵ secretion system）。其中，熱穩(wěn)定的溶血素因子TDH、TRH是主要的致病因子，研究表明所有的臨床副溶血弧菌菌株至少含有TDH、TRH二者中的一種致病因子[14,15]。

基于基因的功能注釋結(jié)果，副溶血弧菌229基因組包括一個(gè)溶血素基因（NODE_11_orf00126）以及另外三個(gè)與溶血素相關(guān)的基因（NODE_24_orf00078、NODE_2_orf00564、NODE_20_orf00001，表 2），這是副溶血弧菌致病性的基礎(chǔ)因子。Ⅲ型因子是副溶血弧菌、志賀氏菌、沙門(mén)氏菌的重要致病因子之一，屬于Type Ⅲ secretion system（TTSS）系統(tǒng)。研究表明TTSS系統(tǒng)與副溶血弧菌侵入人類(lèi)腸道上皮細(xì)胞的過(guò)程密切相關(guān)。對(duì)于副溶血弧菌菌株 229，本研究的基因組注釋顯示其 TTSS系統(tǒng)包括四個(gè)功能基因(NODE_8_orf00014、NODE_32_orf00049、NODE_2_orf00456、NODE_2_orf00457，表 2)。從這些基因在基因組上的分布情況看，這些致病因子位于不同的染色體位點(diǎn)，因此能夠形成獨(dú)立的致病因子簇。副溶血弧菌菌株229的基因組組裝和注釋為研究副溶血弧菌致病性的遺傳學(xué)基礎(chǔ)提供了有價(jià)值的數(shù)據(jù)。

表2 副溶血弧菌229致病因子注釋及功能分析Table 2 Annotation and functional analysis of virulence factors in V. parahaemolyticus strain 229

2.4 副溶血弧菌菌株229基因組同源性分析

圖3 副溶血弧菌菌株229與10329的同源性比較分析Fig.3 The homologous comparative analysis of V.parahaemolyticus strain 229 and 10329

副溶血弧菌菌株229與模式菌株10329的同源性比較（圖 3）表明，二者之間存在大量的同源序列，說(shuō)明二者同源關(guān)系較近，這有助于利用模式菌株10329的基因組信息和基因功能注釋信息，分析副溶血弧菌菌株229的致病因子基因。同時(shí)，兩株菌的同源序列存在大量的交錯(cuò)（圖3），也就是大量的同源序列在基因組上的位置是不一致的，導(dǎo)致這種差別的原因是多樣的，其中之一是基因水平轉(zhuǎn)移機(jī)制，這需要深入的遺傳學(xué)分析加以確定。

圖4 基于溶血素基因（hemolysin）構(gòu)建副溶血弧菌菌株系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.4 Phylogenetic distance tree for V. parahaemolyticus strainsbased on the hemolysin gene

基于溶血素基因（NODE_11_orf00126）的系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果（圖4），表明副溶血弧菌菌株229與擁有O4:K8血清型的菌株BB22OP遺傳距離最近[16]。由于菌株BB22OP與臨床菌株RIMD2210633同源關(guān)系十分接近[3,16]，推測(cè)菌株 229有可能與菌株RIMD2210633一樣具有臨床的致病性。

3 結(jié)論

3.1 副溶血弧菌菌株229的基因組組裝及功能注釋

本研究完成了副溶血弧菌菌株 229的基因組測(cè)序、組裝和功能基因注釋。組裝所得基因組序列已提交至NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)，序列號(hào)為MRBW00000000?；蜃⑨尗@得4940個(gè)基因，其中1270個(gè)基因具有GO注釋。WEGO注釋顯示大量CDS對(duì)于副溶血弧菌入侵宿主及隨后的生長(zhǎng)、繁殖和代謝等過(guò)程發(fā)揮重要作用。

3.2 副溶血弧菌菌株229的致病因子分析

通過(guò)基因注釋，獲得了與副溶血弧菌致病性相關(guān)的致病毒性因子，包括溶血素hemolysin和Ⅲ型因子，這些因子位于不同的染色體位點(diǎn)，故而形成獨(dú)立的致病因子簇?；谌苎鼗颍∟ODE_11_orf00126）的系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果表明，副溶血弧菌菌株229與擁有O4:K8血清型的菌株BB22OP遺傳距離最近，推測(cè)菌株229可能具有臨床的致病性。

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