Ra1362調控環(huán)二鳥苷酸影響結核分枝桿菌H37Ra的生物膜發(fā)育和休眠

丁曉娟 劉毅 孫濤 周小丹 李傳友 方海紅

結核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis，MTB)是引起結核病的病原菌。MTB可在宿主體內長期潛伏，甚至終生不發(fā)病，這種潛伏即休眠能力使得MTB能夠成功逃避宿主的免疫清除和抵御短期的藥物治療。MTB的生物膜形成是其耐藥性增強的原因之一。因此，揭示MTB的生物膜發(fā)育和休眠潛伏機制對縮短結核病療程和防控結核病具有重要意義。

環(huán)二鳥苷酸(c-di-GMP)是一種細菌胞內的二級信使，通過調節(jié)胞內多種重要代謝途徑，在細菌不同生長階段發(fā)揮作用[1-2]。c-di-GMP具有多種功能，如生物膜的形成[3]和免疫調節(jié)[4]等。c-di-GMP與TetR家族蛋白EthR(Rv3855基因編碼)結合可調控MTB對乙硫異煙胺的抗性[5]；同時，在慢生長MTB中c-di-GMP也發(fā)揮著調控休眠和毒力的作用。筆者前期研究也發(fā)現，c-di-GMP合成酶基因的敲除增加了菌株在低氧條件下的休眠能力，進一步推理分析對DosR調控通路相關基因并無明顯影響，但對其詳細調控機制及對細胞的潛伏感染能力的影響未進行深入探討[6]。筆者通過基因序列比對在MTB減毒菌株H37Ra的基因組序列中檢索到一個含編碼GAF-GGEDF-EAL的基因，基因編號是MRA_1362(簡寫為Ra1362)。該基因編碼c-di-GMP的二鳥苷環(huán)化酶(DGC)負責合成c-di-GMP[7]。筆者擬進一步對Ra1362基因無痕敲除，觀察Ra1362基因在體外對H37Ra生物膜發(fā)育及細菌休眠的影響，從而為MTB的休眠或潛伏感染研究提供新的思路。

材料和方法

一、材料

1.菌株和質粒：MTB菌株H37Ra購自中國食品藥品檢定研究院；大腸埃希菌DH5α和pET28a(+)為本實驗室保存；大腸埃希菌BL21(DE3)和pEasy-Blunt simple購自北京全式金有限公司；p1NIL、pGOAL19和pUC19-Gm-INT載體由英國皇家醫(yī)學院Tanya Parish實驗室Tanya Parish教授饋贈。

2.主要試劑和培養(yǎng)基：PrimeSTAR DNA polymerase(日本TaKaRa公司)；DNA純化試劑盒和質粒抽提試劑盒(美國Promega公司)；RNA抽提試劑RNAiso plus (TRIzol)(日本TaKaRa公司)；反轉錄及熒光定量PCR試劑：PrimeScript 1st Strand cDNA synthesis kit(日本TaKaRa公司)；SYBR Premix Ex TaqTM(日本TaKaRa公司)；Tween-80、甘氨酸、CaCl2等化學試劑購自國藥集團化學試劑公司；LB培養(yǎng)基(美國Oxiod公司)；Middlebrook 7H9液體培養(yǎng)基或7H10固體培養(yǎng)基，厭氧生長用葡萄糖胰蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基(DTA培養(yǎng)液；美國BD公司)；牛血清白蛋白和油酸購自生工生物工程(上海)股份有限公司。

3.引物設計：(1)構建敲除質粒用引物：Ra1362-UPL：ACATCTCGGATGCTATCTGTG；Ra1362-UPR：CACAGATAGCATCCGAGATGTCGGTC-AGCGGCGAAC；Ra1362-DNL：CCCAAGCTTCG-TTGAGCAGATCGTCCTTC；Ra1362-DNR：GG-ATCCCATCAAGATAACGCCGGGTCA；(2)敲除株驗證用引物：Mut-ck-L：TGAAGCGGTACGCAGAATC；Mut-ck-R：CAGCCTTCCAGACGCATAACT；(3)定量RT-PCR用引物：1362S2：TCTCCAATGAGTGCCGATGCC；1362A2：GAT-ACTGACGGTGCGGGTGAGC。

二、方法

1.H37Ra感受態(tài)制備和電轉化：參考文獻[8]，挑取單菌落，將MTB在7H9完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)至吸光度值(A600值)≈0.6，加入終濃度為0.2 mol/L的甘氨酸，繼續(xù)培養(yǎng)1～3 d后分別以等體積、1/2體積、1/4體積的37 ℃預溫的10%甘油充分重懸洗滌細胞3次。最后用適量10%甘油重懸，調整A600值至5.5～8.0。將0.5～1.0 μg質粒加入上述200 μl新鮮制備的MTB感受態(tài)細胞中，輕彈混勻，電擊轉化(參數1000 Ω，25 μF)，37 ℃振蕩培養(yǎng)(搖床轉速200～220 r/min)， 復蘇2～3 d后，涂于含有相應抗性的7H10平板上。37 ℃培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)20～30 d。

2.基因敲除株的構建：提取MTB的基因組DNA，PCR擴增各基因上游和下游片段，再通過PCR將兩片段拼接起來，然后連接到pEASY Blunt simple載體上，篩選測序驗證陽性克隆并凍存?zhèn)溆谩Ｌ崛≠|粒，酶切后與p1NIL和pGOAL19載體連接[9]，轉化大腸埃希菌DH5α，在含卡那霉素和潮霉素及X-gal的平板培養(yǎng)，挑藍色菌落，酶切篩選陽性克隆，獲得的敲除用自殺質粒電轉化入MTB中。無抗培養(yǎng)液復蘇24 h后涂布在含卡那霉素和潮霉素以及X-gal的固體平板上。1個月左右挑取藍色克隆在雙抗的液體培養(yǎng)基中傳代、保菌。按照1∶100體積百分比接種于無抗培養(yǎng)液中，15～18 d后，將菌液涂在含2%蔗糖和X-gal的平板上培養(yǎng)，挑取白色克隆PCR篩選測序驗證基因敲除株，命名為△Ra1362。

3.轉錄譜基因芯片和實時熒光定量PCR：挑取3個菌株的單克隆，包括H37Ra野生型菌株、△Ra1362突變株，基因回補菌株ComRa1362。在蘇通培養(yǎng)基(SM培養(yǎng)基)中傳代1次后，分別接種于新鮮的50 ml SM培養(yǎng)基(500 ml三角瓶)，接種后初始A600值≈0.02，37 ℃，搖床200 r/min繼續(xù)培養(yǎng)13 d，其中11 d 時將其中一瓶△Ra1362培養(yǎng)物外源添加人工合成的終濃度為100 μmol/L的c-di-GMP。用含1 mm 玻璃珠的離心管收集約15 mlA600值≈1.0的細菌，加上4 ml體積比為3∶1的氯仿:甲醇充分渦旋1 min后，加20 ml RNAiso plus(TRIzol)充分混勻后置于干冰送至上海伯豪生物技術有限公司，進行RNA抽提和生物芯片分析。采用熱酚法提取總RNA，QIAGEN RNeasy Mini Kit純化RNA，利用Agilent單通道表達譜芯片雜交，測試幾株細菌的基因表達情況。

收集菌體，抽提RNA后反轉錄為cDNA，取1 μl 作為模板，加入10 μl 2×SybrGreen Premix Ex Taq，PCR上下游引物(10 μmol/L)各0.4 μl，ROX Reference Dye 0.4 μl，用水補至總體積為20 μl。以MTB 16S rDNA序列作為內參，標準化其他基因的表達量。PCR反應條件：95 ℃預變性3 min；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40個循環(huán)。

4.MTB的生物膜形成實驗：參照文獻[9]并進行了改動，將對數期生長的細菌充分分散，稀釋至A600值≈0.02或者2%的比例接種在液體培養(yǎng)基上。分裝在25 ml塑料痰培養(yǎng)管中，每管4 ml，直立靜置培養(yǎng)。15 d后開始觀察、攝影、記錄。當細菌貼壁形成生物膜時，將成熟的生物膜培養(yǎng)物中上清液小心吸棄，加入0.5%的結晶紫染液(含10%甲醛用以固定生物膜)，室溫染色5 min，棄染色液，用蒸餾水反復輕輕沖洗至沒有紫色出現為止。干燥后進行攝影記錄。

5.MTB的體外快速厭氧休眠模型(rapid anaerobic dormancy model，RADM)：將對數期生長的細菌充分分散，以終濃度為A600值≈0.02接種在厭氧用DTA液體培養(yǎng)基中，按照文獻[10]操作并略微改進。以頂空體積比1∶1.5的比例分裝到青霉素瓶中，蓋上膠塞壓緊鋁蓋。每瓶裝4 ml培養(yǎng)液，37 ℃ 振蕩培養(yǎng)(搖床轉速230 r/min)。不同時間點測A600值并記錄；稀釋涂布7H10固體平板測定菌落形成單位(CFU)。每組(野生株組和敲除株組)另加1組亞甲藍指示劑對照指示氧氣消耗情況，當氧氣完全耗盡時亞甲藍將褪色。

6.DNA染色和熒光素酶活體染色：取1 ml培養(yǎng)物，離心留細胞沉渣，用等體積含0.02% Tween-80的25 mmol/L 4-(2-羥乙基)-1-哌嗪乙磺酸(HEPES)(pH=7.7)進行重懸。再次離心去上清，沉渣用1/2體積的N-2-羥乙基哌嗪-N′-2-乙磺酸(HEPES)重懸，其中含有終濃度50 μg/ml二乙酰熒光素(FDA)或300 nmol/L二脒基苯基吲哚(DAPI)，在37 ℃溫育20 min。離心去上清，沉渣用HEPES洗滌1次，然后用1/10體積進行重懸以獲得適于顯微鏡觀察的高濃度細胞。取5 μl樣品滴于多聚L-賴氨酸包被的載玻片上，蓋上蓋玻片，用熒光顯微鏡進行觀察。

結 果

一、H37Ra中Ra1362基因的敲除

采用英國皇家醫(yī)學院Tanya Parish實驗室所構建的MTB無痕敲除系統(tǒng)[8]，對Ra1362 (1872 bp)進行無痕敲除，Ra1362篩選了三批(每批50～60個克隆)才獲得陽性敲除株。采用兩側翼外側的引物對，PCR擴增Ra1362敲除株，產物長度2.1 kb；野生株擴增產物長度4.0 kb，PCR產物直接送測序確認無突變后凍存?zhèn)溆??；蚯贸昝麨椤鱎a1362。

二、Ra1362調控部分DosR基因表達

轉錄譜差異分析顯示，與野生株相比，19個與MTB休眠相關的DosR調控子基因(共約50個)[11]在△Ra1362中下調表達(表1，第2列)，這些基因的表達缺陷能被Ra1362回補株(Com1362)補償，外源添加人工合成c-di-GMP組也具有同樣的效果，這說明確實是由于能合成c-di-GMP的Ra1362基因敲除所引起的(表1，第3和第4列)。另外，將野生株和△Ra1362株應用定量RT-PCR驗證了部分基因(13個)的表達情況(圖1)，與芯片結果一致。

三、Ra1362調控MTB生物膜發(fā)育

參照文獻[12]研究方法，觀察MTB生物膜形成情況，同時加入指示氧氣濃度的亞甲藍作為空白參照。結果表明，亞甲藍在第10天左右開始褪色，△Ra1362組略早于野生株組(WT組)；21 d時△Ra1362已經形成薄膜樣生物膜，且明顯鋪滿氣液完整界面，并有少許皺褶； 26 d時觀察顯示△Ra1362的氣液交界面上生物膜已形成較厚的皺褶，而野生株的生物膜剛鋪滿氣液界面，且只有少許皺褶；35 d后兩者的表面特性無明顯差異(圖2a)。另外，貼壁的生物膜表型也有一致的結果(圖2b)。

圖1 定量RT-PCR測定生長后期DosR相關基因的表達(與16S rDNA相比)

基因野生株Com1362△Ra1362+c-di-GMPMRA_26564.27.110.6MRA_26553.45.59.6MRA_31662.62.95.1MRA_26542.44.67.9MRA_20122.33.36.7MRA_31622.13.55.6MRA_31632.12.93.4MRA_31592.13.45.8MRA_26512.13.75.9MRA_20212.01.52.8MRA_05761.92.52.3MRA_26571.92.94.3MRA_2047 (acg)1.82.44.2MRA_3165 (dosR)1.83.65.0MRA_3164 (dosS)1.82.59.1MRA_31581.62.24.6MRA_2023 (fdxA)1.63.05.6MRA_1748 (narK2)1.62.34.5MRA_2046 (hspX)1.52.23.2

圖a示△Ra1362株和野生株分別在培養(yǎng)第21、26和35天時氣液界面的細菌生物膜的發(fā)育情況；圖b示△Ra1362株和野生株培養(yǎng)35 d后貼壁的生物膜表型發(fā)育情況(結晶紫染色)圖2 野生株和△Ra1362株在痰液管中培養(yǎng)時的生物膜發(fā)育情況

四、Ra1362調控MTB在厭氧條件下的生存能力

為了驗證△Ra1362對MTB在厭氧條件下生存情況的影響，在RADM中比較野生株和△Ra1362株生存能力的差異。氧氣消耗能力比較：利用亞甲藍作為氧氣消耗的指示劑，當氧氣完全耗盡時將褪色。結果顯示，△Ra1362組中亞甲藍褪色的時間為160 h，比野生株組要快12 h(圖3)，即△Ra1362株更快將頂空中的氧氣消耗到最低程度。

圖3 野生株和△Ra1362株厭氧培養(yǎng)160 h后顏色比較

定量RT-PCR檢測得出，厭氧正調控有關的MRA_3165(DosR)基因在△Ra1362中相對表達量為28.75，明顯高于野生株的表達水平(相對表達量為21.2)；與休眠負調控有關的MRA_1748相對表達量由野生株的1.01下降為△Ra1362的0.45，MRA_2022基因相對表達量由野生株的0.98下降為△Ra1362的0.3。MRA_1748和MRA_2022基因在△Ra1362中表達量下降明顯，這說明Ra1362和厭氧條件下的調控密切相關。

RADM的不同時間點取樣并稀釋涂布平板測定細菌菌落形成單位(CFU)，結果表明，5 d時，△Ra1362株與野生株組的CFU數量無明顯差異，8～10 d時，△Ra1362的CFU僅約為野生株的5%～10%(未做統(tǒng)計)；另一方面，自第5天起，△Ra1362在平板上形成肉眼可見的克隆CFU所需時間較野生株長5～7 d，這表明厭氧壓力后敲除株平板恢復生長的能力弱于野生株；厭氧培養(yǎng)40 d后，兩者在平板上均不能形成克??；但培養(yǎng)60 d后通過DNA染色和熒光素酶活體染色發(fā)現，這些細菌并沒有死亡(圖4)，這提示細菌可能處于不能恢復正常生長的休眠狀態(tài)。

圖中所有細胞均可被二脒基苯基吲哚(DAPI)染成藍色，活細胞可被二乙酸熒光素(FDA)染成綠色圖4 快速厭氧模型中厭氧培養(yǎng)60 d后細菌的細胞染色情況

討 論

MTB通過氣溶膠方式感染人體后，在長期進化過程，形成了一些適應吞噬體內低氧或厭氧條件下的生存策略。生物膜通常被認為是細菌在環(huán)境生存不利時形成的一種具有保護作用的多細胞結構，對外界不利環(huán)境的耐受性往往會增強[13-15]。c-di-GMP常作為生物膜轉錄后調控模式在不同細菌中被闡明[9, 16]。胞內c-di-GMP是否能感應外界環(huán)境的變化從而啟動MTB類似的休眠？為了回答這個問題，筆者在前期實驗證實MTB H37Ra株中Ra1362具有c-di-GMP合成和降解能力的基礎上[7]，將該合成酶基因敲除。敲除株在體外培養(yǎng)過程更快形成生物膜，以適應外界低氧環(huán)境，從而促進體外生物膜發(fā)育。筆者認為，Ra1362基因敲除后，胞內c-di-GMP濃度下降，隨著生長的進行，培養(yǎng)環(huán)境中的氧氣濃度下降，胞內感應外界低氧環(huán)境能力隨之下降，到生長對數期剛結束，被細菌誤認為不利環(huán)境因而很快形成生物膜，從而導致細菌成膜能力增強。

轉錄譜差異分析結果提示，胞內c-di-GMP信號轉導途徑可能參與了MTB的休眠調控作用，部分DosR休眠基因受c-di-GMP正調控，c-di-GMP調控休眠基因上調表達，從而提高MTB的休眠能力，外源添加c-di-GMP能夠透過細胞膜進入胞內執(zhí)行相同的調控功能。同時，定量RT-PCR驗證部分基因的表達情況與芯片結果一致，說明c-di-GMP能通過一個網絡調控休眠基因的表達，或者說c-di-GMP通過某種信號感應調節(jié)Dos系統(tǒng)基因的表達，但不是調控Dos系統(tǒng)的唯一途徑，休眠的啟動并不完全依賴c-di-GMP。

鑒于轉錄譜芯片揭示Ra1362能調節(jié)Dos系統(tǒng)部分基因表達水平下降，為了模擬細菌的休眠狀態(tài)，筆者在體外建立了一個Dos系統(tǒng)應答缺氧環(huán)境，即快速厭氧休眠模型。在建模過程，筆者發(fā)現△Ra1362中煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(氧化態(tài))/煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(還原態(tài)) (NAD/NADH)比例與野生株相比有降低趨勢，但以A600值測定的生長曲線并沒有明顯的變化，這些結果跟文獻[17]中報道將DosR敲除株的反應類似。筆者用定量RT-PCR 的方法驗證了厭氧狀態(tài)和有氧狀態(tài)下與Dos系統(tǒng)相關基因的表達，顯示DosR基因只在厭氧時才有較高表達，與休眠負調節(jié)有關的MRA_1748和MRA_2022在△Ra1362株中表達量也明顯下降?；罴毎旧腕w外恢復生長培養(yǎng)結果也提示，細菌都處于活細胞狀態(tài)但是并不能恢復正常生長，跟野生株相比△Ra1362株這種不可恢復生長狀態(tài)相對更明顯。因此，有理由認為c-di-GMP與DosR在低氧下調節(jié)胞內代謝內穩(wěn)態(tài)的模式相似，即通過胞內氧化還原穩(wěn)態(tài)調節(jié)應答低氧壓力，從而下調Dos系統(tǒng)部分抑制基因的表達。前期研究發(fā)現，c-di-GMP合成酶基因的敲除對DosR調控通路相關基因并無影響[6]，筆者通過體外培養(yǎng)的特點進行推理分析，并沒有用RT-PCR或者轉錄譜芯片進行篩選。本次研究通過RT-PCR及轉錄譜芯片發(fā)現該通路中較多的基因受到了Ra1362正調控與前期研究不同，可能還與兩種菌株使用的培養(yǎng)條件不同有關[18]，H37Ra的厭氧模型使用的DTA培養(yǎng)基，而H37Rv使用的是7H9培養(yǎng)基。

綜上，筆者認為，一方面MTB H37Ra在生長早期MTB依賴c-di-GMP感應缺氧或者氧化還原壓力，負調控生物膜的發(fā)育；另一方面，合成c-di-GMP缺失后，感應外界環(huán)境變化能力也變弱，從而抑制負調控休眠基因的表達以維持體內氧化還原內穩(wěn)態(tài)。這表明c-di-GMP合成酶基因Ra1362在MTB H37Ra生長過程抑制生物膜發(fā)育及細菌休眠。

[1] R?mling U,Galperin MY,Gomelsky M. Cyclic di-GMP: the first 25 years of a universal bacterial second messenger. Microbiol Mol Biol Rev, 2013, 77(1): 1-52.

[2] Pesavento C, Hengge R. Bacterial nucleotide-based second messengers. Curr Opin Microbiol, 2009, 12(2):170-176.

[3] Bobrov AG, Kirillina O, Ryjenkov DA, et al. Systematic analy-sis of cyclic di-GMP signalling enzymes and their role in biofilm formation and virulence inYersiniapestis. Mol Microbiol, 2011, 79(2): 533-551.

[4] Hu DL, Narita K, Hyodo M, et al. c-di-GMP as a vaccine adjuvant enhances protection against systemic methicillin-resis-tantStaphylococcusaureus(MRSA) infection. Vaccine, 2009, 27(35): 4867-4873.

[5] Zhang HN, Xu ZW, Jiang HW, et al. Cyclic di-GMP regulatesMycobacteriumtuberculosisresistance to ethionamide. Sci Rep, 2017, 7(1): 5860.

[6] Hong Y, Zhou X, Fang H, et al. Cyclic di-GMP mediatesMycobacteriumtuberculosisdormancy and pathogenecity. Tuberculosis (Edinb), 2013, 93(6): 625-634.

[7] 王琳. 結核分枝桿菌c-di-GMP代謝相關蛋白的生物化學研究. 安徽: 中國科學技術大學, 2010.

[8] Parish T, Stoker NG.Mycobacteriumtuberculosisprotocols. Clifton: Humana Press,2001.

[9] Kulka K, Hatfull G, Ojha AK. Growth ofMycobacteriumtuberculosisbiofilms. J Vis Exp, 2012, (60).pii: 3820.

[10] Kumar A, Toledo JC, Patel RP, et al.MycobacteriumtuberculosisDosS is a redox sensor and DosT is a hypoxia sensor. Proc Natl Acad Sci U S A, 2007, 104(28): 11568-11573.

[11] Peddireddy V, Doddam SN, Ahmed N. Mycobacterial dormancy systems and host responses in tuberculosis. Front Immunol, 2017, 8: 84.

[12] Ojha AK, Baughn AD, Sambandan D, et al. Growth ofMycobacteriumtuberculosisbiofilms containing free mycolic acids and harbouring drug-tolerant bacteria. Mol Microbiol, 2008, 69(1): 164-174.

[13] Hall-Stoodley L, Costerton JW, Stoodley P. Bacterial biofilms: from the natural environment to infectious diseases. Nat Rev Microbiol, 2004, 2(2): 95-108.

[14] Donlan RM. Biofilms on central venous catheters: is eradication possible? Curr Top Microbiol Immunol, 2008, 322: 133-161.

[15] Hatt JK, Rather PN. Role of bacterial biofilms in urinary tract infections. Curr Top Microbiol Immunol, 2008, 322: 163-192.

[16] Martínez LC, Vadyvaloo V. Mechanisms of post-transcriptional gene regulation in bacterial biofilms. Front Cell Infect Microbiol, 2014, 4:38.

[17] Leistikow RL, Morton RA, Bartek IL, et al. TheMycobacteriumtuberculosisDosR regulon assists in metabolic homeostasis and enables rapid recovery from nonrespiring dormancy. J Bacteriol, 2010, 192(6): 1662-1670.

[18] Dokladda K, Billamas P, Palittapongarnpim P. Different behaviours of promoters inMycobacteriumtuberculosisH37Rv and H37Ra. World J Microbiol Biotechnol, 2015, 31(2): 407-413.