王俊娟，陸許可，郭麗雪，陰祖軍，王德龍，陳修貴，王帥，樊偉麗，陳超，葉武威

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所/棉花生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/農(nóng)業(yè)部棉花生物學(xué)與遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南安陽455000）

脫水素（DHNs）屬于 LEA 蛋白（Late embryogenesis abundant protein，胚胎發(fā)育晚期豐富蛋白）家族中的第二類[1]。脫水素基因受干旱、低溫、高鹽等逆境誘導(dǎo)，在植物響應(yīng)非生物脅迫和適應(yīng)性調(diào)控中起著重要作用[2]。

Gilmour等[3]克隆了擬南芥基因AtCOR47，屬于脫水素基因。Welin等[4]進(jìn)一步研究表明，At-COR47是1個低溫響應(yīng)基因，同時響應(yīng)脫落酸（Abscisic acid，ABA）和干旱脅迫。 前期研究中，我們克隆了陸地棉的脫水素基因GhDHN1[5]，試驗(yàn)結(jié)果顯示，GhDHN1響應(yīng)低溫脅迫，在細(xì)胞膜附近發(fā)揮作用，與擬南芥脫水素基因AtCOR47有相似的功能。比較基因組學(xué)在后基因組時代是1門重要的工具學(xué)科。通過不同物種間的基因組序列比較，可以在功能基因組學(xué)的研究中將發(fā)揮重要作用[6]。本研究將棉花脫水素基因與模式植物擬南芥的脫水素基因進(jìn)行比較，對他們的基因結(jié)構(gòu)、蛋白質(zhì)特性、蛋白質(zhì)基序以及基因功能等方面進(jìn)行系統(tǒng)分析，為研究GhDHN1基因的功能、物種的進(jìn)化關(guān)系奠定基礎(chǔ)，為進(jìn)一步研究棉花脫水素基因GhDHN1的應(yīng)用提供有用信息。

1 材料與方法

1.1 供試數(shù)據(jù)庫和基因

陸地棉基因組數(shù)據(jù)庫（http://cgp.genomics.org.cn/page/species/index.jsp）[7]和擬南芥數(shù)據(jù)庫（http://www.arabidopsis.org/）。供試基因：陸地棉脫水素基因GhDHN1[5]，在陸地棉數(shù)據(jù)庫中編號為CotAD_58358；擬南芥脫水素基因AtCOR47[3-4]，在擬南芥數(shù)據(jù)庫中編號為At1g20440。

1.2 方法

1.2.1脫水素基因GhDHN1和AtCOR47啟動子、DNA序列和CDS序列的獲得。在NCBI上下載最新的BLAST程序包，將BLAST本地化[8]，同時將GhDHN1和AtCOR47基因所需數(shù)據(jù)本地化。利用王俊娟等[5,9]報道的GhDHN1以及陸地棉數(shù)據(jù)庫中DNA序列位置，將GhDHN1基因的啟動子、DNA序列、CDS調(diào)取出來；依據(jù)擬南芥數(shù)據(jù)庫中脫水素基因（At1g20440）的信息將擬南芥脫水素基因At-COR47的啟動子、DNA序列、CDS調(diào)取出來。

1.2.2染色體定位。將GhDHN1、AtCOR47的DNA序列分別與陸地棉和擬南芥的基因組數(shù)據(jù)進(jìn)行比對，分別獲得GhDHN1、AtCOR47在染色體上的位置。

1.2.3脫水素GhDHN1、AtCOR47基因結(jié)構(gòu)分析。利用在線軟件 Gene Structure Display Server（GSDS2.0，http://gsds.cbi.pku.edu.cn/）[10]將GhDHN1 和AtCOR47的CDS與其對應(yīng)的DNA序列進(jìn)行比對，確定GhDHN1的外顯子/內(nèi)含子結(jié)構(gòu)，確定內(nèi)含子的位置。

1.2.4脫水素GhDHN1、AtCOR47所編碼蛋白的性質(zhì)分析。利用ProtParam在線程序（http://web.expasy.org/protparam/）對 GhDHN1、AtCOR47 蛋白質(zhì)性質(zhì)進(jìn)行分析。

1.2.5脫水素GhDHN1、AtCOR47同源性比較。利用在線分析工具EMBOSS Water（https://www.ebi.ac.uk/Tools/emboss/）分析GhDHN1 和AtCOR47的DNA序列、CDS、內(nèi)含子以及其編碼蛋白質(zhì)的一致性和相似性，參數(shù)設(shè)置為：空位罰分（Gap_penalty）為 10、延伸罰分（Extend_penalty）為 0.5。

1.2.6脫水素GhDHN1、AtCOR47內(nèi)含子比較。利用DNAMAN 6.0軟件計算GhDHN1和AtCOR47基因的DNA序列和內(nèi)含子中AT含量。

1.2.7GhDHN1和AtCOR47的啟動子中順式作用元件分析。利用植物順式作用元件數(shù)據(jù)庫P1antCARE在線啟動子預(yù)測工具（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/） 預(yù) 測GhDHN1和的AtCOR47啟動子和內(nèi)含子中的順式調(diào)控元件。

2 結(jié)果與分析

2.1 GhDHN1和AtCOR47基因染色體定位以及基因結(jié)構(gòu)分析

染色體定位結(jié)果表明，GhDHN1位于陸地棉D(zhuǎn)亞組第9號染色體，DNA序列為726 bp?；蚪Y(jié)構(gòu)分析表明，GhDHN1的DNA序列含有1個長度為90 bp的內(nèi)含子，2個外顯子長度分別為258 bp和378 bp；AtCOR47位于擬南芥1號染色體上，DNA序列為943 bp，含有1個145 bp的內(nèi)含子，2個外顯子長度分別為339 bp和459 bp（表1）。

表1 GhDHN1和AtCOR47基因的分子特征

圖1顯示，AtCOR47的DNA序列長于GhDHN1的DNA序列，內(nèi)含子和外顯子均長于GhDHN1的外顯子長度；這兩個基因的第2個外顯子均長于第1個外顯子。GhDHN1定位于細(xì)胞膜附近[5]，AtCOR47定位于細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞膜和細(xì)胞核中。

圖1 GhDHN1和AtCOR47基因的內(nèi)含子-外顯子結(jié)構(gòu)分析

2.2 GhDHN1和AtCOR47蛋白性質(zhì)及同源性比較

由表2可以看出，GhDHN1和AtCOR47蛋白均為酸性，帶負(fù)電荷，屬于親水性蛋白質(zhì)。AtCOR47的酸性強(qiáng)于GhDHN1，親水性也略高于GhDHN1。

利用在線分析工具EMBOSS Water分析兩基因以相關(guān)序列的同源性，結(jié)果表明，GhDHN1和AtCOR47的DNA序列、CDS、蛋白質(zhì)序列和內(nèi)含子序列的一致性分別為 53.80%、56.80%、45.2%、42.7%（表 3）。

2.3 GhDHN1和AtCOR47基因所編碼的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域分析

GhDHN1與AtCOR47基因所編碼的蛋白質(zhì)均屬于SKn型脫水素，但不同的是GhDHN1的N段含有 1個S片段，C段含有2個K片段[9]，而 At-COR47的N段含有1個S片段，C段含有3個K片段[4]，比GhDHN1蛋白多了1個K片段。

2.4 GhDHN1和AtCOR47基因內(nèi)含子比較

利用 DNANMAN 6.0軟件，GhDHN1基因DNA序列中AT堿基含量占52.62%，內(nèi)含子序列中AT堿基含量占63.33%；而AtCOR47 DNA序列中AT堿基含量占54.61%，內(nèi)含子序列中AT堿基含量占75.86%。2個基因的外顯子和內(nèi)含子的剪接方式類似，均符合GT-AG規(guī)則。內(nèi)含子均位于編碼S片段的核苷酸之間。

表2 GhDHN1和AtCOR47蛋白質(zhì)性質(zhì)比較

2.5 GhDHN1和AtCOR47基因啟動子中順式作用元件比較

GhDHN1和AtCOR47基因的啟動子中均含有參與非生物逆境脅迫響應(yīng)的順式作用元件包括：無氧誘導(dǎo)必需順式作用調(diào)控元件、高溫脅迫響應(yīng)順式作用元件、低溫響應(yīng)順式作元件、參與干旱誘導(dǎo)的MYB結(jié)合位點(diǎn)，說明兩個基因在響應(yīng)非生物逆境脅迫功能上極為相似，但AtCOR47基因中無參與保衛(wèi)與脅迫響應(yīng)順式作用元件 （TC-rich repeats），推測GhDHN1擁有AtCOR47不具有的獨(dú)特抗逆功能。GhDHN1和AtCOR47基因的啟動子中均參與激素響應(yīng)的順式作用元件包括：脫落酸響應(yīng)元件、赤霉素響應(yīng)元件、赤霉素響應(yīng)元件、水楊酸響應(yīng)元件，而AtCOR47基因的啟動子中含有2個GhDHN1啟動子中沒有的乙烯響應(yīng)元件。

3 討論與結(jié)論

脫水素的結(jié)構(gòu)是其行使功能的前提條件。K片段是脫水素的特征結(jié)構(gòu)域[11]，K片段富含賴氨酸，其所形成的雙親性螺旋與部分變性蛋白的疏水位點(diǎn)相結(jié)合，起到類似于分子伴侶的作用[12]。Reyes等[13]研究表明，K片段是脫水素起冷凍保護(hù)作用的基本結(jié)構(gòu)。Lin等[14]研究表明COR47作為低溫保護(hù)劑可能幫助植物忍受與冷凍相關(guān)的脫水逆境；Puhakainen等[15]轉(zhuǎn)基因試驗(yàn)表明，在擬南芥中過表達(dá)AtCOR47等脫水素基因時，低溫脅迫后在轉(zhuǎn)基因體內(nèi)積累了大量的脫水素，與對照相比，轉(zhuǎn)基因植株在受到冷凍時 （－10℃）表現(xiàn)出較低的LT50值（Lethal temperature of 50%，半致死溫度）和較高的存活率。同時證明了AtCOR47提高植株的抗凍性部分原因是由于AtCOR47對細(xì)胞膜所起的保護(hù)作用。而GhDHN1基因在僅響應(yīng)4℃度低溫脅迫[5]，這也許與AtCOR47蛋白比GhDHN1多1個K片段有關(guān)，今后的工作重點(diǎn)可適當(dāng)集中到對K片段功能的研究上。

許多脫水素響應(yīng)激素脫落酸的刺激，因此被稱為 RAB 蛋白（Responsive to ABA）[16]。 Welin 等[4]研究表明，AtCOR47響應(yīng)低溫脅迫的同時響應(yīng)脫落酸 （ABA）和干旱脅迫，因此屬于RAB蛋白。GhDHN1和AtCOR47的啟動子中均含有脫落酸響應(yīng)元件和參與干旱誘導(dǎo)的MYB結(jié)合位點(diǎn)元件，所以推測，GhDHN1也可能屬于RAB蛋白，同時響應(yīng)ABA脅迫和干旱脅迫，該結(jié)論需進(jìn)一步的試驗(yàn)驗(yàn)證。

[1]Bray E A.Molecular responses to water deficit[J].Plant Physiology,1993,103(4):1035-1040.

[2]Ingram J,Bartels D.The molecular basis of dehydration tolerance in plants[J].Annual Review of Plant Physiology and Plant molecular Biology,1996,47:377-403.

[3]Gilmour S J,Artus N N,Thomashow M F.cDNA sequence analysis and expression of two cold-regulated genes ofArabidopsis thaliana[J].Plant Molecular Biology,1992,18(1):13-21.

[4]Welin B V,Olson A,Palva E T.Structure and organization of two closely related low-temperature-induceddhn/lea/rab-like genes inArabidopsis thalianaL.Heynh[J].Plant Molecular Biology,1995,29(2):391-395.

[5]王俊娟,穆敏,王帥,等.棉花脫水素GhDHN1的克隆及其表達(dá)[J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué),2016,49(15):2867-2878.

[6]張森,李輝,顧志剛.功能基因組學(xué)研究的有力工具——比較基因組學(xué)[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,2005,36(5):664-668.

[7]Li Fuguang,Fan Guangyi,Lu Cairui,et al.……（王俊娟，等）陸地棉脫水素基因GhDHN1與擬南芥AtCOR47基因的比較Genome sequence of cultivated upland cotton(Gossypium hirsutumTM-1)provides insights into genome evolution[J].Nature Biotechnology,2015,33(5):524-530.

[8]冉昆，王少敏.Windows 7平臺下BLAST本地化構(gòu)建[J].落葉果樹，2015，47(3)：39-42.

[9]王俊娟,陰祖軍,王德龍,等.陸地棉脫水素蛋白GhDHN1的結(jié)構(gòu)特征和無序性分析[J].中國棉花,2017,44(8):17-19.

[10]Hu Bo,Jin Jinpu,Guo Aayuan,et al.GSDS 2.0:An upgraded gene feature visualization server[J].Bioinformatics(Oxford,England),2015,31(8):1296.

[11]Close T J.Dehydrins:Emergence of a biochemical role of a family of plant dehydration proteins[J].Physiologia Plantarum,1996,97(4):795-803.

[12]Kovacs D,Kalmar E,Torok Z,et al.Chaperone activity of ERD10 and ERD14,two disordered stress-related plant proteins[J].Plant Physiology,2008,147(1):381-390.

[13]Reyes J L,Campos F,Wei H,et al.Functional dissection of hydrophilins duringin vitrofreeze protection[J].Plant Cell Environment,2008,31(12):1781-1790.

[14]Lin Chentao,Guo Weiwen,Everson E,et al.Cold acclimation inArabidopsisand wheat:A response associated with expression of related genes encoding'boiling-stable'polypeptides[J].Plant Physiology,1990,94(3):1078-83.

[15]Puhakainen T,Hess M W,Ma¨kela¨P,et al.Overexpression of multiple dehydrin genes enhances tolerance to freezing stress inArabidopsis[J].Plant Molecular Biology,2004,54(5):743-753.

[16]Moez Hanin,Brini F,Ebel C,et al.Plant dehydrins and stress tolerance[J].Plant Signaling&Behavior,2011,6(10):1503-1509.●