光動(dòng)力療法對(duì)致齲大鼠模型牙髓組織的影響

馬瑩瑩，鄒朝暉，彭林紅

齲齒是在以細(xì)菌為主的多種因素影響下，牙體硬組織發(fā)生慢性進(jìn)行性破壞的感染性疾病［1］。它對(duì)牙體組織的破壞以及引起的并發(fā)癥嚴(yán)重影響著人們的口腔健康和生活質(zhì)量。目前氟化物、免疫和中草藥是常用的防齲方法，其中氟化物防齲是目前普遍公認(rèn)的防齲方法，但氟化物的使用安全性和耐氟菌株的產(chǎn)生，都為齲病預(yù)防提出了新的課題。免疫防齲安全性差，價(jià)格昂貴，不能在短期內(nèi)應(yīng)用；中草藥成分復(fù)雜，藥理作用多樣，對(duì)齲病的預(yù)防是多因素綜合作用的結(jié)果而不容易控制，因此尋找新的更為有效的防齲方法一直是學(xué)者們研究的熱點(diǎn)。光動(dòng)力療法（photondynamic therapy，PDT）是一種新型治療方法，能有效地殺傷細(xì)菌和病毒，在感染性疾病中有很好的應(yīng)用前景［2－5］。 研究表明PDT對(duì)不論是在浮游狀態(tài)［6，7］、菌斑刮除物［8］，還是生物膜狀態(tài)下［9－12］的口腔致病菌，都具有很好的殺滅作用，且具有不耐藥、可重復(fù)等許多優(yōu)點(diǎn)。

光動(dòng)力療法被越來越多地應(yīng)用于臨床治療，但其對(duì)齲病的研究?jī)H處于體外致齲模型階段，尚未用于齲病的臨床治療，其使用的參數(shù)安全范圍及對(duì)周圍組織的影響仍是值得研究和探討的。在光動(dòng)力的三要素中（光，光敏劑和氧），光照功率是最重要的可控參量之一，通過選擇光照功率可以調(diào)控PDT的殺傷強(qiáng)度和范圍，在確保PDT療效的同時(shí)又能避免或減輕對(duì)周圍組織的損傷?；谀壳皟H見到光動(dòng)力療法對(duì)大鼠口腔黏膜的研究報(bào)道，對(duì)大鼠致齲模型牙髓組織的研究報(bào)道甚少，該研究通過建立大鼠齲齒模型，探討不同光照功率對(duì)牙髓組織的影響，為光動(dòng)力療法用于齲病預(yù)防的安全性提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要材料和儀器 變異鏈球菌NCTC 10449（首都醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院）；胰蛋白胨大豆肉湯液體培養(yǎng)基（Trypticase Soy Broth，TSB）、胰蛋白胨大豆肉湯固體培養(yǎng)基 （Trypticase Soy Agar，TSA）（北京陸橋公司）；Wistar雄性大白鼠 （北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部）；HMME （上海復(fù)旦張江生物公司）；532nm半導(dǎo)體激光器（中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物醫(yī)學(xué)工程研究所）；厭氧培養(yǎng)箱；超凈工作臺(tái)（蘇州凈化）；光學(xué)顯微鏡（OLYMPUS，日本）

1.2 方 法

1.2.1 變異鏈球菌菌懸液的制備 將變異鏈球菌NCTC 10449，37℃厭氧培養(yǎng)48 h后，取一接種環(huán)（D=1 mm）的細(xì)菌劃線接種于TSA固體培養(yǎng)基，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱厭氧培養(yǎng)48 h。涂片檢查，確定為純培養(yǎng)后，挑取單個(gè)典型菌落接種于TSB液體培養(yǎng)基，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱厭氧培養(yǎng)24 h，調(diào)整菌液濃度為 1×108CFU/ml，待用。

1.2.2 大鼠致齲模型的建立和分組處理 將70只均于出生后21 d斷奶的同窩別、同鼠齡Wistar大鼠于22～24 d鼠齡期間喂以抗生素飲用水 （含有青霉素和鏈霉素），于25～27 d鼠齡期間，連續(xù)3 d（1次/d）給幼鼠口腔內(nèi)接種變異鏈球菌（100μl菌液/次），并喂以致齲飼料 2000#［13］（6%全麥粉、56%蔗糖、3%脫水蔬菜粉、28%精煉奶粉、2%食用鹽、1%脫水全肝粉和4%酵母）和菌懸液飲用水，28 d隨機(jī)抽取大鼠，檢測(cè)口腔內(nèi)細(xì)菌是否定植成功（＞108CFU/ml為定植成功）。（查閱到的文獻(xiàn)中所述建模方法及檢測(cè)建模是否成功也僅是通過檢測(cè)口腔細(xì)菌的定植是否成功，尚未見到其他更有效的檢測(cè)方法）

建模成功后將大鼠隨機(jī)分為以下7組，每組10只，根據(jù)前期預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果篩選出合適的光照參數(shù)和光敏劑參數(shù)：A 組：17 mW HMME－PDT組；B組：34 mW HMME－PDT 組；C 組：68 mW HMME－PDT組；D組：?jiǎn)渭児饷魟┙M；E組：34 mW單純激光照射組；F組：2 g/L氟化鈉陽性對(duì)照組；G組：9 g/L生理鹽水陰性對(duì)照組。于29 d將麻醉后的大鼠取仰臥位，按分組情況進(jìn)行處理。光敏劑HMME用量為40μg/ml，孵育時(shí)間為5 min，532 nm的半導(dǎo)體激光距離牙齒表面1 mm垂直照射A、B、C、E組牙齒，照射時(shí)間均為 90 s；D、F、G 組分別采用 HMME、2 g/L氟化鈉溶液、9 g/L生理鹽水溶液涂搽大鼠磨牙各面，處理1次/周，連續(xù)4周。

1.2.3 觀察指標(biāo) 56 d處死大鼠，拔除牙齒后，分組保存在10%中性甲醛溶液中，使用復(fù)合酸脫鈣2 W后，進(jìn)行石蠟包埋，制備厚約5μm的連續(xù)切片，常規(guī)HE染色，中性樹脂封固，然后在光學(xué)顯微鏡下對(duì)牙髓組織進(jìn)行觀察，主要包括出血和炎癥程度兩方面，采用雙盲法對(duì)組織學(xué)的改變進(jìn)行評(píng)分［14］，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)如表1所示。由于實(shí)驗(yàn)條件所限，尚未有針對(duì)牙髓組織的量化評(píng)估指標(biāo)，在以后的實(shí)驗(yàn)中會(huì)彌補(bǔ)這一不足。

表1 牙髓組織炎癥或出血程度指標(biāo)

1.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差 （x±s）表示，應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件，采用秩和檢驗(yàn)分析各組差異，檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α=0.05。

2 結(jié)果

正常牙髓組織無毛細(xì)血管擴(kuò)張、炎癥或出血（圖1a）；D組、F組牙髓組織與G組相比無明顯變化（圖 1b、c）；A 組、B 組激光照射后，牙髓組織均有輕度的毛細(xì)血管擴(kuò)張、充血（圖 1e、f）；C 組、E 組牙髓組織均有大量毛細(xì)血管擴(kuò)張、充血，但并未見炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)（圖 1g、d）。

不同實(shí)驗(yàn)組處理后的牙髓組織計(jì)分結(jié)果見表2，與G組相比，A組、B組牙髓組織計(jì)分沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）；C、E 組計(jì)分高，有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05），但兩組之間計(jì)分沒有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。隨著PDT功率的增加，牙髓組織炎癥或出血程度計(jì)分有所增加。

圖1 不同處理的各組牙髓組織圖

表2 各組大鼠牙髓組織的炎癥或出血程度計(jì)分結(jié)果

3 討論

齲病是一種內(nèi)源性感染性疾病，主要致齲菌是變異鏈球菌，它能產(chǎn)生有機(jī)酸，使牙體無機(jī)物酸蝕脫礦，有機(jī)物壞死崩解，最終形成齲齒［15］。變異鏈球菌等多數(shù)致齲菌是 G+，研究表明［16］PDT 對(duì) G+的殺傷效果要強(qiáng)于G－，因此PDT可能通過有效抑制致齲菌的生長(zhǎng)而達(dá)到防齲的目的。

PDT是一門新技術(shù)，由多個(gè)學(xué)科（如光物理學(xué)、光化學(xué)和醫(yī)學(xué)等）相互交叉滲透而形成，具有光敏劑、光源和氧三個(gè)要素。簡(jiǎn)單來說其反應(yīng)過程是受一定波長(zhǎng)激發(fā)的光敏劑在吸收特定能量的光子后從基態(tài)躍遷到激發(fā)態(tài)，處于激發(fā)態(tài)的光敏劑極不穩(wěn)定，再?gòu)募ぐl(fā)態(tài)躍遷到基態(tài)過程中所引發(fā)的一系列物理和化學(xué)反應(yīng)。反應(yīng)機(jī)制有以下兩種：Ⅰ型：處于激發(fā)態(tài)的光敏劑分子與周圍生物分子發(fā)生氧化還原反應(yīng)，形成活性氧分子自由基（ROS），或者氧化還原氧分子、水分子形成超氧陰離子、過氧化氫等中介自由基直接殺傷微生物，即自由基的氧化還原反應(yīng)。Ⅱ型：處于激發(fā)態(tài)的光敏劑分子與氧分子發(fā)生氧化還原反應(yīng)，生成單線態(tài)氧1O2等有毒物質(zhì)，單線態(tài)氧具有細(xì)胞毒性，能夠破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)導(dǎo)致微生物死亡［17－19］，兩種機(jī)制共同存在，相互競(jìng)爭(zhēng)，Ⅱ型機(jī)制因產(chǎn)生更多的具有細(xì)胞毒性的單態(tài)氧成為光動(dòng)力的主要機(jī)制［20］。

多項(xiàng)研究結(jié)果表明［21－23］PDT 可有效抑制定植在人工菌斑生物膜中的變異鏈球菌等細(xì)菌的生長(zhǎng)和生物膜的形成，有助于減緩齲齒的發(fā)生發(fā)展。孫繼軍等［24－26］研究顯示 PDT抑制大鼠齲齒的效果甚至優(yōu)于氟化鈉，這與本實(shí)驗(yàn)前期結(jié)果相似［23，25］，但 PDT的作用效應(yīng)與光功率密切相關(guān)，而光功率的變化是否會(huì)對(duì)牙髓組織造成影響是值得研究和探討的。

牙髓組織位于牙髓腔內(nèi)，其血管密集分布，具有豐富的血運(yùn)系統(tǒng)，周圍被具有不可讓性的牙體組織包繞，其體積變化范圍容許量很小。當(dāng)激光照射牙體組織時(shí)，產(chǎn)生的光熱作用會(huì)使牙體溫度升高，若熱量傳導(dǎo)到牙體內(nèi)部，使牙髓組織溫度升高，就會(huì)造成牙髓血流增加和血管擴(kuò)張，從而造成組織壓升高，導(dǎo)致血流減慢和形成血栓，甚至發(fā)生壞死［27］。有研究認(rèn)為［28］，牙髓溫度升高超過5.6℃時(shí)，就會(huì)引起牙髓組織的損傷，這個(gè)值被認(rèn)為牙髓溫升的安全極限。Zach等［29］研究發(fā)現(xiàn)牙髓溫度升高超過5.6℃時(shí)，會(huì)有15%的牙髓喪失活力；達(dá)到8.3℃時(shí)，約有20%的牙髓喪失活力；達(dá)到11.1℃時(shí)，有60%的牙髓喪失活力；達(dá)到16.6℃時(shí)，則所有牙髓均喪失活力。有研究者［30］在Nd：YAG 激光對(duì)口腔組織熱效應(yīng)的研究中發(fā)現(xiàn)，功率的增加會(huì)造成牙髓溫度的升高。丁星月等［31］在532 nm摻釹釔鋁石榴石皮秒激光照射離體牙對(duì)髓腔溫度的影響研究中發(fā)現(xiàn)，在一定時(shí)間下，髓腔溫度隨著功率增加而升高。在該實(shí)驗(yàn)結(jié)果中，牙髓組織的反應(yīng)也隨著PDT組功率的增加而加重，推測(cè)與髓腔溫度升高有關(guān)。與生理鹽水對(duì)照組牙髓記分相比，除了單純激光照射組和68 mW HMME－PDT組外，其余各組均沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），但這兩組間無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。 在照射時(shí)間相同時(shí)，68 mW HMME－PDT組的牙髓組織病理與其余HMME－PDT組相比，已有大量的毛細(xì)血管擴(kuò)張、充血，牙髓組織記分也已呈現(xiàn)明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。在功率同為34 mW，照射時(shí)間均為90 s的條件下，單純激光組的牙髓記分明顯高于 HMME－PDT 組（P＜0.05），出現(xiàn)這一結(jié)果的原因可能與HMME－PDT組照射時(shí)產(chǎn)生的熱量少，牙髓組織升溫較少有關(guān)；當(dāng)照射時(shí)間相同，功率增大到68 mW時(shí)，其產(chǎn)生的熱量仍能造成牙髓溫升高，出現(xiàn)血管擴(kuò)張和充血（表2）。孫繼軍等［24］在對(duì)大鼠齲齒模型光動(dòng)力的實(shí)驗(yàn)中未發(fā)現(xiàn)牙周組織的損傷，該實(shí)驗(yàn)中大功率的激光照射會(huì)造成牙髓組織的損傷，張蕾等［25］研究也證實(shí)在功率不變的實(shí)驗(yàn)條件下，照射時(shí)間延長(zhǎng)，能量密度增加也會(huì)損傷大鼠口腔黏膜，造成這一差異的原因是否與光敏劑、光劑量、實(shí)驗(yàn)方式等有關(guān)還有待于進(jìn)一步研究證實(shí)。

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