黃志軍，王遙，崔國英，高藝璇，王飛，李長忠( 山東省立醫(yī)院，濟南25002；2 鄒城市人民醫(yī)院)

近年來宮頸癌的發(fā)病率逐年升高并呈年輕化趨勢。人乳頭瘤病毒(HPV)感染，特別是高危型HPV持續(xù)感染是宮頸癌最重要的致病因素，但其并不是惟一因素。約40%處于性活躍期女性至少感染過一種類型HPV，但僅有不到1%的女性因機體免疫系統(tǒng)無法清除HPV最終發(fā)展為宮頸癌。近年研究發(fā)現(xiàn)，機體免疫系統(tǒng)可能在其發(fā)生、發(fā)展過程中具有重要作用[1～5]。人類白細胞抗原(HLA)是人類主要組織相容性復合體(MHC)的編碼基因，包括經(jīng)典的HLA-Ⅰ類分子與非經(jīng)典的HLA-Ⅰ類分子。HLA是機體免疫系統(tǒng)的重要組成部分，在機體抗原呈遞和免疫應答中發(fā)揮重要作用。有研究表明，HLA完全缺失、等位基因丟失或基因特異性下調等對腫瘤的發(fā)生、發(fā)展至關重要[6]。HLA-F屬于非經(jīng)典的HLA-Ⅰ類分子，在乳腺癌、T細胞淋巴瘤等多種腫瘤組織中異常表達[8]。但鮮見其在宮頸癌組織表達的報道。本研究觀察了宮頸癌組織HLA-F表達變化，并分析其與患者臨床病理參數(shù)的關系，探討HLA-F在宮頸癌發(fā)生、發(fā)展中的作用。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2012年1月～2016年6月山東省立醫(yī)院收治的宮頸癌患者115例。納入標準：①宮頸癌診斷符合《婦產(chǎn)科學》(第7版)中的診斷標準，并經(jīng)術后組織病理檢查明確為宮頸鱗癌或腺癌；②采用廣泛性子宮切除+盆腔淋巴結清掃術治療；③初次治療，術前未行任何抗腫瘤治療；④無其他原發(fā)惡性腫瘤史或自身免疫性疾?。虎菖R床病理資料完整。排除標準：①合并嚴重的心、肝、腎等重要臟器疾病，以及自身免疫性疾病或其他部位惡性腫瘤者；②臨床病理資料不完整者；③術前接受過任何抗腫瘤治療者?；颊吣挲g23～75(44.53±7.65)歲，其中≤45歲 62例、>45歲 53例；組織學類型：鱗癌87例，腺癌28例；組織分化程度：高中分化29例，低未分化86例；臨床分期(參照國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟2009年分期標準)：Ⅰ期76例，Ⅱ期39例；腫瘤直徑：≥4 cm 46例，<4 cm 69例；浸潤深度：≤1/2肌層45例，>1/2肌層70例；有淋巴結轉移30例，無淋巴結轉移85例。本研究通過山東省立醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準，患者或其家屬均知情同意。

1.2 宮頸癌組織及其配對的癌旁正常組織HLA-F表達檢測 采用免疫組化法。取手術切除的宮頸癌組織115例份及其配對的癌旁正常組織20例份，多聚甲醛固定，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，5 μm厚連續(xù)切片。將切片置于烤片機上65 ℃烘烤90 min，依次經(jīng)二甲苯脫蠟、梯度乙醇水化，蒸餾水沖洗5 min×3次，PBS浸泡5 min；然后置于檸檬酸鹽修復液中，采用高壓煮沸法進行抗原修復，自然冷卻至室溫；PBS洗滌5 min×3次，37 ℃ 3% H2O2孵育30 min，滅活內源性過氧物酶；PBS洗滌5 min×3次，滴加兔抗人HLA-F單克隆抗體(1：200)，4 ℃冰箱孵育過夜；次日37 ℃孵育30 min，PBS洗滌5 min×3次，滴加聚合酶輔助劑，37 ℃孵育30 min；PBS洗滌5 min×3次，滴加辣根過氧化物酶標記抗兔IgG聚合物，37 ℃孵育30 min；PBS洗滌5 min×3次，DAB顯色，蘇木素復染，鹽酸乙醇分化，自來水充分沖洗返藍，梯度乙醇脫水，自然晾干，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察。以PBS代替一抗作為陰性對照，以HLA-F蛋白陽性表達的脾臟組織作為陽性對照。由兩位有經(jīng)驗的病理科醫(yī)師采用雙盲法獨立閱片，結果不一致時協(xié)商解決。HLA-F陽性染色定位于細胞膜或細胞質，呈棕黃色顆粒狀。應用Leica IM50圖像采集系統(tǒng)，每張切片隨機選取4個200倍視野，采用H-score評分法[9]半定量分析HLA-F表達。H-score評分=∑Pi(I+1)，其中Pi表示染色強度不同的陽性細胞數(shù)量占該視野所有細胞總數(shù)的百分比，范圍為0～100%；I表示染色強度，分為4個評分等級：不著色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。計算每張組織切片所取4個視野的H-score評分，其平均值為該切片最終的H-score評分。以H-score評分表示宮頸組織HLA-F表達。H-score評分越高，說明宮頸組織HLA-F表達越高。

1.3 宮頸癌組織HLA-F蛋白表達與患者臨床病理參數(shù)關系的分析 比較不同年齡、組織學類型、組織分化程度等臨床病理參數(shù)的宮頸癌患者H-score評分。

2 結果

2.1 宮頸癌組織與癌旁正常組織HLA-F表達比較 宮頸癌組織HLA-F表達為(2.17±0.83)分，癌旁正常組織為(1.13±0.15)分，二者比較P<0.01。

2.2 宮頸癌組織HLA-F蛋白表達與患者臨床病理參數(shù)的關系 宮頸癌組織HLA-F表達與患者組織學類型、腫瘤直徑以及浸潤深度有關(P均<0.05)，與患者年齡、組織分化程度、臨床分期及淋巴結轉移情況無關(P均>0.05)。見表1。

3 討論

臨床研究發(fā)現(xiàn)，宮頸癌患者通常存在免疫系統(tǒng)功能低下，機體抗腫瘤免疫監(jiān)控失靈可能在其發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。在機體抗腫瘤免疫中占據(jù)主導地位的是細胞免疫，在細胞免疫中參與免疫監(jiān)視的主要效應細胞有樹突狀細胞、吞噬細胞、自然殺傷細胞和T淋巴細胞。研究發(fā)現(xiàn)，宮頸癌前病變和宮頸癌病灶中樹突狀細胞數(shù)量明顯減少、自然殺傷細胞表面的激活性受體表達降低以及輔助性T細胞亞群失衡等[10～12]。提示機體免疫系統(tǒng)功能低下可能與宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展有關。

表1 宮頸癌組織HLA-F表達與患者臨床病理參數(shù)的關系(分，

HLA-F屬于非經(jīng)典的HLA-Ⅰ類分子，其編碼基因位于人類6號染色體短臂上，基因全長5.4 kb，由8個外顯子和7個內含子組成。由于成熟HLA-F mRNA缺乏外顯子7，其編碼的HLA-F蛋白質尾區(qū)短于其他HLA-Ⅰ類分子[13]。Geraghty等[13]最早在B淋巴細胞、靜止的T細胞和皮膚癌組織內檢測到HLA-F的轉錄產(chǎn)物。Lee等[14]研究發(fā)現(xiàn)，盡管在膀胱、皮膚、肝臟等組織細胞內檢測到HLA-F表達，但在正常機體中，大多數(shù)這類細胞的表面無HLA-F表達。用EB病毒轉染的B細胞和單核細胞表面均可檢測到HLA-F表達，即靜止期的免疫細胞表面缺乏HLA-F表達；而一旦機體免疫細胞被激活，所有胞內表達HLA-F的細胞均能在細胞表面表達[15]。由此推測，HLA-F可作為機體免疫激活的標志物之一。

研究發(fā)現(xiàn)，HLA-F的同源性分子HLA-E、HLA-G可參與腫瘤的免疫逃逸[8，16]。但HLA-F參與腫瘤免疫逃逸的相關研究較少。Harada等[17]研究發(fā)現(xiàn)，乳腺癌組織HLA-F陽性表達與腫瘤大小有關，但與患者生存率無關。Ishigami等[18]研究發(fā)現(xiàn)，胃腺癌組織HLA-F陽性表達與腫瘤浸潤深度、淋巴結轉移、淋巴管和血管侵犯有關。Zhang等[19]研究發(fā)現(xiàn)，胃癌組織HLA-F陽性表達與患者年齡、性別、腫瘤浸潤深度以及腫瘤TNM分期均無關。Xu等[20]研究發(fā)現(xiàn)，肝癌組織HLA-F陽性表達率明顯高于正常肝臟組織，且其表達變化與門靜脈癌栓、腫瘤數(shù)目及患者性別等有關。以上研究表明，HLA-F在腫瘤中的表達具有組織差異性，在不同腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中可能發(fā)揮著不同作用。

Lepin等[21]研究發(fā)現(xiàn)，HLA-F四聚體可與免疫抑制性受體ILT-2、ILT-4結合，而淋巴細胞、單核細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞等表面均表達ILTs，故HLA-F與ILTs結合可能抑制這些免疫細胞，從而在免疫反應的不同時期產(chǎn)生免疫耐受作用。Goodrige等[22]研究發(fā)現(xiàn)，HLA-F分子與HLA-Ⅰ類分子的開放構象可作為配體與自然殺傷細胞及T細胞表面的KIR3DL2結合；而在炎癥反應微環(huán)境中，KIR3DL2、HLA-F與HLA-Ⅰ表達均上調，提示三者在炎癥反應中可能具有免疫調節(jié)作用。HLA-F在腫瘤免疫耐受機制中的作用至今尚不清楚，其在宮頸癌致病機制中的作用亦鮮見報道。

本研究結果顯示，宮頸癌組織HLA-F表達明顯高于癌旁正常組織，與Xu等[20]的研究結果基本一致。本研究結果還發(fā)現(xiàn)，HLA-F表達與宮頸癌組織學類型、浸潤深度、腫瘤直徑有關，而與患者年齡、組織分化程度及淋巴結轉移無關，與Harada等[17]報道基本一致。上述結果表明，HLA-F與宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展有關。

綜上所述，宮頸癌組織HLA-F表達升高，其表達變化與宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展有關。HLA-F可能通過誘導機體免疫耐受，從而在腫瘤免疫逃逸中發(fā)揮重要作用，但其具體機制尚需進一步研究。

參考文獻：

[1] Mehta AM, Jordanova ES, Kenter GG, et al. Association of antigen processing machinery and HLA class I defects with clinicopathological outcome in cervical carcinoma[J]. Cancer Immunol Immunother, 2008,57(2):197-206.

[2] 薄艷秋.宮頸癌患者外周血T淋巴細胞及NK細胞檢測的臨床意義[J].中國繼續(xù)醫(yī)學教育，2017，24(9)：50-52.

[3] 楊晶，田威，戚旻.宮頸病變患者HPV感染與淋巴細胞亞群相關細胞因子的關系[J].中國婦幼保健，2017，32(19)：4827-4830.

[4] 余花艷，任統(tǒng)偉.人乳頭瘤病毒感染宮頸疾病患者外周血中MDSC、Treg、Th17細胞變化研究[J].中華微生物學和免疫學雜志，2017，37(8)：586-593.

[5] Reiman JM, Kmieciak M, Manjili MH, et al. Tumor immunoediting and immunosculpting pathways to cancer progression[J]. Semin Cancer Biol, 2007,17(4):275-287.

[6] Smyth MJ, Dunn GP, Schreiber RD. Cancer immunosurveillance and immunoediting: the roles of immunity in suppressing tumor development and shaping tumor immunogenicity[J]. Adv Immunol, 2006(90):1-50.

[7] 徐丹萍，林愛芬，顏衛(wèi)華.HLA-F研究進展[J].生命科學，2012，24(6)：578-82.

[8] Wainwright SD, Biro PA, Holmes CH. HLA-F is a predominantly empty, intracellular TAP-associated MHC class Ib protein with a restricted expression pattern[J]. J Immunol, 2000,164(1):319-328.

[9] 王遙，崔國英，王飛，等.人類白細胞抗原-E在宮頸癌中的表達及意義[J].山東大學學報(醫(yī)學版)，2016，54(9)：59-63.

[10] Khaiboullina SF， Morzunov SP， Hall MR， et al. Human dendritic cells transfected with a human papilloma virus-18 construct display decreased mobility and upregulated cytokine production [J]. Int J Oncol， 2013，43(5)：1701-1709.

[11] Iijima N, Goodwin EC, Dimaio D, et al. High-risk human papillomavirus E6 inhibits monocyte differentiation to Langerhans cells[J]. Virology, 2013,444(1-2):257-262.

[12] Garcia-Iglesias T, Del Toro-Arreola A, Albarran-Somoza B, et al. Low NKp30, NKp46 and NKG2D expression and reduced cytotoxic activity on NK cells in cervical cancer and precursor lesions[J]. BMC Cancer, 2009(9):186.

[13] Geraghty DE, Wei XH, Orr HT, et al. Human leukocyte antigen F(HLA-F). An expressed HLA gene composed of a class Icoding sequence linked to a novel transcribed repetitive element[J]. J Exp Med, 1990,171(1):1-18.

[14] Lee N, Geraghty DE. HLA-F surface expression on B cell and monocyte cell lines is partially independent from tapasin and completely independent from TAP[J]. J Immunol, 2003,171(10):5264-5271.

[15] Lee N, Ishitani A, Geraghty DE. HLA-F is a surface marker on activated lymphocytes[J]. Eur J Immunol, 2010,40(8):2308-2318.

[16] Rodgers JR, Cook RG. MHC class Ib molecules bridge innate and acquired immunity[J]. Nat Rev Immunol, 2005,5(6):459-471.

[17] Harada A, Ishigami S, Kijima Y, et al. Clinical implication of human leukocyte antigen (HLA)-F expression in breast cancer[J]. Pathol Int, 2015,65(11):569-574.

[18] Ishigami S, Arigami T, Setoyama T, et al. Clinical-pathological implication of human leukocyte antigen-F-positive gastric adenocarcinoma[J]. J Surg Res, 2013,184(2):802-806.

[19] Zhang JG, Zhang X, Lin A, et al. Lesion HLA-F expression is irrelevant to prognosis for patients with gastric cancer[J]. Hum Immunol, 2013,74(7):828-832.

[20] Xu Y, Han H, Zhang F, et al. Lesion human leukocyte antigen-F expression is associated with a poor prognosis in patients with hepatocellular carcinoma[J]. Oncol Lett, 2015,9(1):300-304.

[21] Lepin EJ, Bastin JM, Allan DS, et al. Functional characterization of HLA-F and binding of HLA-F tetramers to ILT2 and ILT4 receptors[J]. Eur J Immunol, 2000,30(12):3552-3561.

[22] Goodridge JP, Burian A, Lee N, et al. HLA-F and MHC class I open conformers are ligands for NK cell Ig-like receptors[J]. J Immunol, 2013,191(7):3553-3562.