羅宇東 譚安薔 陸施衡 吳玉強(qiáng) 張強(qiáng)

[摘要]目的 建立壯藥材藤苦參中強(qiáng)心苷的含量測定方法，研究不同產(chǎn)地、采收季節(jié)對藥材含量的影響。方法 利用甲型強(qiáng)心苷α，β-不飽和內(nèi)酯環(huán)的顯色反應(yīng)，采用紫外分光光度法建立藤苦參中強(qiáng)心苷含量測定的方法，并進(jìn)行方法學(xué)考察，測定不同產(chǎn)地、采收季節(jié)的藤苦參藥材中強(qiáng)心苷含量。結(jié)果 按紫外分光光度法，以地高辛為對照品，堿性苦味酸溶液為顯色劑，415 nm的波長下檢測，在0～0.08 mg/ml范圍內(nèi)對照品含量與吸光度呈良好的線性關(guān)系；回歸方程為y=14.968x+0.008（r=0.9969）；精密度RSD=0.1%；平均加樣回收率為95.51%，RSD為2.16%（n=6）。測定6批藤苦參中強(qiáng)心苷平均含量，為2.07 mg/g。測定廣西四個不同產(chǎn)地及不同采收季節(jié)藤苦參強(qiáng)心苷含量，結(jié)果產(chǎn)于欽州八塞溝、并于10～12月采收的藤苦參中強(qiáng)心苷含量最高。結(jié)論 所建立的藤苦參強(qiáng)心苷的含量測定方法，穩(wěn)定性和重復(fù)性高，回收試驗良好，可作為藤苦參藥材的質(zhì)量控制方法使用。不同產(chǎn)地及不同采收季節(jié)對藤苦參強(qiáng)心苷含量有顯著影響。

[關(guān)鍵詞]藤苦參；強(qiáng)心苷；紫外分光光度法；產(chǎn)地；采收季節(jié)

[中圖分類號] R927.2 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1674-4721（2018）4（c）-0014-04

Determination of the content of cardiac glycoside in Zhuang herb Streptocaulon griffithii and its influencing factors of different producing areas and harvesting seasons

LUO Yu-dong1，2，3 TAN An-qiang1▲ LU Shi-heng1 WU Yu-qiang1，3 ZHANG Qiang1

1.Pharmaceutical Factory，Guangxi University of Chinese Medicine，Nanning 530023，China；2.Key Laboratory of Zhuang Medical Formulae and Applied Research of Colleges and Universities in Guangxi Zhuang Autonomous Region，Nanning 530001，China；3.Key Laboratory of Common Technology Research and Development of Traditional Chinese Medicine Preparation of Colleges and Universities in Guangxi Zhuang Autonomous Region，Nanning 530001，China

[Abstract]Objective To establish a method for the determination of cardiac glycoside in Zhuang herb Streptocaulon griffithii，and to study the influence of different producing areas and harvesting seasons on the content of medicinal herb.Methods The colorimetric reaction of α，β-unsaturated lactone ring of type A cardiac glycosides was used to establish the method for the determination of the content of cardiac glycoside in Streptocaulon griffithii by ultraviolet spectrophotometry （UV spectrophotometry）.The methodology was also verified.The content of cardiac glycoside in Zhuang herb Streptocaulon griffithii from different producing areas and harvesting seasons was determined.Results By UV spectrophotometry，Digoxin was used as reference substance，and alkaline picric acid solution was used as chromogenic agent.The good linear relation of the content of reference substance and absorbance was displayed in the range of 0-0.08 mg/ml in 415 nm wavelength.The regression equation y=14.968x+0.008 （r=0.9969）.The precision of RSD was 0.1% and average recovery was 95.51% （n=6；RSD=2.16%）.The average content of cardiac glycosides from 6 batches of Streptocaulon griffithii was 2.07 mg/g.The cardiac glycosides of Streptocaulon griffithii from four different producing areas and seasons in the Guangxi Zhuang Autonomous Region were determined.The highest content of cardiac glycoside of Streptocaulon griffithii was from Basaigou，Qinzhou City and was collected from October to December yearly.Conclusion The established method for the determination of cardiac glycosides of Streptocaulon griffithii has high stability and repeatability in good recovery，and can be used as quality control for Streptocaulon griffithii.Different producing areas and harvesting seasons have significant impact on the content of cardiac glycosides of Streptocaulon griffithii.

[Key words]Streptocaulon griffithii；Cardiac glycosides；Ultraviolet spectrophotometry；Producing area；Harvesting season

壯藥藤苦參（Streptocaulon griffithii Hook.f.）為蘿摩科（Asclepiadaceace）植物馬蓮鞍的干燥根，分布于廣西、云南、印度、越南、緬甸、老撾、柬埔寨和馬來西亞等地，別名古羊藤、老鴉咀、毛青才、南苦參、奶藤、馬達(dá)、紅馬連鞍、虎陰藤、老鴉嘴，其木質(zhì)根被用于治療感冒發(fā)熱、腸炎、痢疾、胃痛、跌打腫痛、毒蛇咬傷等癥。藤苦參屬廣西特色、大宗、壯瑤藥材，為部頒標(biāo)準(zhǔn)民族醫(yī)藥產(chǎn)品及知名壯成藥外感風(fēng)痧顆粒（片）的主方藥，是傣藥經(jīng)方雅叫哈頓散中的主治藥之一。張琳等[6]報道從藤苦參根乙醇提取物中分離出19個化合物，其中9個為三萜皂苷元，8個為強(qiáng)心苷類成分，還有其他成分。這19個化合物為：α-香樹脂醇乙酸酯、羽扇豆醇乙酸酯、11-乙氧基-3-乙?；?12-烏蘇烯-3-醇、11-酮-α-香樹脂醇乙酸酯、α-香樹脂醇、羽扇豆醇、24-亞甲基環(huán)木波羅烷醇、環(huán)木菠羅-23-烯-3β，25-二醇、β-古甾醇、杠柳苷元洋地黃毒糖苷、藤苦參毒苷元、環(huán)木波羅烷-3，24，25-三醇、煙酸、洋地黃毒苷元、16-O-乙酰基羥基洋地黃毒苷元、杠柳苷元、16-O-乙?；u基杠柳苷元、杠柳苷元葡萄糖苷、藤苦參毒苷A。欒連軍等[1-8]的研究提示，藤苦參素（16-O-acetglgitoxgenin）在體外可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，具有較好的抗腫瘤活性。藤苦參素屬于強(qiáng)心苷類化合物，因此，本研究建立測量藤苦參中強(qiáng)心苷的含量方法，并對比廣西不同產(chǎn)地及采收季節(jié)的藤苦參中的強(qiáng)心苷含量，以期為藤苦參的規(guī)范化種植及質(zhì)量控制提供理論依據(jù)。

1儀器與試劑

1.1儀器

分析天平（ME104E）、725型紫外可見分光光度計（上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司），HH-S4數(shù)顯恒溫水浴鍋（金壇市醫(yī)療儀器廠），超聲清洗儀（上海冠特超聲儀器有限公司SG250HE型）。

1.2試劑及樣品

含量測定方法研究所用藤苦參樣品購買于南寧市景昌中藥飲片有限公司，生產(chǎn)批號為20160401。地高辛對照品購買于中國藥品生物制品檢定所，生產(chǎn)批號為100015～200709。所用試劑均為分析純。

廣西不同產(chǎn)地及采收季節(jié)的藤苦參樣品為實地采挖，凈制，切段，干燥，經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學(xué)制藥廠質(zhì)量保證部鑒定，符合《廣西壯族自治區(qū)壯藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)匯編》（第1卷）藤苦參標(biāo)準(zhǔn)[10]，為蘿藦科植物馬連鞍Streptocaulon juventas （Lour.） Merr.的干燥根

2實驗方法與結(jié)果[11-18]

2.1藤苦參強(qiáng)心苷含量測定方法研究

2.1.1對照品溶液的制備

精密稱取地高辛對照品10 mg，置于25 ml容量瓶中用60%乙醇溶解后定容至刻度制成標(biāo)準(zhǔn)溶液。

2.1.2供試品溶液的制備

精密稱取藤苦參粗粉2 g，置于100 ml錐形瓶，加入70%乙醇40 ml，超聲提取2次，每次40 min，提取后補(bǔ)重，過濾合并濾液，揮干溶劑，加入60%乙醇溶解，定容至50 ml，再從50 ml容量瓶中取5 ml樣品溶液，放入25 ml容量瓶中，稀釋至刻度即得供試品溶液。

2.1.3測定波長的選擇

分別精密量取上述對照品溶液、供試品溶液1 ml置于具塞試管中，加入堿性苦味酸溶液（A液：2%苦味酸溶液，B液：15%NaOH，使用前按A∶B=90∶10混合）4 ml，搖勻，室溫下放置20 min，以不加樣品溶液同法操作下的堿性苦味酸溶液為空白，進(jìn)行光譜掃描，結(jié)果見圖1，提示最大吸收波長為415 nm，故選擇測定波長為415 nm。

1.供試品溶液 2.對照品溶液

圖1 對照品及供試品UV光譜圖

2.1.4方法學(xué)考查

2.1.4.1線性關(guān)系 用移液管移取標(biāo)準(zhǔn)液0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 ml，分別置于具塞試管中，加入60%乙醇稀釋至1 ml，分別加入堿性苦味酸溶液（A液：2%苦味酸溶液，B液：15%NaOH，使用前按A∶B=90∶10混合）4 ml，搖勻，室溫放置20 min，在波長415 nm測吸光度。以吸光度A縱坐標(biāo)，濃度C為橫坐標(biāo)，作標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果得回歸方程y=14.968x+0.008，r=0.9969，標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖2。

圖2 標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

2.1.4.2精密度實驗 精密量取對照品溶液0.5 ml，稀釋至1 ml，加入堿性苦味酸溶液（A液：2%苦味酸溶液，B液：15%NaOH，使用前按A∶B=90∶10混合）4 ml，搖勻，顯色20 min，在波長415 nm，重復(fù)測定6次A值，結(jié)果見表1，吸光度的RSD為0.1%，提示儀器精密度良好。

表1 精密度試驗結(jié)果

2.1.4.3穩(wěn)定性實驗 精密量取樣品溶液1 ml，加入堿性苦味酸溶液（A液：2%苦味酸溶液，B液：15%NaOH，使用前按A∶B=90∶10混合）4 ml，搖勻，顯色20 min，在波長415 nm，每隔10 min測定一次吸光度。吸光度的RSD為3.29%，提示顯色后室溫放置20～40 min內(nèi)，其吸光度較穩(wěn)定，結(jié)果見表2。

表2 穩(wěn)定性試驗結(jié)果

2.1.4.4重復(fù)性實驗 精密量取6份樣品溶液1 ml，加入堿性苦味酸溶液（A液：2%苦味酸溶液，B液：15%NaOH，使用前按A∶B=90∶10混合）4 ml，搖勻，放置20 min，在波長415 nm下測定吸光度。結(jié)果吸光度的RSD為2.4%（表3），提示此方法的重復(fù)性良好。

表3 重復(fù)性試驗結(jié)果

2.1.4.5加樣回收實驗 精密量取已知含量的藤苦參樣品5份，分別加入一定量的地高辛對照品，加入堿性苦味酸溶液（A液：2%苦味酸溶液，B液：15%NaOH，使用前按A∶B=90∶10混合）4 ml，搖勻，放置20 min，在波長415 nm測吸光度，計算回收率，平均回收率為95.51%，RSD為2.16%（表4）。

表4 加樣回收實驗結(jié)果

2.1.4.6含量的測定 用移液管精密移取樣品溶液1.0 ml，置于具塞試管中，加入堿性苦味酸溶液（A液：2%苦味酸溶液，B液：15%NaOH，使用前按A∶B=90∶10混合）4 ml，搖勻，室溫下放置20 min，在波長415 nm測吸光度，計算強(qiáng)心苷的含量，結(jié)果見表5。

表5 6批樣品強(qiáng)心苷含量分析

2.2廣西4個不同地區(qū)及采收季節(jié)的藤苦參中強(qiáng)心苷含量測定

分別在廣西4個藤苦參主產(chǎn)區(qū)、不同采收季節(jié)（月份）實地采挖藤苦參藥材，凈制，切段，干燥后，按“2.1”含量測定方法測定藤苦參中強(qiáng)心苷的含量，每個產(chǎn)地每個采收季節(jié)測定3個樣品，計算平均含量，結(jié)果見表6。

表6 不同產(chǎn)地、采收季節(jié)藤苦參中強(qiáng)心苷含量測定

3討論

強(qiáng)心苷是生物界中存在的一類對心臟具有強(qiáng)心作用等顯著生理活性的甾體苷類，主要分布于夾竹桃科、玄參科、百合科、蘿藦科、十字花科、毛茛科、衛(wèi)矛科、桑科等植物中。強(qiáng)心苷一般可溶于水、醇、丙酮等極性溶劑，微溶于乙酸乙酯、含醇氯仿，幾乎不溶于乙醚、苯、石油醚等極性小的溶劑[19]。經(jīng)過預(yù)實驗發(fā)現(xiàn)，藤苦參醇提比水效果好，醇提中用70%～80%乙醇作溶劑，提取效果最好。在提取方法上筆者考察了回流提取和超聲提取，結(jié)果兩方法提取的檢測結(jié)果相差不大，在強(qiáng)心苷的含量檢測上以地高辛為對照品，采用堿性苦味酸試劑（Baljet反應(yīng)）于甲型強(qiáng)心苷α，β-不飽和內(nèi)酯環(huán)的顯色反應(yīng)對強(qiáng)心苷成分含量進(jìn)行測定。

不同產(chǎn)地、不同采收季節(jié)藤苦參中強(qiáng)心苷的含量測定結(jié)果顯示，廣西4個主產(chǎn)地南寧、欽州、百色、上思的藤苦參強(qiáng)心苷的含量區(qū)別較大，其中欽州八塞溝的藤苦參強(qiáng)心苷的含量最高。通過比較采收時間，發(fā)現(xiàn)10～12月采收的藤苦參強(qiáng)心苷的含量普遍高于其他采收時間，而1～3月采收的藤苦參強(qiáng)心苷的含量最低。以上結(jié)果提示藤苦參的品質(zhì)受產(chǎn)地、采收季節(jié)的影響，進(jìn)行藥材的規(guī)范化種植時，可考慮選擇強(qiáng)心苷含量較高產(chǎn)地的種質(zhì)資源進(jìn)行栽培，采收藥材時充分考慮采收時間對藥材質(zhì)量的影響。另外，藤苦參根、莖、葉中強(qiáng)心苷含量的比較以及強(qiáng)心苷含量隨植物生產(chǎn)年限的富集規(guī)律，施肥對藤苦參有效成分的影響等研究工作還有待進(jìn)一步的加強(qiáng)。

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（收稿日期：2017-09-07 本文編輯：祁海文）